牛副流感病毒3型檢測方法研究進展

莊金秋，梅建國，張 穎，莫 玲，劉吉山

（濱州市畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

牛副流感病毒3型檢測方法研究進展

莊金秋，梅建國，張 穎，莫 玲，劉吉山

（濱州市畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

牛呼吸道疾病綜合征是引起世界范圍內(nèi)飼養(yǎng)牛發(fā)病和死亡的主要原因，嚴重危害著養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。本文介紹了牛副流感病毒3型的病原學檢測方法，包括病毒分離與鑒定、分子生物學檢測方法和血凝試驗，以及血清學檢測方法，包括血凝抑制試驗、免疫熒光試驗、中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附實驗和液相芯片技術(shù)等。通過綜述近年來牛副流感病毒3型的最新實驗室檢測方法研究進展，為該病檢測和診斷提供參考。

牛副流感病毒3型；牛呼吸道疾病綜合征；檢測；研究進展

牛呼吸道疾病綜合征（Bovine respiratory disease complex，BRDC）是引起世界范圍內(nèi)飼養(yǎng)牛發(fā)病和死亡的主要原因，嚴重危害著世界養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3）、牛呼吸道合胞體病毒（Bovine respiratory syncytial virus，BRSV）、牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）以及牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）是BRDC的主要病原。BPIV3通常被稱為“運輸熱”病毒，屬于副黏病毒科呼吸道病毒屬。BPIV3感染主要引起成年牛和犢牛的肺炎、支氣管肺炎和被感染肺葉的實變。臨床上主要表現(xiàn)為發(fā)熱、流淚、流鼻涕和呼吸加快等癥狀。BPIV3最早分離于美國，目前在牛群中的感染已呈世界性分布。BPIV3有3個基因型，分別為A型、B型和C型，我國的分離株主要為A型和C型。BPIV3本身致病力不強，但在其他繼發(fā)性細菌（多殺性巴氏桿菌或溶血性巴氏桿菌）及外界誘因（長途運輸、饑餓、受寒等）的聯(lián)合作用下，則可引發(fā)嚴重的呼吸道癥狀，甚至可引起病牛的死亡。目前我國對BPIV3的研究處于起步階段，尚沒有特效藥物和疫苗?？刂艬PIV3的傳播對預防BRDC具有重要意義。本文綜述了近年來BPIV3的最新實驗室檢測方法研究進展，以期為預防和控制該病提供參考。

1 病原學檢測方法

1.1 病毒分離與鑒定

病原學檢測最常用的方法為病毒的分離與鑒定。采集病牛的鼻拭子擦拭液或病變組織，經(jīng)處理后接種牛腎傳代細胞（MDBK）培養(yǎng)。BPIV3在細胞上通常會產(chǎn)生典型的細胞病變（CPE），如細胞融合和蝕斑等。有一些毒株不會產(chǎn)生明顯的CPE，可以使用紅細胞吸附試驗來確認是否有病毒存在，常用的有牛紅細胞和豚鼠紅細胞，但有些毒株要在體外適應一段時間后才能出現(xiàn)紅細胞吸附現(xiàn)象。電鏡觀察，BPIV3有囊膜，小在150～250 nm之間。劉鵬[1]利用MDBK細胞從黑龍江省某牛場病牛鼻液中分離到1株可產(chǎn)生特定的CPE，經(jīng)過理化特性和核酸序列測定分析后確定為A型BPIV3。呂闖等[2]在山東省首次分離到基因C型的BPIV3。

