微生物熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶的研究進(jìn)展

胡榮康,肖 正,林滿紅,賈瑞博,劉 斌,*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002;2.國家菌草工程技術(shù)研究中心,福建福州 350002;3.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002)

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微生物熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶的研究進(jìn)展

胡榮康1,2,肖 正2,3,林滿紅1,2,賈瑞博1,2,劉 斌1,2,*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002;2.國家菌草工程技術(shù)研究中心,福建福州 350002;3.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002)

熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶具有熱穩(wěn)定性和酸堿適應(yīng)性,能在高溫條件下保持良好活性。目前,尋找具有工業(yè)化潛在應(yīng)用價(jià)值的新酶源越來越受到關(guān)注。本文簡(jiǎn)述了熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶的微生物來源,熱穩(wěn)定性機(jī)制,及其工業(yè)應(yīng)用和發(fā)展前景。

高溫微生物,熱穩(wěn)定,幾丁質(zhì)酶,工業(yè)應(yīng)用

幾丁質(zhì)又稱甲殼素或甲殼質(zhì),是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖以β-1,4糖苷鍵連接而成的高分子聚合物,在自然界中是僅次于纖維素的第二大可再生資源。幾丁質(zhì)酶是一種能夠催化幾丁質(zhì)產(chǎn)生N-乙酰氨基葡萄糖單體或低分子量幾丁寡糖的水解酶。廣義的幾丁質(zhì)酶包括殼聚糖酶、脫乙酰酶、幾丁寡糖酶等與降解幾丁質(zhì)有關(guān)的酶,狹義的幾丁質(zhì)酶指催化水解至少含有一個(gè)N-乙酰葡萄糖胺基團(tuán)糖苷鍵的酶。幾丁質(zhì)的降解產(chǎn)物殼聚糖、殼寡糖等具有降血糖、降血脂、抗菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等活性[1-3]。化學(xué)降解法不僅效率低,還會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染,而利用酶解法可以有效克服這些問題并且能夠控制降解程度,具有環(huán)境兼容性、成本低等多種優(yōu)點(diǎn)。X射線衍射圖譜分析表明幾丁質(zhì)具有高度有序的晶狀結(jié)構(gòu)[4],不溶于水,常溫幾丁質(zhì)酶不能輕易地降解幾丁質(zhì),因此熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶在工業(yè)應(yīng)用中就更為重要。作為熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶的重要來源,微生物所產(chǎn)酶在高溫條件下反應(yīng)效率高,污染少,具有更強(qiáng)的抗化學(xué)變性和更高的熱穩(wěn)定性,可以在常規(guī)嗜溫菌中表達(dá)且易于純化[5]。這些特性可以通過基因工程的手段進(jìn)一步改造獲得具有獨(dú)特生物學(xué)特性、更加高效穩(wěn)定的熱穩(wěn)定酶,使熱穩(wěn)定酶的開發(fā)呈現(xiàn)出更加廣闊的前景。本文對(duì)熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶的微生物來源,熱穩(wěn)定性機(jī)制,及其工業(yè)應(yīng)用和發(fā)展前景進(jìn)行綜述。

1 幾丁質(zhì)酶的特性

幾丁質(zhì)酶根據(jù)氨基酸同源性可分為18和19兩個(gè)家族,18家族幾丁質(zhì)酶廣泛存在于各種生物中,而植物和鏈霉菌屬幾丁質(zhì)酶多屬于19家族,18和19家族幾丁質(zhì)酶在氨基酸序列上沒有同源性。微生物幾丁質(zhì)酶在pH3～10之間都能保持活性,對(duì)溫度適應(yīng)性強(qiáng),一般在4～60 ℃之間都較穩(wěn)定,金屬離子Fe3+、Fe2+、Zn2+會(huì)抑制酶的活性,Mg2+和Mn2+能激活酶的活性[6]。

表1 熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶的來源

目前可以在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索到8種幾丁質(zhì)酶的三維結(jié)構(gòu)圖。19家族幾丁質(zhì)酶三級(jí)結(jié)構(gòu)類似于溶菌酶。18家族幾丁質(zhì)酶三維結(jié)構(gòu)相似,以粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)分離的幾丁質(zhì)酶為代表,都具有8條鏈的α/β折疊桶構(gòu)成,8條β片段彎進(jìn)桶內(nèi)與α螺旋形成一個(gè)外向環(huán)。

2 熱穩(wěn)定性幾丁質(zhì)酶的來源

目前,從細(xì)菌[7]、真菌[8]、古菌[9]中均有分離熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶的報(bào)道,見表1。

