發(fā)芽糙米乳中雙株復合乳酸菌的發(fā)酵特性研究

朱力杰,方怡元,陳妍婕,劉秀英,王 勃,劉 賀,何余堂,馬 濤

(渤海大學食品科學與工程學院,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013)

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發(fā)芽糙米乳中雙株復合乳酸菌的發(fā)酵特性研究

朱力杰,方怡元,陳妍婕,劉秀英,王 勃,劉 賀,何余堂,馬 濤*

(渤海大學食品科學與工程學院,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013)

以發(fā)芽糙米為基質,將植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、干酪乳桿菌(L.casei)4種乳酸菌經(jīng)兩兩組合后,對發(fā)芽糙米乳進行發(fā)酵。通過對酸度、活菌數(shù)、脫水收縮作用敏感性、蛋白分解力、流變學性質等指標的測定來進行發(fā)酵特性評價,最終篩選出適合發(fā)酵發(fā)芽糙米乳的最佳菌株組合。實驗結果表明:各組合在發(fā)芽糙米乳中的發(fā)酵特性不盡相同,其中嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌對各自組合貯藏過程中酸度的變化起主導作用,每組產品的活菌數(shù)均達8 lg cfu/mL以上,發(fā)酵特性的組間差異較為明顯。綜合考慮鼠李糖乳桿菌和干酪乳桿菌以1∶1的體積比組合所得產品品質較好,該發(fā)酵乳在4 ℃貯藏21 d后酸化程度較弱,pH下降了0.65個單位;乳清析出較少,7 d以后低于20%;活菌數(shù)變化小且冷藏期間數(shù)量一直高于8.5 lg cfu/mL,游離氨基酸增加0.08 mmol/L,流變學性質顯示其黏稠度較高,相對易于儲運。

乳酸菌,混合發(fā)酵,發(fā)芽糙米乳,特性

發(fā)芽糙米是以去掉外殼的稻谷米粒為原料,經(jīng)適當?shù)慕菖c發(fā)芽過程后,得到芽長在0.5～1 mm左右[1],由幼芽、糠層和胚乳組成的糙米制品[2]。在發(fā)芽過程中,糙米既有物質含量發(fā)生改變,同時又產生了新的營養(yǎng)成分,其中γ-氨基丁酸、賴氨酸、維生素E、維生素B、膳食纖維、鎂及煙酸等的含量增加較多[3-4],而糖類和熱量較糙米、精白米均有所減少[5]。發(fā)芽改變了稻谷種子中部分營養(yǎng)物質的結合狀態(tài),使維生素、礦物質、有機酸等組分更容易消化和吸收[6-8]。研究表明,常食發(fā)芽糙米有利于預防頭痛、結腸癌、心臟病,緩解便秘、調節(jié)血糖水平等[9]?；诖?食品從業(yè)者以發(fā)芽糙米為基質,研發(fā)了發(fā)芽糙米黑豆復合飲料、發(fā)芽糙米面包、速食發(fā)芽糙米等多種新型糙米食品[10-12]。

為豐富發(fā)芽糙米食品的品種,本研究以發(fā)芽糙米為基質,利用乳酸菌的發(fā)酵作用制作發(fā)芽糙米發(fā)酵乳,發(fā)芽糙米乳綜合了谷物與乳酸菌的優(yōu)點,是一種蛋白質和膳食纖維含量豐富、高活菌數(shù)的發(fā)酵乳品。產品既保留了糙米中的主要營養(yǎng)物質,又改進了適口性和風味。前期實驗中已獲得了不同乳酸菌在全谷物糙米乳中的發(fā)酵特性,但單一菌種的使用往往不能實現(xiàn)穩(wěn)定的產品品質并同時兼顧良好的風味和口感。因此本研究從實際生產應用的角度出發(fā),將不同種類的乳酸菌菌株進行兩兩組合,通過探究雙株復合乳酸菌在發(fā)芽糙米乳中的發(fā)酵特性,篩選出性能優(yōu)良、適合推廣應用的菌株組合。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌(L.plantarum,Lp)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus,Lr)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus,La)和干酪乳桿菌(L.casei,Lc) 由四川高福記生物科技有限公司提供;發(fā)芽糙米粉、中溫α-淀粉酶(酶活為3000 u/g)、大豆分離蛋白、蔗糖 由本溪寨香生態(tài)農業(yè)有限公司提供;液體、固體MRS培養(yǎng)基 分別用于菌種活化和活菌計數(shù);所采用化學試劑 均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司。

