外周血拉曼光譜在阿爾茨海默病診斷中的應(yīng)用

呂慶坤，黃高忠

(上海交通大學(xué)附屬上海市第六人民醫(yī)院老年病科,上海 200030)

德國(guó)精神病和神經(jīng)病理學(xué)家Alois Alzheimer于1906年首先報(bào)道了阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)。[1]病變主要累及前腦、基底節(jié)區(qū)、海馬和大腦皮質(zhì)，病理特征為神經(jīng)元喪失、突觸功能障礙、細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白(amyloid beta protein,Aβ)沉積為核心的老年斑、神經(jīng)元胞漿內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)和腦血管淀粉樣變性。AD患者的臨床表現(xiàn)為年齡相關(guān)的記憶功能喪失，逐漸發(fā)展為認(rèn)知功能受損，直至完全癡呆、喪失生活自理和社會(huì)交際能力。

1 AD診斷現(xiàn)狀

AD發(fā)病的分子機(jī)制還沒(méi)有完全明了，受高齡、吸煙、基因突變、心腦血管疾病、2型糖尿病和顱腦損傷等多種因素的影響[2]。目前存在一些假說(shuō)，包括Aβ假說(shuō)、MicroRNA缺乏假說(shuō)、NFT假說(shuō)、細(xì)胞自噬假說(shuō)和細(xì)胞周期重入假說(shuō)等。然而，這些假說(shuō)至今沒(méi)有一個(gè)被臨床或試驗(yàn)的確切證據(jù)所證實(shí)。近年研究結(jié)果表明，AD可能不單是腦的疾病，它可能涉及其他非神經(jīng)組織[3]，存在氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝紊亂等病理生理變化。

AD的診斷目前主要根據(jù)臨床觀察及神經(jīng)心理量表評(píng)估，其中AD評(píng)定量表被作為診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”，但近來(lái)因其對(duì)輕度認(rèn)知障礙診斷的不敏感性而遭到質(zhì)疑[4]。此類神經(jīng)心理量表診斷方法受臨床醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)的影響較大，而且近期神經(jīng)化學(xué)和神經(jīng)病理學(xué)研究提示記憶相關(guān)大腦區(qū)域的萎縮和新陳代謝降低早于臨床表現(xiàn)很多年[5]，所以單純依靠臨床行為表現(xiàn)區(qū)分AD，對(duì)于早期識(shí)別和及時(shí)診療尚有不足。

美國(guó)國(guó)家老化研究院的Frank等[6]提出，理想的AD生化標(biāo)志物應(yīng)該滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：①揭示AD中樞神經(jīng)系統(tǒng)基本的病理生理變化，并在神經(jīng)病理學(xué)確診的病例中得到證實(shí)。②診斷敏感性>85%，特異性>75%。③能檢測(cè)到對(duì)疾病治療有益的任何影響。④可靠、可重復(fù)、無(wú)創(chuàng)、操作簡(jiǎn)單。⑤被至少兩個(gè)資深研究者主持的獨(dú)立研究所證實(shí)，并發(fā)表在同行評(píng)議的雜志上。標(biāo)志物的關(guān)鍵特點(diǎn)包括早期發(fā)現(xiàn)疾病過(guò)程的能力和檢測(cè)到疾病前臨床階段的能力，并能隨疾病發(fā)展及嚴(yán)重程度變化而變化。

隨著臨床檢驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，近年相關(guān)輔助診斷指標(biāo)不斷受到人們的重視。如結(jié)構(gòu)磁共振((stru-ctural magnetic resonance imaging，sMRI)評(píng)估腦萎縮；功能磁共振(functional magnetic resonance imaging，fMRI)檢測(cè)腦血流及新陳代謝的減少；彌散張量成像技術(shù)(diffusion tensor imaging，DTI)評(píng)估大腦各區(qū)纖維連接程度等[7]。另有腦脊液中Aβ1-42/1-40和tau蛋白及其過(guò)磷酸產(chǎn)物的檢測(cè)，這些都在一定程度上有助于AD的臨床診斷及病程監(jiān)測(cè)。但這些檢查技術(shù)或操作復(fù)雜，或創(chuàng)傷性大，或費(fèi)用昂貴，對(duì)AD診斷的敏感性及特異性并不理想。

2 拉曼光譜技術(shù)

拉曼光譜是1928年印度物理學(xué)家Raman發(fā)現(xiàn)的一種散射光譜[8]，用于研究分子的振動(dòng)，根據(jù)其提供的分子內(nèi)部各種簡(jiǎn)正振動(dòng)頻率及有關(guān)振動(dòng)能級(jí)的情況,我們可以鑒定分子中存在的官能團(tuán)。目前，拉曼光譜已廣泛應(yīng)用于材料、化工、石油、高分子、生物、環(huán)保、地質(zhì)等領(lǐng)域。

隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，拉曼光譜技術(shù)包括傅立葉變換技術(shù)、表面增強(qiáng)技術(shù)、激光共振技術(shù)、共焦顯微技術(shù)、高溫技術(shù)、拉曼光譜與光導(dǎo)纖維技術(shù)聯(lián)用、固體光聲拉曼技術(shù)等。各種技術(shù)有不同的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，在不同領(lǐng)域的科研中發(fā)揮作用。其中表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)克服了拉曼光譜靈敏度低的缺點(diǎn)，并可直接分析水相生物分子的結(jié)構(gòu)狀態(tài),樣品用量少，相比其他方法有明顯的優(yōu)勢(shì)。人們利用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)解決了生物化學(xué)、生物物理和分子生物學(xué)中的許多難題,包括分子的特殊基團(tuán)(如氨基酸中的氨基、羧基、芳環(huán)等)與界面的相互作用、生物分子與金屬表面的鍵合方式、DNA、RNA、卟啉在銀溶膠上的吸附狀態(tài)等研究[9]。國(guó)外有研究人員通過(guò)以銀膠和銀電極為活性基體的表面增強(qiáng)拉曼光譜與流動(dòng)注射分析聯(lián)用,成功地獲取到嘌呤和嘧啶類化合物的結(jié)構(gòu)信息[10]。

拉曼光譜技術(shù)也可應(yīng)用于疾病的診療，可廣泛應(yīng)用于癌癥、糖尿病、皮疹等疾病的研究；其檢測(cè)的樣本種類亦多種多樣，包括血漿、血清、紅細(xì)胞及其成分、唾液、尿液等。

3 拉曼光譜技術(shù)與AD的病理生理研究

研究人員觀測(cè)到，腦脊液中不同濃度及不同構(gòu)像的Aβ(1-40)蛋白的拉曼光譜特點(diǎn)存在明顯差異，Aβ蛋白在1670 cm-1波峰處有一個(gè)附加肩峰，被認(rèn)為是β蛋白折疊結(jié)構(gòu)標(biāo)志性的光譜反應(yīng)[11]。 Ramachandran等[12]通過(guò)紅外線共振拉曼光譜檢測(cè)Tau纖維形成過(guò)程中的結(jié)構(gòu)變化。Zengin等[13]則通過(guò)一種抗體夾心檢測(cè)方法，可使表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)到25 fM～500 nM濃度之間的Tau蛋白。這些研究有助于我們了解Aβ蛋白、Tau蛋白變化過(guò)程和AD病程發(fā)展及癥狀之間的關(guān)系，從而診斷或隨訪AD患者。

海馬組織是AD病理變化的重要部分，其中發(fā)生Aβ蛋白沉淀、膽固醇含量升高、Tau蛋白過(guò)度磷酸化已得到證實(shí)。武漢大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用微拉曼光譜法對(duì)AD癡呆小鼠模型的海馬組織進(jìn)行檢測(cè)，不僅同樣檢測(cè)到了Aβ的特征光譜，也發(fā)現(xiàn)了脂質(zhì)和過(guò)磷酸化Tau蛋白的光譜信號(hào)。他們通過(guò)對(duì)單個(gè)波峰和整體光譜帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯示該技術(shù)對(duì)AD海馬組織的敏感性為93.8%，特異性89.6%[14]。有研究者利用近紅外線激發(fā)的拉曼光譜分析尸檢的腦組織切片，其光譜表現(xiàn)有明顯的差異[8]。他們展望將來(lái)有可能將探針經(jīng)鼻道達(dá)篩板送達(dá)腦皮質(zhì)附近，從而實(shí)現(xiàn)活體無(wú)創(chuàng)的AD診斷。

4 拉曼光譜技術(shù)與AD診斷

血液包括血細(xì)胞和血漿，而血漿富含各種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和反映不同器官(包括中樞神經(jīng)系統(tǒng))生理、病理反應(yīng)的代謝產(chǎn)物。人體內(nèi)大約每天有500 ml 腦脊液被吸收到血液中，而血樣采集便捷、相對(duì)無(wú)創(chuàng)、廉價(jià)、臨床應(yīng)用范圍廣，是研究神經(jīng)退行性疾病生物標(biāo)志物的理想對(duì)象，對(duì)血液成分進(jìn)行拉曼光譜分析可能會(huì)為AD的診斷提供一個(gè)全新的領(lǐng)域。

Aβ蛋白是構(gòu)成AD老年斑的主要成分，血小板是其合成、加工和分泌的場(chǎng)所之一。輕度認(rèn)知功能障礙(mild cognitive impairment, MCI)患者血小板的β淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)分泌及合成相關(guān)酶可發(fā)生異常。Barbara 等[15]對(duì)MCI患者血小板中APP不同類型比率進(jìn)行檢測(cè)并隨訪了2年，發(fā)現(xiàn)血小板APPr可預(yù)測(cè)MCI患者向AD的轉(zhuǎn)變。利用顯微拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)癡呆小鼠模型外周血的血小板，也發(fā)現(xiàn)譜帶中1658 cm-1處波峰的強(qiáng)度及757和743 cm-1波峰強(qiáng)度比對(duì)AD的分辨準(zhǔn)確性達(dá)95.8%[16]。