2.1 嗜熱真菌幾丁質(zhì)酶

嗜熱真菌是一類分布比較廣泛的真菌類群,目前從地球各溫帶以及濕潤區(qū)和干旱區(qū)均發(fā)現(xiàn)有嗜熱真菌,只要存在高溫環(huán)境并滿足一定的營養(yǎng)條件,均適合嗜熱真菌的生長發(fā)育[10]。

來源于嗜熱真菌的熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶的研究中,疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)在微生物研究和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中顯示出極高的應(yīng)用價(jià)值。疏綿狀嗜熱絲孢菌是生長上限溫度高的一種嗜熱真菌,它在幾丁質(zhì)誘導(dǎo)下產(chǎn)生的胞外幾丁質(zhì)酶具有很高的抗菌活性[11]。最近測(cè)序的T.lanuginosusSSBP基因組中,編碼44.1 ku蛋白質(zhì)的ChitⅠ基因和編碼36.6 ku蛋白質(zhì)的ChitⅡ基因在巴斯德畢赤酵母中成功表達(dá),ChitⅠ在50 ℃有最適溫度,而在60 ℃處理30 min后仍然保留56%的活性;編碼343個(gè)氨基酸的ChitⅡ在40 ℃活性最佳,在50 ℃處理60 min后仍保留71%的活性[12]。ChitⅡ顯示出對(duì)青霉菌和黑曲霉具有抗真菌特性,它含有8條α/β鏈折疊桶結(jié)構(gòu),對(duì)其分子結(jié)構(gòu)分析表明Glu176對(duì)該酶活性至關(guān)重要[13]。郭潤芳和李多川[14]克隆了T.lanuginosus的幾丁質(zhì)酶基因,在甲醇和膠體幾丁質(zhì)的誘導(dǎo)下,在畢赤酵母GS115中成功分泌出具有生物活性的幾丁質(zhì)酶,誘導(dǎo)6 d后酶活性達(dá)2.261 U/mL,酶蛋白表達(dá)量0.36 mg/mL,得到的幾丁質(zhì)酶最適反應(yīng)溫度為60 ℃,65 ℃處理30 min仍有70%的相對(duì)酶活。幾年后,他們又從T.lanuginosusSY2分離了一種新型胞外幾丁質(zhì)酶,這種耐熱幾丁質(zhì)酶在50 ℃穩(wěn)定存在,在65 ℃下半衰期為25 min,這是目前從真菌中分離的最耐熱的幾丁質(zhì)酶之一[15]。通過誘變和基因工程的手段改造產(chǎn)酶菌株有利于提高微生物產(chǎn)幾丁質(zhì)酶能力與產(chǎn)酶水平,如果對(duì)這些基因做進(jìn)一步改造,并實(shí)現(xiàn)異源高效表達(dá),或許可以獲得優(yōu)良的生物工程菌株。從溶黃嘌呤厄菌(Oerskoviaxanthineolytica)NCIM 2839中發(fā)現(xiàn)一種熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶,可以通過麥麩和膠體幾丁質(zhì)生產(chǎn)真菌原生質(zhì)體,這種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的方法可以應(yīng)用于改進(jìn)真菌原生質(zhì)體融合的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)[16]。

盡管不斷從真菌中分離出熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶,但是真菌幾丁質(zhì)酶在工業(yè)化生產(chǎn)方面受到諸多限制,如真菌菌絲體與不溶性底物難以混合,菌絲體易向發(fā)酵系統(tǒng)中轉(zhuǎn)移等等。為了進(jìn)一步提高真菌幾丁質(zhì)酶熱穩(wěn)定性,利用重組微生物以及國外最近利用苯基瓊脂糖矩陣等固定化技術(shù)均使幾丁質(zhì)酶表現(xiàn)出更好的熱穩(wěn)定性[17-18]。

2.2 嗜熱細(xì)菌幾丁質(zhì)酶

嗜熱細(xì)菌對(duì)溫度的耐受性極強(qiáng),在惡劣的條件下為了生存會(huì)采取各種各樣的分子策略,例如有人從印度沙漠中分離到一株產(chǎn)高水平嗜熱幾丁質(zhì)酶的細(xì)菌BrevibacillusformosusBISR-1,即便在100 ℃高溫下也能保持活性5 h[19]。在濕地等地?zé)岘h(huán)境中也能夠獲得分泌幾丁質(zhì)酶的嗜熱細(xì)菌[20]。目前世界各地的科學(xué)家不斷從高溫生態(tài)環(huán)境中分離到產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的嗜熱菌[7]、超嗜熱菌[21]。嗜熱細(xì)菌幾丁質(zhì)酶最適溫度多在40～60 ℃,對(duì)酸堿度及溫度的適應(yīng)性強(qiáng),在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)方面有重大的應(yīng)用潛力。