雷磁PHS-3C酸度計 上海雷磁儀器廠;UV-2550紫外可見分光光度計 杭州英斯特科技有限公司;SIS60-70均質機 上海申鹿均質機有限公司;Czone5F抑菌圈測量及菌落計數(shù)儀 杭州訊數(shù)科技有限公司;DHR-1流變儀 美國TA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的活化與母發(fā)酵劑的制備 將4株乳酸菌的菌粉按0.1%的質量體積比分別接種于三角瓶MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h,再以3%體積比接種于試管MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h,經(jīng)過2次活化,活菌數(shù)達到9 lg cfu/mL以上。按3%總接種量以1∶1的體積比將2種不同的菌株接種于三角瓶無菌發(fā)芽糙米乳中,37 ℃恒溫培養(yǎng)5 h,凝乳后即為母發(fā)酵劑,放入4 ℃冰箱中備用。發(fā)芽糙米乳按技術路線中涉及方法進行制備。

1.2.2 技術路線 發(fā)芽糙米粉→中溫α-淀粉酶酶解(0.05%質量比,65 ℃,40 min)→煮沸(100 ℃,10 min,終止酶解)→過濾(200目濾布)→添加大豆分離蛋白→均質(20 MPa,10 min)→蔗糖調配(質量體積比70 g/L)→滅菌(90 ℃,10 min)→冷卻室溫→接種母發(fā)酵劑(5%體積比)→發(fā)酵(37 ℃,24 h)→冷藏后熟(4 ℃,12 h)→成品發(fā)芽糙米乳。

在發(fā)酵乳制成后的第0、1、7、14、21 d取樣檢測相關各項指標。

1.2.3 pH測定 4 ℃條件下冷藏的樣品置于室溫,待恢復到室溫用玻璃棒攪拌均勻。PHS-3C酸度計直接測定,測3次取平均值。

1.2.4 滴定酸度 參照GB5413.34-2010所列方法,簡述如下:稱取10 g(精確到0.001 g)攪拌均勻的發(fā)酵糙米乳于150 mL錐形瓶中,加入20 mL新煮沸冷卻至室溫的蒸餾水和2 mL 0.5%酚酞乙醇指示液于試樣中,混合均勻后用0.1 mol/L氫氧化鈉標準溶液滴定至微紅色,并在30 s內不褪色。記錄NaOH標準溶液消耗的體積,通過計算得滴定酸度(吉爾涅爾度°T)。

式中:X為試樣的酸度(°T);C為氫氧化鈉標準溶液的摩爾濃度(mol/L);V為滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液體積(mL);m為試樣的質量(g);0.1為酸度理論定義氫氧化鈉的摩爾濃度(mol/L)。在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示,結果保留三位有效數(shù)字。

1.2.5 活菌數(shù) 將發(fā)酵乳用無菌生理鹽水梯度稀釋,選擇3個合適梯度(10-3、10-4和10-5),采用MRS瓊脂培養(yǎng)基平板傾注法37 ℃培養(yǎng)48 h進行活菌計數(shù),測3次取平均值[13]。

1.2.6 脫水收縮作用敏感性 稱量20 g發(fā)酵乳樣品,置于帶有濾紙的漏斗中,4 ℃放置2 h,收集濾液并稱重。測3次取平均值[14],隨后計算脫水收縮作用敏感性(susceptibility to syneresis,STS)。脫水收縮作用敏感性(%)=濾液重量/樣品重量×100。

1.2.7 蛋白分解力 蛋白分解力的測定采用鄰苯二甲醛比色法[15-16],在340 nm波長下測定樣品吸光度,確定蛋白分解力,測3次取平均值。

1.2.8 流變學性質分析 先將發(fā)酵乳攪拌均勻,選用直徑40 mm的不銹鋼平板探頭,平板與底面的間隙為0.5 mm,測試溫度控制在25 ℃。剪切速率從0.01 s-1增大到150 s-1,在150 s-1保持120 s,然后從150 s-1減小至0.01 s-1。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件和OriginPro 8.6軟件進行數(shù)據(jù)分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 pH測定

