膠質(zhì)母細(xì)胞瘤DNA甲基化研究進展

康恩銘 章薇 章翔

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032)

·綜述·

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤DNA甲基化研究進展

康恩銘 章薇*章翔*

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032)

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤; DNA甲基化; 基因分型

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)是惡性程度最高、最具侵襲性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)生率約占膠質(zhì)瘤的69%[1]。目前，GBM的標(biāo)準(zhǔn)治療是在確保安全的情況下最大范圍地予以手術(shù)切除腫瘤，隨后給予化療與放療的聯(lián)合治療[2]。但是，即便采取最激進的治療方法， GBM患者的生存時間仍然很短。在我國，低級別膠質(zhì)瘤(WHO Ⅰ～Ⅱ級)的中位生存期為78.1月，而GBM只有14.4個月[3]。

近20年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，尤其是高通量測序和基因組測序的應(yīng)用，使從全基因組水平評價各類腫瘤的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變成為可能。細(xì)胞和分子遺傳學(xué)研究已經(jīng)證實，在GBM中存在大量的染色體異常和基因變異。目前，原發(fā)性GBM根據(jù)其基因改變被分為：神經(jīng)元型、前神經(jīng)元型、經(jīng)典型及間質(zhì)型四種。但是，除了基因改變，表觀遺傳學(xué)改變也可能包含在每種亞型的發(fā)展和演進之中[4]。作為表觀遺傳學(xué)調(diào)控的重要機制之一，DNA甲基化對GBM的發(fā)生與演進也具有重要作用。現(xiàn)將近期內(nèi)GBM的DNA甲基化的研究進展進行回顧與綜述。

一、膠質(zhì)瘤CpG島甲基化表型

隨著應(yīng)用高通量平臺進行基因組范圍的DNA甲基化分析技術(shù)的成熟，建立大樣本量患者甲基化組已經(jīng)成為可能[5]。CpG島(CpG island)甲基化表型(CpG island methylator phenotype, CIMP) 最早是通過對一組結(jié)腸癌患者的CpG島甲基化模式進行分析中而提出的[6]。隨后，Noushmehr等[7]在膠質(zhì)瘤中也觀察到其特有的甲基化表型，美國癌癥基因組圖譜計劃(The Cancer Genome Atlas, TCGA)將其命名為膠質(zhì)瘤CpG島甲基化表型(glioma-CpG island methylator henotype，G-CIMP)。他們認(rèn)為G-CIMP陽性亞群的膠質(zhì)瘤多具有前神經(jīng)元型GBM的特點，并且預(yù)后更好。G-CIMP陽性與IDH1(isocitrate dehydrogenase 1)突變與患者的年齡有很強的相關(guān)性，并且大多缺乏在GBM中經(jīng)常出現(xiàn)的表皮生長因子受體擴增、7號染色體擴增和10號染色體缺失等特點。隨后Turcan等[8]確認(rèn)了G-CIMP的分子基礎(chǔ)，他們認(rèn)為IDH1基因突變可以通過改變特異性的組蛋白標(biāo)記(如大量的DNA超甲基化)來形成G-CIMP。這些IDH1突變使得某些關(guān)鍵的基因表達(dá)程序發(fā)生表觀遺傳學(xué)變化，進而使G-CIMP陽性GBM表現(xiàn)出前神經(jīng)元型GBM而不是其他類型的特點。Mazor等[9]在分析GBM患者的DNA甲基化表型與腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系時認(rèn)為，復(fù)發(fā)的腫瘤都有相似的G-CIMP表型，并且這種G-CIMP表型在復(fù)發(fā)后也一直保持，提示這些表觀遺傳學(xué)改變一般出現(xiàn)較早，并且很有可能與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)。