無論是遏制網(wǎng)絡(luò)草根民主發(fā)展還是過分?jǐn)U張網(wǎng)絡(luò)草根民主發(fā)展，都不是大數(shù)據(jù)時(shí)代背景下網(wǎng)絡(luò)草根民主治理的題中應(yīng)有之義。擴(kuò)張網(wǎng)絡(luò)草根民主發(fā)展的力量與遏制網(wǎng)絡(luò)草根民主的力量相互角逐與制衡，最終將形成一股合力，進(jìn)而形成一個(gè)全新的網(wǎng)絡(luò)草根民主之間、網(wǎng)絡(luò)草根民主與網(wǎng)絡(luò)精英民主之間良性互動(dòng)的發(fā)展方向。為此，要充分利用大數(shù)據(jù)來推動(dòng)、引導(dǎo)、規(guī)范網(wǎng)絡(luò)草根民主，引領(lǐng)網(wǎng)絡(luò)草根民主健康發(fā)展，同時(shí)防止網(wǎng)絡(luò)草根民主的民粹主義傾向。

芽孢桿菌(Bacillusspp)在自然界分布廣泛,地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)在芽孢桿菌中較具應(yīng)用潛力且具有很強(qiáng)的酶活性,是國內(nèi)外幾丁質(zhì)酶研究的熱點(diǎn)菌種。Waghmare等[22]從蘑菇床中分離了一種產(chǎn)新型耐熱幾丁質(zhì)酶的地衣芽孢桿菌JS,用DEAE纖維素離子交換層析法純化后純度提高了8.1倍,55 ℃時(shí)酶活性最佳,這種熱穩(wěn)定性酶在轉(zhuǎn)化廢棄幾丁質(zhì)及生產(chǎn)低聚糖等方面具有重要意義。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)用于防治植物病原真菌在國內(nèi)外已有不少研究,趙靜等[23]運(yùn)用基因工程手段成功克隆表達(dá)了B.subtilis菌株XF-1的脫乙酰幾丁質(zhì)酶基因,酶蛋白具有較好的耐熱性,研究發(fā)現(xiàn)該酶在高溫下對(duì)根腫病菌孢子有一定的裂解作用,在121 ℃處理20 min后仍然具有抑菌活性。從海床表面細(xì)菌獲得的一種新嗜熱幾丁質(zhì)酶(LpChiA)在70 ℃穩(wěn)定性較強(qiáng),通過陰陽離子和非離子表面活性劑預(yù)培養(yǎng)后酶活提高了60%,有趣的是,所有類型的表面活性劑均能增強(qiáng)酶的活性[24]。表面活性劑的激活機(jī)制目前尚不清楚,但是對(duì)晶體結(jié)構(gòu)的分析將有助于闡明表面活性劑的激活機(jī)制。

最近生物技術(shù)的進(jìn)步使許多細(xì)菌幾丁質(zhì)酶得到克隆,表達(dá)和純化。與幾丁質(zhì)降解有關(guān)的知識(shí)和方法已經(jīng)用于生產(chǎn)化工產(chǎn)品,對(duì)幾丁質(zhì)降解的進(jìn)一步探究需要繼續(xù)探索新酶,提高酶的質(zhì)量,以及進(jìn)行高通量幾丁質(zhì)酶實(shí)驗(yàn)。

2.3 嗜熱古菌幾丁質(zhì)酶

在地球的生命形式中,嗜熱古菌出現(xiàn)最早因而受到各領(lǐng)域?qū)W者的重視,目前對(duì)嗜熱古菌的研究多以極端嗜熱古菌為主,其最高生長溫度為80～110 ℃,最低生長溫度為55 ℃[25]。16S/18S進(jìn)化樹分析表明,極端嗜熱菌通常位于樹根部位,可能代表著古老細(xì)胞的生命特征[26],這對(duì)于開發(fā)熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶及拓展其工業(yè)應(yīng)用具有重要的參考價(jià)值。