1.2 分子生物學檢測方法

1.2.1 RT-PCR。Vaucher等[3]根據(jù)BPIV3的HN基因的保守區(qū)域設計引物，建立了RT-PCR方法，在所有的檢測樣品中都能夠檢測到大小為1 009 bp的目的條帶。劉鵬[1]根據(jù)BPIV3 HN基因序列設計引物，建立了RT-PCR方法。劉曉樂等[4]針對BPIV3 NP蛋白和BVDV E2基因分別設計了2對引物，建立了快速鑒別BPIV3和BVDV的雙重RT-PCR方法，BPIV3的敏感度可達10-3TCID50/0.1 mL。Thonur等[5]針對IBRV的糖蛋白B基因、BRSV核衣殼基因、BPIV3的核蛋白基因設計的多重反轉(zhuǎn)錄定量PCR（mRT-qPCR），通過對臨床541份樣品檢測與傳統(tǒng)的病毒分離和間接免疫熒光抗體試驗技術(shù)比較，證明了該方法更快速，特異性高，并且比病毒分離和間接免疫熒光抗體技術(shù)更加敏感。索陽等[6]選擇BVDV的5′UTR序列附近保守核苷酸序列、BRSV的F基因的保守區(qū)及BPIV3高度保守性NP蛋白基因設計引物，建立了可用于檢測上述3種病毒的三重RT-PCR方法。該法能檢出10 pg的BVDV、1 pg的BPIV3和10 pg的BRSV。倪宏斌等[7]從新疆石河子、奎屯、庫爾勒、沙灣、阿克蘇地區(qū)的5個規(guī)?；膛霾杉?月齡以內(nèi)犢牛鼻液206份，其中發(fā)病犢牛180份，相同日齡健康犢牛46份，通過采用雙抗體夾心ELISA的方法檢測BPIV3抗原，RT-PCR方法檢測BPIV3 M基因，并挑選不同地區(qū)的8株病毒進行序列分析比較其同源性，進行基因分型。結(jié)果ELISA方法檢測的感染率僅為2.43%，PCR方法檢測的感染率為35.44%；擴增的M基因序列同源性為97.90%，與參考的BPIV3 A亞型毒株的同源性為96.40%～99.60%，將其劃分為BPIV3 A亞型。

1.2.2 熒光定量RT-PCR。董秀梅等[8]基于BPIV3 M基因設計引物及探針，建立了Taq Man實時熒光定量RT-PCR檢測方法，用于快速定量檢測BPIV3。

1.2.3 RT-LAMP。師新川等[9]依據(jù)BPIV3 NP基因設計了4條引物，建立了RT-LAMP方法，整個反應過程只需1 h，檢測最低限達0.069 fg/μL，為普通RT-PCR靈敏度的1 000倍。在反應體系中添加熒光染料后，可通過肉眼直接判斷有無擴增產(chǎn)物，而不需要凝膠電泳，在基層的快速檢測中具有較好的應用前景。

1.3 血凝試驗（HA）

副黏病毒為主要的紅細胞凝集性病毒。BPIV3可以凝集雞、豚鼠和人的“O”型紅細胞，根據(jù)這一特性可以鑒定BPIV3。HA試驗具有成本低、操作方便，能在短時間內(nèi)獲得結(jié)果等優(yōu)點，是該病毒常用的檢測方法，但BPIV3在保存和運輸過程中存在很大的變異性，試驗往往會導致假陰性，出現(xiàn)誤判。

2 血清學檢測方法

2.1 血凝抑制試驗（HI）

由于牛血清具有非特異性的血凝抑制活性，在進行HI試驗前應進行預處理，以消除非特異性反應。BPIV3感染程度較輕的牛不出現(xiàn)臨床癥狀，但HI效價一般可達1:40；感染后出現(xiàn)臨床癥狀的牛血清的HI效價則可達1:640甚至更高。在檢測時最好有急性期和康復期的雙份血清的結(jié)果，這樣才有說服力。

2.2 免疫熒光試驗

王海勇[10]初步建立了檢測BPIV3的直接免疫熒光方法。該法具有良好的敏感性和特異性，檢測到BPIV3的最小劑量為10 TCID50/mL，為BPIV3抗原的檢測提供了重要的手段。

2.3 中和試驗

中和試驗是經(jīng)典的鑒定BPIV3的血清學檢測方法?；糁驹频萚11]從內(nèi)蒙古、吉林、山西3個省采集牛血清樣品482份，采用病毒中和試驗方法進行BPIV3抗體檢測；結(jié)果482份血清中BPIV3陽性共439份，陽性率為91.08%，表明這3個省份的牛群中普遍存在BPIV3感染。王海勇等[12]從黑龍江、遼寧、新疆、云南、貴州、廣西、河北、山東、河南、江西、湖南和福建等12個省份采集牛血清樣品2 489份，進行中和試驗，結(jié)果顯示，除江西省陽性率為27.8%之外，其他省份陽性率均高于50%；2 489份血清樣品中陽性樣品數(shù)為1 932份，總體陽性率為77.6%。表明BPIV3在我國流行比較廣泛。中試試驗準確性高，但操作復雜、試驗周期長，限制了其在臨床上快速診斷方面的應用。