二、O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶啟動子甲基化

O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT)是GBM中另一個DNA甲基化狀態(tài)變化直接左右臨床治療的例子。MGMT是一種DNA錯配修復(fù)酶，能夠特異性地移除O-6鳥嘌呤位點上的甲基基團，修復(fù)替莫唑胺(temozolomide, TMZ)引發(fā)的DNA損傷，從而降低腫瘤對TMZ化療的敏感性，其基因位于染色體10q26[10]。MGMT啟動子的甲基化狀態(tài)與使用TMZ化療的GBM患生存時間密切相關(guān)，是預(yù)測治療反應(yīng)的獨立因素[5]。 Brennan等[11]對500多例GBM病例的基因組甲基化進行了多維綜合性分析，同時將MGMT啟動子甲基化狀態(tài)與患者生存時間進行關(guān)聯(lián)性研究，他們證明MGMT啟動子甲基化狀態(tài)可以區(qū)分經(jīng)典型GBM患者的預(yù)后情況(n=96;P=0.01)，但是無法區(qū)分前神經(jīng)元型(n=66;P=0.57)、間質(zhì)型(n=104;P=0.62)和神經(jīng)元型(n=55;P=0.12)。另外，MGMT啟動子甲基化在G-CIMP陽性GBM患者中的出現(xiàn)率要高于G-CIMP陰性患者。與此同時，和MGMT啟動子甲基化類似，MGMT基因體的甲基化也會對患者的生存時間造成影響[11]。Mur等[12]在對247例膠質(zhì)瘤患者進行DNA甲基化狀態(tài)分析后，證實MGMT基因體的甲基化狀態(tài)與65歲以上患者的生存期相關(guān)。另外，他們還確認(rèn)了2個不同甲基化狀態(tài)影響膠質(zhì)瘤患者生存的MGMT基因相關(guān)的CpG區(qū)域，這兩個區(qū)域發(fā)生甲基化意味著患者具有更長的生存時間。但是，這種現(xiàn)象僅僅出現(xiàn)在G-CIMP陽性的患者中，在G-CIMP陰性患者中并不成立。由此可以推測，MGMT基因相關(guān)甲基化對膠質(zhì)瘤患者的生存影響并不僅僅局限在影響烷化劑化療藥物治療的敏感性上，而是可以與其他因素協(xié)同而產(chǎn)生更廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，這些協(xié)同因素很可能就包含在G-CIMP位點之中。陳蔚軍等[13]在研究YKL-40對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖、侵襲以及“干性”維持的作用時，總結(jié)出MGMT高表達(dá)條件下，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞內(nèi)的YKL-40能發(fā)揮促瘤作用。但是，MGMT與YKL-40的生物學(xué)特性之間并無直接聯(lián)系，提示某種低甲基化表型促使MGMT高表達(dá)與特定分子的生物學(xué)特性產(chǎn)生了關(guān)聯(lián)。

三、年齡相關(guān)DNA甲基化

年齡一直被認(rèn)為是是GBM患者預(yù)后不良的獨立預(yù)測因子[14]，其具體機制不明。Bozdag等[15]對TCGA中GBM患者的基因與外顯子表達(dá)、復(fù)制拷貝數(shù)改變、單核苷酸多肽性 (single nucleotide polymorphisms, SNP)、全外顯子組序列和DNA甲基化數(shù)據(jù)進行整合，以研究年齡特異性的轉(zhuǎn)錄水平、基因表達(dá)、表觀遺傳學(xué)狀態(tài)的特點。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果提示高年齡GBM患者常出現(xiàn)多梳蛋白家族的靶DNA高甲基化、以及血管生成相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。這些年齡相關(guān)性的改變，與其分子遺傳學(xué)分型多無關(guān)聯(lián)[15]。

四、DNA低甲基化

廣泛的DNA低甲基化在GBM中屬于通常性事件。在動物試驗中，誘導(dǎo)小鼠廣泛DNA低甲基化可以引起基因組不穩(wěn)定、并誘發(fā)腫瘤形成。GBM的每單倍體基因組至少有1千萬個CpG雙核苷酸受到DNA低甲基化影響[16]，低甲基化的位點包括1號和16號染色體著絲粒周圍的衛(wèi)星序列2(satellite 2, Sat 2) 、染色體4q和10q端粒近段區(qū)域重復(fù)序列D4Z4和點綴的ALU元件。而嚴(yán)重的Sat2序列去甲基化常伴隨著附近常染色質(zhì)拷貝數(shù)的改變，提示低甲基化可能是引起GBM基因改變的前提因素之一。Lai等[17]研究GBM與正常腦組織的全基因組范圍的甲基化差別時，分辨出至少1548個異常甲基化CpG位點(1307個基因)，其中低甲基化的基因要比高甲基化基因多2倍以上。對發(fā)生頻率排名前十的低甲基化基因進行通路分析后提示，這些基因都是與固有免疫及獲得性免疫功能相關(guān)的基因。Nagarajan等[18]在追蹤了不同分子分型的G-CIMP陰性GBM的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)和腫瘤蛋白p73 (tumour protien p73, TP73)基因的甲基化情況后，認(rèn)為基因啟動子低甲基化事件，可以明顯地增強相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄活性。低甲基化協(xié)同組蛋白H3K4(lysine 4 on histone H3 protein)三甲基化，可以通過激活正常情況下被沉默的基因啟動子來改變GBM瘤全局的轉(zhuǎn)錄環(huán)境，從而引起多種癌基因的表達(dá)。針對DNA低甲基化是否能判斷GBM預(yù)后并作為潛在的診斷指標(biāo)，Chen等[19]用亞硫酸鹽測序法對比了GBM患者瘤組織切片、腫瘤患者血清、正常人血清的ALU低甲基化狀態(tài)水平，證實腫瘤組織切片和腫瘤患者血清中ALU低甲基化狀態(tài)有明顯相關(guān)關(guān)系，并且其去甲基化程度高于正常人血清值，而低級別膠質(zhì)瘤組的瘤組織和血清樣本的ALU低甲基化水平要高于高級別(WHO Ⅲ～Ⅳ級)膠質(zhì)瘤組。同時，他們還通過受試者工作特征曲線 (receiver operating characteristic curve, ROC)分析證實了過度低甲基化水平和短生存時間具有相關(guān)關(guān)系。