在對(duì)嗜高熱古菌PyrococcuskodakaraensisKOD1的研究中,Tanaka[27]分離到了抗熱性很強(qiáng)的幾丁質(zhì)降解酶,克隆該幾丁質(zhì)酶基因chiA并對(duì)其序列分析表明,該序列長3645 bp,編碼1215個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)分子量為134.259 ku,該酶最適作用溫度是85 ℃,但是在100 ℃處理3 min后就會(huì)失活;然而其缺失C端的同系物ChiAΔ2在100 ℃處理3 h后仍保留70%的酶活力,具有極強(qiáng)的耐熱性,該同系物的發(fā)現(xiàn)極大拓展了幾丁質(zhì)酶的應(yīng)用范圍。

Mine[28]從海床強(qiáng)烈熾熱球菌(Pyrococcusfuriosus)分離的幾丁質(zhì)酶能夠降解甲殼素并生成最終產(chǎn)物殼二糖,通過分析降解機(jī)制,脫乙酰酶作為一個(gè)不溶性的包涵體經(jīng)過再折疊得到重新激活,經(jīng)過多次分離純化,從1 L培養(yǎng)液中獲得40 mg可溶性熱穩(wěn)定脫乙酰酶,80 ℃下仍具有活性。Nakamura等[29]對(duì)P.furiosus幾丁質(zhì)酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,其結(jié)果提供了一個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和碳水化合物識(shí)別的新認(rèn)識(shí),這為生物量的發(fā)展提供了一個(gè)新技術(shù)。

3 熱穩(wěn)定機(jī)制

酶的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是決定其熱穩(wěn)定性的主要機(jī)制。通過對(duì)酶蛋白序列分析,熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶之所以表現(xiàn)出比常溫酶更強(qiáng)的耐熱性,除了氨基酸排列的一級(jí)基礎(chǔ),通過疏水作用、氫鍵、離子鍵和疏水作用等次級(jí)鍵再折疊成的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)也有利于酶在高溫環(huán)境下發(fā)揮催化功能。

18家族幾丁質(zhì)酶三維結(jié)構(gòu)相似,以粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)分離的幾丁質(zhì)酶為代表,都具有8條鏈的α/β折疊桶構(gòu)成,8條β片段彎進(jìn)桶內(nèi)與α螺旋形成一個(gè)外向環(huán)。Lin等人通過特定PCR技術(shù)克隆了S.marcescensChiC和它的兩個(gè)C端截?cái)嗟耐蛔凅wG426和G330的基因。G426來自于沒有C端結(jié)合域的SmChiC分子,而G330來自于同時(shí)沒有C端結(jié)合域和纖連蛋白Ⅲ域(FnⅢ)的SmChiC分子,圓二色光譜數(shù)據(jù)表明,突變體和SmChiC擁有類似的折疊結(jié)構(gòu),然而G330不同于G426的是,G330的熱穩(wěn)定性沒有較大的轉(zhuǎn)變,這說明FnⅢ在SmChiC熱穩(wěn)定中起到至關(guān)重要的作用[31]。

與酶熱穩(wěn)定性相關(guān)的非共價(jià)力如氫鍵、離子鍵和疏水作用都會(huì)使酶蛋白具有更加穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu),一般認(rèn)為,當(dāng)這些作用力增加時(shí),酶的熱穩(wěn)定性也會(huì)隨之增強(qiáng),反之減弱。疏水作用能夠形成一個(gè)蛋白質(zhì)疏水核心緊密包裹蛋白質(zhì)核心,是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動(dòng)力。蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性和氫鍵的數(shù)量有關(guān),氫鍵能為酶構(gòu)象的穩(wěn)定提供110 kcal/mol的能量。形成網(wǎng)絡(luò)的離子對(duì)會(huì)比同等數(shù)量的單個(gè)離子在能量上更有利。一般認(rèn)為二硫鍵使酶蛋白穩(wěn)定的原因是它能降低折疊狀態(tài)的熵,形成二硫鍵的兩個(gè)半胱氨酸之間間隔的氨基酸數(shù)量的對(duì)數(shù)與二硫鍵對(duì)熵值的影響呈正比。

大多數(shù)幾丁質(zhì)酶都有其固有的熱穩(wěn)定性,而一些從高溫菌中分離到的幾丁質(zhì)酶因?yàn)樗獾孜锏牟煌錈岱€(wěn)定性也會(huì)產(chǎn)生變化,例如從Thermoascusaurantiacusvar. levisporus和Chaetomiumthermophilum獲得的幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化畢赤酵母后,在高溫下水解膠體幾丁質(zhì)和粉狀甲殼素、殼聚糖時(shí)酶活性持久不變[32]。近年來基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)越發(fā)完善,增強(qiáng)了酶的熱穩(wěn)定性,同時(shí)固定化技術(shù)和化學(xué)修飾也為優(yōu)化幾丁質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性提供了新途徑。