圖1 發(fā)酵乳pH變化Fig.1 Changes of pH of fermented milk by co-culture

發(fā)酵乳從發(fā)酵結束到4 ℃貯藏21 d pH變化如圖1所示。6組發(fā)酵乳的pH都隨著冷藏時間的延長而下降(p<0.05)。其中同時含有La的LpLa和LrLa組合的兩條曲線基本重合,而同時含有Lc的LrLc和LaLc組合也如此,可能在各組合中La和Lc分別對pH降低起主導作用。前期單菌株實驗發(fā)現(xiàn),La耐酸性較強,pH下降較多,而Lc后酸化能力較弱,因而LpLa和LrLa兩組pH變化大,至21 d時下降到3.7;而LrLc和LaLc兩組是pH變化最小的復合菌株。但是LpLc也含有Lc,其pH變化卻是6組復合菌株中最大的,可能是因為這兩種乳酸菌之間存在協(xié)同共生作用;也可能與Lp具有較強的淀粉水解能力有關[17]。烏仁圖雅[18]以后酸化能力強的保加利亞乳桿菌發(fā)酵牛乳,貯藏21 d pH從4.5下降到3.65,影響發(fā)酵乳質量。本研究中LpLc、LpLa和LrLa 21 d時pH降至4以下,同樣不利于產品質量控制[19]。

表1 貯藏期間活菌數(shù)變化

2.2 滴定酸度

如圖2所示貯藏期內滴定酸度顯著升高(p<0.05),發(fā)酵乳在發(fā)酵結束時的滴定酸度<40 °T偏低,未能達到《GB19302-2010食品安全國家標準 發(fā)酵乳》中滴定酸度≥70 °T的要求。王水泉[20]將植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合發(fā)酵豆乳42 ℃條件下,發(fā)酵結束時發(fā)酵豆乳滴定酸度為38.7 °T,與本研究所得結論一致;而發(fā)酵牛乳為78 °T。這可能與發(fā)酵基質有關,發(fā)酵過程中乳酸菌在牛乳中能夠產生較多酸性物質,而豆乳、糙米乳中較少。1 d內滴定酸度上升較快,包艷[21]等以LpLa混合發(fā)酵豆乳,貯藏1 d增加了8 °T,變化較大。朱秋勁[22]報道了發(fā)酵乳后熟12 h內是乳酸菌產酸的主要階段。到第7 d,組合LpLa、LpLc和LrLa發(fā)酵乳的滴定酸度顯著高于另外3組(p<0.05),21 d時達到75 °T。冷藏期間LpLc后酸化最嚴重,21 d內上升了40.3 °T;LaLc最弱為23.59 °T;其次為LrLc滴定酸度上升了28.14 °T。發(fā)酵乳品在貯藏過程中伴隨著后酸化作用,但是滴定酸度變化太大不利于產品質量控制,對產品的風味、口感,質地都會產生一定的影響?？梢酝ㄟ^改變菌種組合來降低發(fā)酵產品的后酸化作用,從而改善產品質量。貯藏期間乳酸菌繼續(xù)產生酸性物質,隨著時間的延長滴定酸度增大,一直保持著上升趨勢,這與pH持續(xù)下降是對應的,滴定酸度與pH顯著相關(p<0.05)。并且pH降低的越多,滴定酸度升高的越多。

圖2 發(fā)酵乳滴定酸度變化Fig.2 The graph of titratable acidity of fermented milk by co-culture

2.3 活菌數(shù)

發(fā)酵產品在貯藏期內保持高含量的乳酸菌是非常重要的。很多研究提出了提高乳酸菌含量的方法,如降低發(fā)酵溫度至37 ℃,添加乳清蛋白、益生元如菊粉、低聚糖,降低貯藏溫度至3～4 ℃等[23-24]。乳酸菌在體內發(fā)揮益生特性必須能夠存活于腸道,耐受胃酸和腸膽鹽并且在發(fā)酵產品貨架期內具有活力。由表1可得6組產品的乳酸菌數(shù)量在貯藏期內均超過8 lg cfu/g,遠遠超過國標GB19302-2010中對發(fā)酵乳制品貨架期內活菌數(shù)的要求(≥6 lg cfu/mL),可能是低溫條件下延長了乳酸菌的穩(wěn)定期。前4組產品在前14 d活菌數(shù)較高,21 d活菌數(shù)降至8.5 lg cfu/mL,與后2組差異顯著(p<0.05),可能是營養(yǎng)物質消耗、乳酸菌的代謝活動終止,從而引起活菌數(shù)量下降[25]。LrLc和LaLc貯藏期內活菌數(shù)基本穩(wěn)定(p>0.05),活菌數(shù)高達8.8 lg cfu/mL以上,pH等環(huán)境的改變對乳酸菌的生長繁殖影響較小。王佳[26]以LrLc混合發(fā)酵豆乳,4 ℃貯藏21 d活菌數(shù)仍然達到8 lg cfu/mL,該實驗與其結果一致。吳均[27]測定了牦牛酸乳20 d內活菌數(shù)的變化,發(fā)現(xiàn)活菌數(shù)先增大后減小,與本實驗結果基本一致。而李巖巖[28]等將瑞士乳桿菌和干酪乳桿菌復配發(fā)酵綠豆乳4 ℃貯藏21 d活菌數(shù)一直在降低。這可能與發(fā)酵基質,菌種不同有關。乳酸菌復配后發(fā)酵產品中乳酸菌活菌數(shù)均較高,有利于乳酸菌發(fā)酵制品的開發(fā)。