五、MicroRNA啟動子甲基化

MicroRNA是一族長度約22個核苷酸的高度保守的非編碼單鏈小RNA，可以通過抑制mRNA轉(zhuǎn)錄或誘導(dǎo)mRNA降解來干擾基因表達(dá)。MicroRNA對調(diào)控GBM的增殖、侵襲和遷移能力有著重要作用[20]。很多microRNA的啟動子位于CpG島中，因此其表達(dá)同樣受到DNA甲基化的調(diào)控。mir-126是GBM中的抑癌microRNA，崔宏偉等[21]利用基因芯片研究了50例GBM患者，他們觀察到正常腦組織中抑癌mir-126表達(dá)水平高于GBM組，而高級別GBM的mir-126表達(dá)則低于低級別GBM。這種與腫瘤病理級別相關(guān)的mir-126表達(dá)趨勢與其啟動子甲基化水平成正相關(guān)，但與患者的年齡、病理類型和性別沒有關(guān)聯(lián)。mir-153是另一個由于啟動子甲基化引起表達(dá)下調(diào)的抑癌microRNA[22]。給予去甲基化試劑5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-aza-dC)處理可以使其表達(dá)上調(diào)，進而抑制膠質(zhì)瘤的生長。 Zhou等[23]通過下調(diào)GBM細(xì)胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-1(DNA methyltransferase 1, DNMT1)表達(dá)或給予5-aza-dC處理，可以降低mir-20啟動子的甲基化水平，進而上調(diào)mir-20的表達(dá)。這兩種均處理可以增加U251細(xì)胞系對替莫唑胺的治療敏感性，提示改變某些microRNA啟動子甲基化狀態(tài)可以改善GBM的治療效果。

六、展望

隨著對GBM的DNA甲基化認(rèn)識的不斷加深，DNA甲基化對GBM發(fā)生、發(fā)展的重要性越來越受到關(guān)注。表觀遺傳學(xué)調(diào)控具有復(fù)雜性、多變性、時空特異性等特點，這給表觀遺傳學(xué)調(diào)控的研究帶來了很大困難。現(xiàn)階段學(xué)者們對DNA甲基化的研究大多局限在使用藥物處理或者敲除DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，來觀察某些基因改變對其下游靶點的影響。但是，GBM的表觀遺傳學(xué)改變涉及范圍廣，這類研究結(jié)果對改善GBM的治療往往收效甚微。未來，如果能夠找到調(diào)控表觀遺傳學(xué)變化的上游機制，從根源糾正GBM的整體表觀遺傳學(xué)改變，將對GBM的治療產(chǎn)生深刻的影響。另外，雖然G-CIMP等表型分類對于患者的治療分組和預(yù)后判短有很好的應(yīng)用價值，但是由于全基因組甲基化檢測費用昂貴，臨床上較難對大量GBM患者進行全基因組甲基化組分析。因此，降低相應(yīng)檢測成本或者尋找一種替代分類法顯得尤為急切和重要。隨著基因編輯手段的成熟和對人類基因組信息挖掘的深入，越來越多的曾經(jīng)認(rèn)為沒有意義的基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)其新的功能和作用，例如長鏈非編碼RNA等，而探究表觀遺傳學(xué)調(diào)控對這類基因表達(dá)的影響也是未來的研究熱點方向之一?？傊钊胙芯緿NA甲基化對完善表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制、理解GBM的生物學(xué)特性、精確地選擇治療方法、判斷預(yù)后、設(shè)計臨床實驗分組和研制治療靶點，均具有很重要的意義，將為攻克GBM的治療帶來深遠(yuǎn)的影響。

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R 739.41

A

1671-2897(2017)16-279-03

國家自然科學(xué)基金資助項目(81302174, 81672909)

康恩銘，碩士研究生，E-mail: kynself@aliyun.com

*通訊作者：章薇，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: nuomi_weiwei@126.com; 章翔，教授、主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，E-mail: xzhang@fmmu.edu.cn

2016-12-22；

2017-02-10)