4 熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶的應(yīng)用進(jìn)展

熱穩(wěn)定酶能在高溫條件下保持良好活性,有特殊的耐受和催化功能,適應(yīng)范圍較廣,且對(duì)一些酶抑制劑耐受性明顯,生物學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,有利于工業(yè)化應(yīng)用。由于熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶具有高溫反應(yīng)活性,使其在蝦蟹殼資源利用、食品開發(fā)與生物醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)防治、生物質(zhì)能源等方面有廣泛的應(yīng)用潛力。

4.1 在蝦蟹殼資源開發(fā)中的應(yīng)用

我國海岸線漫長,蝦蟹資源非常豐富,然而每年有大量幾丁質(zhì)資源廢棄,不僅給環(huán)境造成巨大污染,同時(shí)造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)。再生利用這些廢棄資源及生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品已成為近年來的熱點(diǎn)話題。酶解幾丁質(zhì)具有環(huán)境兼容性好,成本低等優(yōu)點(diǎn)。蝦蟹殼幾丁質(zhì)在酶解之前,要經(jīng)過酸堿處理,這就要求幾丁質(zhì)酶要具備耐熱、耐酸堿等多種特性。目前,國外對(duì)超微粉碎小龍蝦殼并與酶解相結(jié)合的處理方法進(jìn)行了研究,該研究從100 g小龍蝦殼酶解36 h后得到15.2 g葡萄糖,這與單一方法處理相比得率大大提高[33]。使用基因工程重組幾丁質(zhì)酶酶解黑虎蝦蝦殼,提供了一種高效環(huán)保的殼寡糖制備方法,為環(huán)境清潔型的龍蝦殼寡糖工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)[34]。

4.2 在食品開發(fā)與生物醫(yī)藥中的應(yīng)用

甲殼素、殼聚糖被譽(yù)為人體所必需的除了糖類、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì)以外的第六大生命要素。低聚殼聚糖不僅在調(diào)節(jié)微生態(tài)等方面效果顯著,同時(shí)還能降低膽固醇、血脂和血糖。低聚殼聚糖無急性毒性,無細(xì)胞毒性,亞急性毒性非常小,但是化學(xué)獲得法易產(chǎn)生化學(xué)殘留,同時(shí)不能控制降解程度。熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶高溫反應(yīng)性好,具有綜合抗性,能高效獲得低聚殼聚糖等幾丁質(zhì)降解產(chǎn)物,比常溫酶更加適合大批量工業(yè)化生產(chǎn),例如從芽孢桿菌和類芽孢桿菌分離的富有活性的幾丁質(zhì)酶同工酶,在海洋甲殼類食物甲殼素轉(zhuǎn)化方面應(yīng)用顯著[35]。在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域,通過微生物的生物降解作用,可制備耐高溫殺菌的醫(yī)用材料,如殼聚糖類的手術(shù)縫合線、醫(yī)用敷料、組織修復(fù)材料等[36]。殼聚糖酶能夠降解殼聚糖獲得具有獨(dú)特生理功能的殼寡糖,殼寡糖具有提高免疫力,抑制癌細(xì)胞增長以及預(yù)防成人疾病等功能,大多數(shù)微生物產(chǎn)的殼聚糖酶具有較好的熱穩(wěn)定性,最適溫度范圍在30～70 ℃。但是,目前商品殼聚糖酶在熱穩(wěn)定性等方面尚不滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn),如何向醫(yī)藥工業(yè)提供更加廉價(jià)高效的殼聚糖酶,在世界范圍都已經(jīng)展開了廣泛研究。

4.3 在農(nóng)業(yè)防治中的應(yīng)用

病害是制約農(nóng)作物高產(chǎn)穩(wěn)定的主要因素之一,水稻是世界上重要的糧食作物,水稻紋枯病是水稻生產(chǎn)上普遍發(fā)生的一種世界性真菌病害,從粉紅聚端孢菌(Trichotheciumroseum)克隆嗜熱幾丁質(zhì)酶基因以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入水稻基因組中,增強(qiáng)了水稻的抗逆性。與此同時(shí),Karabi等[37]向水稻引入了一個(gè)PR-3幾丁質(zhì)酶基因,轉(zhuǎn)化株合成不同層次的耐熱幾丁質(zhì)酶蛋白,對(duì)紋枯病表現(xiàn)出不同程度的抗性增強(qiáng)。根腫病是世界范圍內(nèi)的土傳植物病害,近年來我國十字花科根腫病覆蓋程度逐年嚴(yán)重,造成了作物大量減產(chǎn),對(duì)十字花科根腫病具有良好防治效果的枯草芽孢桿菌XF-1已經(jīng)被成功分離,該菌分泌的熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶高效地提高了植物的抗病性,同時(shí)該菌也是最具防病潛力和應(yīng)用價(jià)值的一類生防菌[23]。