2.4 ELISA

吳海濤[13]和史鴻飛[14]分別用原核表達的BPIV3 HN蛋白和N蛋白作為包被抗原初步建立了檢測BPIV3抗體的間接ELISA方法。劉鵬[1]利用純化后的重組N蛋白作為包被抗原，建立了間接ELISA方法并對黑龍江省部分地區(qū)的603份牛血清樣本進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BPIV3的抗體陽性率為78.44%。周玉龍等[15]以原核表達的BPIV3 HJ-1株重組HN蛋白為包被抗原建立間接ELISA方法，與中和試驗符合率高達96%。呂闖[16]用碳酸鹽緩沖液（CBS）將BPIV3粗分離病毒液作200倍稀釋包被ELISA板，以制備的BPIV3核衣殼蛋白的5E5單抗為待阻斷抗體建立了固相阻斷ELISA（SPB-ELISA）。應用該法對231份免疫牛血清及54份來自哈爾濱市周邊地區(qū)牛血清進行抗體檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫牛血清中的陽性樣品數(shù)為220份，陽性率為95.2%；哈爾濱市周邊地區(qū)牛血清中陽性血清樣品數(shù)為34份，陽性率為62.9%。任建樂[17]成功制備了7株針對NP蛋白的單克隆抗體并應用2個不同抗原表位的單抗6F8和7G9建立了雙抗體夾心ELISA（DAS-ELISA）方法。李麗陽等[18]以純化的兔抗BPIV3多克隆抗體（PAb）作為包被抗體，鼠抗BPIV3單克隆抗體（MAb）作為檢測抗體，建立了BPIV3雙抗體夾心ELISA方法。利用該方法和RT-PCR對75份牛鼻拭子臨床樣品進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者符合率為94.6%。楊建樂等[19]通過分析NP和HN蛋白主要抗原表位區(qū)并對其串聯(lián)后原核表達，以純化的重組蛋白為包被抗原建立了間接ELISA方法，對采自山東、遼寧和天津等地的270份臨床血清樣本檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)總的陽性率為82.59%（223/270）。因此，ELISA方法適用于獸醫(yī)基層臨床樣品的大規(guī)模檢測。

2.5 液相芯片技術(shù)

Anderson等[20]用美國Luminex公司研制的液相芯片技術(shù)設計了多重檢測牛血清抗體技術(shù)，可以在1個血清樣本中同時檢測病原（BVDV、IBRV、BPIV3、BRSV）相應的抗體，并與ELISA相比較，其敏感度、特異性基本一致，實現(xiàn)了一個液相反應體系下檢測多種病原抗體，該技術(shù)最高可同時檢測100種病原，在傳染病診斷技術(shù)方面有很好的應用前景。

3 小結(jié)

目前我國牛群中已經(jīng)普遍存在BPIV3的感染，嚴重危害著養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展。由于本病尚無特效治療藥物和方法，且隨著我國養(yǎng)牛業(yè)的集約化發(fā)展，不少牛舍養(yǎng)殖密度大、空氣質(zhì)量差，這些因素的存在為該病的傳播和流行提供了條件。本文所述的檢測方法各有優(yōu)缺點，在實際應用中可以根據(jù)具體情況及對檢測結(jié)果的要求，選擇合適的檢測方法，也可以將多種方法結(jié)合使用。隨著檢測方法的不斷改進以及新技術(shù)的不斷創(chuàng)新，BPIV3的檢測方法也將日趨發(fā)展完善，相信研制更加靈敏、特異、方便、適用于基層的檢測技術(shù)指日可待，這對預防牛呼吸道疾病意義重大。

參考文獻：

[1] 劉鵬. 牛副流感病毒3型的分離鑒定和間接ELISA方法建立及初步應用[D]. 大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學，2010.

[2] 呂闖，朱遠茂，董秀梅，等. 牛副流感病毒3型NP單抗的制備及初步應用[J]. 中國預防獸醫(yī)學報，2011，33（12）：970-973.

[3] VAUCHER R D，SIMONETTI A B，ROEHE P M. RT-PCR for detection of bovine parainfluenza virus type 3（BPIV-3）[J]. Acta scientiae veterinariae，2008，36（3）：215-220.

[4] 劉曉樂，張敏敏，陳穎鈺，等. 牛副流感病毒3型RTPCR檢測方法的建立[J]. 中國奶牛，2011，22：1-4.