2.4 STS值的變化

STS值與發(fā)酵乳的微觀結構緊密相關,體現(xiàn)了凝膠對體系中各種乳成分特別是水分的結合能力,STS值越小,則發(fā)酵乳在特定時間內失去的乳清越少,產品質量越好。各組發(fā)酵乳的STS值隨著貯藏時間的延長而下降,持水性增強。LpLr、LpLa和LrLa在發(fā)酵結束時STS值較小在26%左右,隨后的時間里STS維持在20%左右;LrLc在發(fā)酵結束時高于上述3組約為30%,但貯藏期內STS值持續(xù)下降且在同一時間點與其他組合相比處于較低水平,末期下降到14.53%,與上述3組差異顯著(p<0.05);LpLc、LaLc在21 d時STS值較低,但前14 d持水性較差,其中LaLc最差。王水泉[20]以植物乳桿菌與兩種嗜熱鏈球菌分別復配發(fā)酵豆乳,發(fā)酵結束時STS在30%左右,后熟24 h后降至25%左右,與本實驗結果一致。包艷[21]以LpLa復合發(fā)酵豆乳貯藏1 d后STS較發(fā)酵結束時降低,有助于豆乳的貯藏和保形。冷藏期間各組發(fā)酵乳STS值相對較小,這可能是因為大豆蛋白分子量大,分子之間能夠形成良好的網(wǎng)絡結構,從而具有較好的持水性;而且對“毛細管水”的束縛力較強,可以束縛更多的自由水分子,使其本身“變稠”[29]。

圖3 發(fā)酵乳STS值的變化Fig.3 Changes of STS of fermented milk by co-culture

表2 發(fā)酵乳稠度系數(shù)K的變化

表3 發(fā)酵乳流動行為指數(shù)n的變化

2.5 蛋白質分解力

蛋白質分解力測定的是蛋白質降解成的小分子的短肽類和氨基酸,改善產品的酸度、風味,并提供保健功能。冷藏期間6組乳酸菌組合的蛋白質分解力都較低,游離氨基酸較初期有不同程度的增加,對產品的酸度及口感產生一定的影響。發(fā)酵結束時差異不顯著(p>0.05);后熟1 d游離氨基酸變化較小。從7 d開始蛋白質分解力發(fā)生較為明顯的變化,其中LpLa在14 d升高,隨后在21 d降至第7 d時相近水平;LrLa開始下降直至21 d;其他4組先下降后升高。LpLr和LrLc貯藏期內蛋白質分解力差異不顯著(p>0.05)。Thomas等[30]研究表明:乳酸菌中La的蛋白質水解力較強,游離氨基酸的含量隨發(fā)酵酸度及菌體生物量的增加而呈上升的趨勢,本研究也發(fā)現(xiàn)含有La復合菌其貯藏期間蛋白分解力相對較高。楊媚[31]采用SDS-PAGE分析了組合乳酸菌發(fā)酵豆乳在貯藏期間的蛋白質降解情況,蛋白分子量處于44.3及29.0 ku的條帶出現(xiàn)微弱的降解,且小分子量條帶表達稍有增加。表明組合菌對發(fā)酵乳具有一定的蛋白水解活性,與本文研究結果一致。又由于游離氨基酸變化不大,因而發(fā)酵乳的三維網(wǎng)絡結構并未受到太大影響,持水性較強。

圖4 發(fā)酵乳蛋白質分解力變化Fig.4 The curve of proteolytic activity of co-culture in fermented milk

2.6 流變性質

對6組樣品進行剪切速率0～150 s-1掃描研究其流變性質。根據(jù)改進的Ostwald-de Waele模型:η=K·γn-1對流變性質進行擬合,η是黏度(Pa·s),γ是剪切速率(s-1),K是稠度系數(shù)(Pa·sn),n是流動行為指數(shù)。其擬合系數(shù)可達0.99,說明此方程適合分析發(fā)酵乳的流變參數(shù)。在7 d時同一組合K值呈增加的趨勢,說明在貯藏初期樣品的黏度在增大。LaLc冷藏期間K較小,則其黏度較低,脫水收縮敏感性差,凝膠容易收縮,乳清較易析出。而LrLc的K值保持在較高水平,黏度大,抗剪切能力強,乳清析出較少;此外LpLr、LpLa和LrLa黏度也較大。