4.4 在生物質(zhì)能源中的應(yīng)用

石油等石化燃料在幫助人類物質(zhì)文明發(fā)展的同時(shí)也對(duì)人類及全球環(huán)境造成了巨大危害,酶生物燃料生物相容性好,適用范圍廣泛,作為一種可再生的綠色能源其綜合潛力已經(jīng)被廣泛討論。從鏈霉菌屬CS147獲得的胞外幾丁質(zhì)酶作為生物燃料具有將廢料轉(zhuǎn)化為簡(jiǎn)單糖的潛能,反應(yīng)機(jī)理主要是通過酶反應(yīng)生成N-乙酰葡糖胺單體并進(jìn)一步水解產(chǎn)生酒精[38]。利用宏基因組技術(shù)提高酶生物質(zhì)能轉(zhuǎn)換,有助于擴(kuò)大生物燃料在商業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用范圍[39]。

5 問題與展望

自然界賦予了熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶耐高溫和極強(qiáng)分子穩(wěn)定性的特性,但由于熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶的來源有限,培養(yǎng)條件苛刻,限制了熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶的廣泛應(yīng)用,尋找具有工業(yè)化潛在應(yīng)用價(jià)值的新酶源越來越受到關(guān)注。目前人們?cè)诤Y選產(chǎn)酶活力高、穩(wěn)定、潛力大的優(yōu)良菌株的同時(shí)也通過誘變和基因工程來改造產(chǎn)酶菌株,通過這些方式以提高幾丁質(zhì)酶的性能、產(chǎn)酶水平、活力等。在基因工程技術(shù)使熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用的同時(shí),通過定向進(jìn)化、固定化技術(shù)、表面活性劑等方面提高酶活性也逐漸成為研究的熱點(diǎn)。對(duì)熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶高級(jí)結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)將為建立幾丁質(zhì)酶克隆表達(dá)體系及定向進(jìn)化等方面提供參考。以基因組序列信息結(jié)合分子遺傳學(xué)產(chǎn)生的新工具,使極端嗜熱微生物的生物技術(shù)超越單級(jí)的生物轉(zhuǎn)化成為可能。雖然在過去的二十年中發(fā)現(xiàn)新微生物的速度已經(jīng)放緩,基因組序列數(shù)據(jù)為新的生物分子和代謝途徑提供了線索,開拓了新應(yīng)用的范圍。此外,最近的極端嗜熱微生物的分子遺傳學(xué)的進(jìn)步使得高溫應(yīng)用代謝工程成為現(xiàn)實(shí)[40]。隨著不斷分離出新型嗜熱菌以及對(duì)熱穩(wěn)定酶反應(yīng)條件的探索,熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶的應(yīng)用前景必將更加廣闊。

[1]Shahid M. Induction of chitinase,β-glucanase,and xylanase taken fromTrichodermasp. on different sources:A Review[J]. African Journal of Microbiology Research,2014,8(34):3131-3135.

[2]Andrea F,Carmen F,Giovanni U,et al. New chitosan salt in gastro-resistant oral formulation could interfere with enteric bile salts emulsification of diet fats:preliminary laboratory observations and physiologic rationale[J]. Journal of Medicinal Food,2014,17(6):723-729.

[3]Kumar BTN,Murthy HS,Patil P. Enhanced immune response and resistance to white tail disease in chitin-diet fed freshwater prawn,Macrobrachiumrosenbergii[J]. Aquaculture Reports,2015,2:34-38.

[4]Kumari S,Rath P,Kumar A S H,et al. Extraction and characterization of chitin and chitosan from fishery waste by chemical method[J]. Environmental Technology & Innovation,2015,3:77-85.

[5]Tompa D R,Gromiha M M,Saraboji K. Contribution of main chain and side chain atoms and their locations to the stability of thermophilic proteins[J]. Journal of Molecular Graphics & Modelling,2016,64:85-93.

[6]郭玉蓮. 微生物幾丁質(zhì)酶及其在植物病害防治中的作用[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2005,21(1):283-285.