[5] THONUR L，MALEY M，GILRAY J，et al. Onestep multiplex real time RT-PCR for the detection of bovine respiratory syncytial virus，bovine herpesvirus 1 and bovine parainfluenza virus 3[J]. BMC veterinary research，2012（8）：37-45.

[6] 索陽，陳繼勇. 牛病毒性腹瀉病毒、牛呼吸道合胞體病毒和牛副流感病毒3型三重RT-PCR檢測方法的建立及應用[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2013，45（6）：10-13.

[7] 倪宏斌，剡根強，張坤，等. 新疆部分地區(qū)牛副流感病毒3型的檢測與基因分型[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2016，48（12）：72-75.

[8] 董秀梅，朱遠茂，蔡虹，等. 牛副流感病毒3型TaqMan實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及應用[J]. 中國獸醫(yī)科學，2014，44（6）：617-623.

[9] 師新川，溫永俊，王鳳雪，等. 牛副流感病毒3型RTLAMP檢測方法的建立及應用[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（11）：31-34.

[10] 王海勇. 牛副流感病毒3型血清學調(diào)查及其單克隆抗體的制備與應用[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2014.

[11] 霍志云，童欽，胡嘉欣，等. 北方三?。▍^(qū)）牛副流感病毒3型的血清學調(diào)查[J]. 動物醫(yī)學進展，2012，33（9）：124-126.

[12] 王海勇，童欽，王煒，等. 我國牛副流感病毒3型血清學調(diào)查[J]. 中國預防獸醫(yī)學報，2014，36（2）：154-156.

[13] 吳海濤. 牛副流感病毒3型的分離鑒定和間接ELISA方法建立及初步應用[D]. 大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學，2010.

[14] 史鴻飛. 牛副流感病毒3型山東分離株核衣殼蛋白表達鑒定、多抗制備及應用[D]. 北京，中國農(nóng)業(yè)科學院，2010. [15] 周玉龍，任亞超，朱戰(zhàn)波，等. 牛副流感病毒3型HN基因原核表達及間接ELISA方法建立[J]. 病毒學報，2012，28（1）：23-28.

[16] 呂闖. 牛副流感病毒3型NP單抗制備及固相阻斷ELISA的建立和應用[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2012.

[17] 任建樂. 牛副流感病毒3型NP蛋白單抗制備及其抗原表位鑒定與雙抗夾心ELISA建立[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2015.

[18] 李麗陽，李艷婷，余麗蕓，等. 牛副流感病毒3型雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立[J]. 中國預防獸醫(yī)學報，2016，38（2）：132-136.

[19] 楊建樂，趙貴民，侯佩莉，等. 牛副流感病毒3型抗體間接ELISA檢測方法的建立與初步應用[J]. 動物醫(yī)學進展，2016，37（11）：19-24.

[20] ANDERSON S，WAKELEY P，WIBBERLEY G，et al. Development and evaluation of a Luminex multiplex serology assay to detect antibodies to bovine herpes virus 1，parainfluenza 3 virus，bovine viral diarrhoea virus，and bovine respiratory syncytial virus，with comparison to existing ELISAdetection methods[J]. Journal of immunological methods，2011，366（1/2）：79-88.

（責任編輯：杜憲）

Research Progress on the Detection Methods of Bovine Parainfuenza Virus Type 3

Zhuang Jinqiu，Mei Jianguo，Zhang Ying，Mo Ling，Liu Jishan
（Binzhou Animal Science and Veterinary Medicine Academy，Binzhou，Shandong 256600）

Bovine respiratory disease complex is the main cause of the morbidity and mortality of feeding cattle in the world，endangering the development of cattle industry in the world. Bovine parainfluenza virus type 3 is one of the major facts of bovine respiratory disease complex. The methods for the detection of Bovine parainfluenza virus type 3 were introduced，including isolation and identification of viruses，molecular biological methods and hemagglutination tests. Serological detection methods，including hemagglutination inhibition test，immunofluorescence test，neutralization test，ELISA and liquid chip technique，were introduced. the latest laboratory detection methods of bovine parainfluenza virus type 3 in recent years were reviewed in this article，so as to provide reference for detection and diagnosis of the disease.

Bovine parainfluenza virus type 3；Bovine respiratory disease complex；detection；research progress

S851.34

B

1005-944X（2017）09-0067-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.09.019

山東省重點研發(fā)計劃項目（2015GSF121027）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系牛產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-09-12）