相對于稠度系數(shù)K,各組發(fā)酵糙米乳的流動行為指數(shù)n變化較小。冷藏期間n<1,所有樣品的n值均在0.06～0.14范圍內,屬于典型的非牛頓流體,當受到剪切或外力作用時容易變形,具有剪切稀化特性。發(fā)酵發(fā)芽糙米乳是由緊密連接的多肽鏈形成的三維結構,當剪切速率增大時,鏈狀的膠體粒子之間相互鉤掛減少從而表現(xiàn)出剪切稀化的現(xiàn)象。n越小對外力作用越敏感,組織結構越容易遭到破壞。LpLa和LrLc的n值較大,相對受外界作用力影響較小,在貯運中較方便,而n值較小的發(fā)酵糙米乳則需要在貯運時注意。

Nguyen等[31]研究了2種發(fā)酵牛乳的流變學性質,發(fā)現(xiàn)28 d貯藏期內隨著貯藏時間的延長K增大,n減小。對發(fā)酵牛乳進行0.01～100 s-1剪切掃描,K變化范圍為49～63 Pa·sn,n為0.08～0.05。這一方面可能與發(fā)酵基質有關;另一方面可能是因為剪切速率不一樣,Bezerra[32]對發(fā)酵牛乳從10～1100 s-1進行剪切掃描,發(fā)現(xiàn)其K值為4.9 Pa·sn。

3 結論

將4種乳酸菌兩兩組合發(fā)酵發(fā)芽糙米乳,4 ℃貯藏21 d LrLc和LaLc pH變化較小,對應的滴定酸度增加較少,分別為28.14 °T和23.59 °T,后酸化程度相對較弱,有利于產品質量的穩(wěn)定與保持。貯藏期間各組發(fā)酵乳活菌數(shù)都大于8 lg cfu/mL,遠遠高于國家標準。其中LrLc和LaLc活菌數(shù)較穩(wěn)定,尤其是LrLc活菌數(shù)含量一直較高。發(fā)酵乳脫水收縮敏感性冷藏期間≤30%,但不同組合之間存在差異性,LrLc STS值較小,持水力較強,21 d時降到14.53%。6組發(fā)酵乳蛋白質分解力均較低,可能因為是乳酸桿菌。但是較發(fā)酵結束時蛋白質分解力都有所提高。實驗中發(fā)現(xiàn)含有La的組合蛋白質分解力相對較高。對其流變學特性進行分析得出在貯藏期發(fā)酵乳屬于典型的非牛頓流體,貯藏期間黏度呈增加的趨勢,乳清析出逐漸減少,與脫水收縮敏感性結果一致。結果顯示LpLa和LrLc流變學性質較好。綜合考慮LrLc較適合發(fā)酵發(fā)芽糙米乳。

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Study on characters of fermented germinated brown rice milk prepared with combination of two lactic acid bacteria

ZHU Li-jie,FANG Yi-yuan,CHEN Yan-jie,LIU Xiu-ying,WANG Bo,LIU He,HE Yu-tang,MA Tao*

(College of Food Science and Technology,Bohai University,National & Local Joint Engineering Research Center of Storage, Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China)

Lactobacillusplantarum,L.rhamnosus,L.acidophilusandL.caseiwere used for germinated brown rice milk fermentation on pairwise combination. The best group was selected by evaluating their properties including acidity,viable count,susceptibility to syneresis,proteolytic activity and rheological property. Results showed that fermentation characteristics of these combinations in germinated brown rice milk were different,while L. acidophilus and L. casei dominated the acidity trend of each combination at 4 ℃ during a 21 d storage. Viable count of each groups were more than 8 lg cfu/mL,and the differences of processing properties were obvious between the two groups. The product fermented withL.rhamnosusandL.caseidisplayed weak post acidification which reduced 0.65 units pH and lower amount of whey was separated out. The viable count of the product was more than 8.5 lg cfu/mL and the free amino acid increased 0.08 mmol/L. Rheological measurement indicated that its viscosity was better.

Lactobacillus;co-culture;germinated brown rice milk;properties

2016-06-13

朱力杰(1986-)，男，博士，講師，研究方向:農產品深加工與功能性食品，E-mail：charleswestwood@163.com。

*通訊作者:馬濤(1962-)，男，博士，教授，研究方向:糧油與植物蛋白工程，E-mail：matao-09@163.com。

遼寧省農業(yè)領域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃(2015001)。

TS210.1

A

1002-0306(2016)22-0195-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.030