[7]Yang S,Fu X,Yan Q. Cloning,expression,purification and application of a novel chitinase from a thermophilic marine bacteriumPaenibacillusbarengoltzii[J]. Food Chemistry,2016,192:1041-1048.

[8]Jankiewicz U,Brzezinska M S. Purification,characteristics and identification of chitinases synthesized by the bacteriumSerratiaplymuthicaMP44 antagonistic against phytopathogenic fungi[J]. Applied Biochemistry & Microbiology,2015,51(5):560-565.

[9]Belén G F,Silva A F D,Jacobo L S,et al. Functional expression and characterization of a chitinase from the marine archaeonHalobacteriumsalinarumCECT 395 inEscherichiacoli[J]. Applied Microbiology & Biotechnology,2014,98(5):2133-2143.

[10]Van d B J,Facun K,De V M,et al. Thermophilic growth and enzymatic thermostability are polyphyletic traits within Chaetomiaceae[J]. Fungal Biology,2015,119(12):1255-1266.

[11]Khan F I,Bisetty K,Singh S,et al. Chitinase fromThermomyceslanuginosusSSBP and its biotechnological applications[J]. Extremophiles,2015,19(6):1055-1066.

[12]Zhang M,Puri A K,Govender A,et al. The multi-chitinolytic enzyme system of the compost-dwelling thermophilic fungusThermomyceslanuginosus[J]. Process Biochemistry,2015,50(2):237-244.

[13]Khan F I,Govender A,Permaul K,et al. Thermostable chitinase II fromThermomyceslanuginosusSSBP:Cloning,structure prediction and molecular dynamics simulations[J]. Journal of Theoretical Biology,2015,374:107-114.

[14]郭潤芳,史小琴,李多川,等. 一種耐熱幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)生及其穩(wěn)定性研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào),2008,35(4):481-485.

[15]Guo R F,Shi B S,Li D C,et al. Purification and Characterization of a Novel Thermostable Chitinase fromThermomyceslanuginosusSY2 and Cloning of Its Encoding Gene[J]. Agricultural Sciences in China,2008,7(12):1458-1465.

[16]Waghmare S R,Kulkarni S S,Ghosh J S. Chitinase production in solid-state fermentation fromOerskoviaxanthineolyticaNCIM 2839 and its application in fungal protoplasts formation[J]. Current Microbiology,2011,63(3):295-299.

[17]Prasad M,Palanivelu P. Immobilization of a thermostable,fungal recombinant chitinase on biocompatible chitosan beads and the properties of the immobilized enzyme[J]. Biotechnology & Applied Biochemistry,2015,62(4):523-529.

[18]Prasad M,Palanivelu P. A novel method for the immobilization of a thermostable fungal chitinase and the properties of the immobilized enzyme[J]. Biotechnology & Applied Biochemistry,2014,61(4):441-445.

[19]Meena S,Gothwal R K,Mohan M K,et al. Production and purification of a hyperthermostable chitinase fromBrevibacillusformosusBISR-1 isolated from the Great Indian Desert soils[J]. Chinese & Foreign Medical Research,2014,18(2):451-462.

[20]Liu P,Cheng D,Miao L. Characterization of Thermotolerant Chitinases Encoded by aBrevibacilluslaterosporusStrain Isolated from a Suburban Wetland[J]. Genes,2015,6(4):1268-1282.

[21]Haruyuki A,Takaaki S,Tamotsu K. Application of hyperthermophiles and their enzymes[J]. Current Opinion in Biotechnology,2011,22(5):618-626.

[22]Waghmare S R,Ghosh J S. Chitobiose production by using a novel thermostable chitinase fromBacilluslicheniformisstrain JS isolated from a mushroom bed[J]. Carbohydrate Research,2010,345(18):2630-2635.

[23]趙靜,熊國如,王志遠(yuǎn),等. 枯草芽孢桿菌XF-1中脫乙酰幾丁質(zhì)酶在大腸桿菌中的表達(dá)及其抑菌活性[J]. 中國生物防治學(xué)報(bào),2011(4):504-509.

[24]Shibasaki H,Uchimura K,Miura T,et al. Highly thermostable and surfactant-activated chitinase from a subseafloor bacterium,Laceyellaputida[J]. Applied Microbiology & Biotechnology,2014,98(18):7845-7853.

[25]盛多紅. 超嗜熱古菌基因組的熱穩(wěn)定性[J]. 生命科學(xué),2014(1):64-71.

[26]Wolferen M V,Ajon M,Driessen A J M,et al. How hyperthermophiles adapt to change their lives:DNA exchange in extreme conditions[J]. Extremophiles,2013,17(4):545-563.

[27]Tanaka T,Fujiwara S,Nishiori S,et al. A unique chitinase with dual active sitesand triple substrate binding sites from the hyperthermophilic archaeonPyrococcuskodakaroensisKOD1[J]. Applied Environmental Microbiology,1999,65(12):5338-5344.

[28]Mine S,Ikegami T,Kawasaki K,et al. Expression,refolding,and purification of active diacetylchitobiose deacetylase fromPyrococcushorikoshii[J]. Protein Expression & Purification,2012,84(2):265-269.

[29]Nakamura T,Mine S,Hagihara Y,et al. Tertiary structure and carbohydrate recognition by the chitin-binding domain of a hyperthermophilic chitinase fromPyrococcusfuriosus[J]. Journal of Molecular Biology,2008,381(3):670-680.

[30]Haruyuki A,Takaaki S,Tamotsu K. Application of hyperthermophiles and their enzymes[J]. Current Opinion in Biotechnology,2011,22(5):618-626.

[31]Fu-Pang L,Chun-Yi W,Hung-Nien C,et al. Effects of C-terminal domain truncation on enzyme properties ofSerratiamarcescensChitinase C[J]. Applied Biochemistry & Biotechnology,2015,175(8):3617-3627.

[32]Li A,Yu K,Liu H. Two novel thermostable chitinase genes from thermophilic fungi:Cloning,expression and characterization[J]. Bioresource Technology,2010,101(14):5546-5551.

[33]Gao C,Zhang A,Chen K,et al. Characterization of extracellular chitinase fromChitinibactersp. GC72 and its application in GlcNAc production from crayfish shell enzymatic degradation[J]. Biochemical Engineering Journal,2015,97:59-64.

[34]Proespraiwong P,Tassanakajon A,Rimphanitchayakit V. Chitinases from the black tiger shrimp Penaeusmonodon:Phylogenetics,expression and activities[J]. Comparative Biochemistry & Physiology Part B Biochemistry & Molecular Biology,2010,156(2):86-96.

[35]Li X,Xu Z,Gang Z,et al. Molecular characterization and expression analysis of five chitinases associated with molting in the Chinese mitten crab,Eriocheir sinensis[J]. Comparative Biochemistry & Physiology Part B Biochemistry & Molecular Biology,2015,187:110-120.

[36]李靚. 殼聚糖制備工藝及其在醫(yī)藥領(lǐng)域的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2012,28(11):1687-1688.

[37]Datta K,Tu J,Oliva N,et al. Enhanced resistance to sheath blight by constitutive expression of infection-related rice chitinase in transgenic elite indica rice cultivars[J]. Plant Science An International Journal of Experimental Plant Biology,2001,160(3):405-414.

[38]Pradeep G C,Yoo H Y,Cho S S,et al. An Extracellular Chitinase fromStreptomycessp. CS147 Releases N-acetyl-D-glucosamine(GlcNAc)as Principal Product[J]. Applied Biochemistry & Biotechnology,2015,175(1):372-386.

[39]Xing M N,Zhang X Z,He H. Application of metagenomic techniques in mining enzymes from microbial communities for biofuel synthesis[J]. Biotechnology Advances,2012,30(4):920-929.

[40]Frock A D,Kelly R M. Extreme Thermophiles:Moving beyond single-enzyme biocatalysis[J]. Current Opinion in Chemical Engineering,2012,1(4):363-372.

Research progress on thermophilic microorganism chitinase

HU Rong-kang1,2,XIAO Zheng2,3,LIN Man-hong1,2,JIA Rui-bo1,2,LIU Bin1,2,*

(1.College of Food Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China; 2.National Engineering Research Center of JUNCAO Technology,Fuzhou 350002,China; 3.College of Life Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

Thermophilic chitinase has thermal stability and pH adaptability to achieve expectation under harsh conditions,thus enjoys a better application prospect. At present,it is more and more concerned to find new enzyme sources with potential value for industrial application. In this paper,various resources and thermal stability mechanisms of thermophilic chitinase were reviewed,followed by its industrial applications and development prospects.

thermophilic microorganism;thermostable;chitinase;industrial application

2016-04-14

胡榮康(1992-)，男，在讀碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：18750126626@163.com。

*通訊作者:劉斌(1969-)，男，教授，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：liubin618@hotmail.com。

國家科技支撐計(jì)劃子課題(2014BAD15B01)；福建省科技重大專項(xiàng)(2014NZ2002-1)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)22-0359-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.062