相比同年齡的健康對(duì)照組，AD患者的紅細(xì)胞可變性和運(yùn)氧效率下降，外周血液黏度、紅細(xì)胞聚集性、紅細(xì)胞平均容量和AD高度相關(guān)[17]。Carmona等[18]人應(yīng)用拉曼光譜法和紅外光譜法分析血漿以區(qū)分AD和正常衰老。他們分析了8例輕度AD，16例中度AD，11例中度AD和12例年齡匹配的健康老人，得出來(lái)一系列特異標(biāo)志信號(hào)，包括拉曼光譜中758/743 cm-1、409/423 cm-1和1672/1658 cm-1各自的波峰強(qiáng)度比，980～910 cm-1和750～743 cm-1范圍內(nèi)波譜線下面積以及紅外光譜中β折疊蛋白區(qū)域波譜下面積和1140～1000 cm-1范圍內(nèi)波譜下面積。綜合這些結(jié)果后，對(duì)AD診斷的特異性為92%，敏感性為89%，對(duì)輕度AD的檢測(cè)率近100%[18]，該團(tuán)隊(duì)后來(lái)的研究也得到了類似的結(jié)果[19]。 Ryzhikova等[20]應(yīng)用近紅外拉曼顯微鏡分析研究了AD癡呆患者組、非AD癡呆患者組及認(rèn)知正常組的血清拉曼光譜信號(hào)，并結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)和遺傳算法處理復(fù)雜的光信號(hào)，發(fā)現(xiàn)拉曼光譜技術(shù)對(duì)AD的診斷有巨大潛力。

紅細(xì)胞有一個(gè)獨(dú)特的糖代謝通路，可產(chǎn)生2,3-二磷酸甘油酸(2,3-diphosphoglycerate，2，3-DPG)，它是調(diào)節(jié)血紅蛋白對(duì)氧親和力的重要代謝中間產(chǎn)物。AD患者紅細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)能力長(zhǎng)期慢性代償性增強(qiáng)導(dǎo)致三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)和2，3-DPG濃度降低，血紅蛋白對(duì)氧親和力增強(qiáng)，組織氧供給不足，最終導(dǎo)致認(rèn)知功能下降。Kosenko等[21]認(rèn)為紅細(xì)胞內(nèi)能量代謝紊亂是AD的主要啟動(dòng)機(jī)制，在此過(guò)程中紅細(xì)胞聚集性和變形性受到影響。氧化應(yīng)激使紅細(xì)胞膜上丙二醛濃度升高也會(huì)影響紅細(xì)胞在毛細(xì)血管的移動(dòng)能力，導(dǎo)致血液流變學(xué)異常，加重組織氧供給不足[17]。另外，Aβ與紅細(xì)胞膜結(jié)合，抑制細(xì)胞膜乙酰膽堿酯酶和蛋白激酶的活性，介導(dǎo)紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化[22]。研究者通過(guò)表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)觀察到Aβ40在結(jié)合細(xì)胞膜脂質(zhì)模型時(shí)構(gòu)象發(fā)生變化[23]。同時(shí)紅細(xì)胞內(nèi)某些能量代謝相關(guān)酶受到抑制，從而使得維持細(xì)胞完整的代謝過(guò)程受到抑制，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。老年AD患者的紅細(xì)胞對(duì)Aβ的毒性更敏感。在AD患者病理狀態(tài)下紅細(xì)胞檸檬酸鹽的離子交換和沉降率都發(fā)生異常[24]。研究人員應(yīng)用顯微拉曼光譜儀檢測(cè)Aβ(25-35)誘發(fā)的模型小鼠紅細(xì)胞的變異情況，得到了特異的光譜信號(hào)[25]，這些信號(hào)提示紅細(xì)胞膜上脂質(zhì)[26]和蛋白質(zhì)在AD病理變化下產(chǎn)生了某些變化。

5 結(jié) 論

AD的早期診斷一直以來(lái)是困擾臨床醫(yī)務(wù)工作者的難題，此病的隱匿性、進(jìn)程緩慢及病理生理改變的不確定性加大了對(duì)其診斷和治療的難度。一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，人們對(duì)此進(jìn)行了不懈的探索，獲得了可喜的成果，但仍差強(qiáng)人意。拉曼光譜技術(shù)是疾病診療中的一股新生力量，雖存在著一些不足，如光譜信號(hào)數(shù)據(jù)的有效處理、統(tǒng)一金屬粒子制備對(duì)表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)的可重復(fù)性等[27]，但是它與其他技術(shù)[13,28,29]整合可能更具有發(fā)展?jié)撃?，為AD的研究開(kāi)辟了一片新領(lǐng)域。AD診斷在拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)的介導(dǎo)下亦有了質(zhì)的進(jìn)步。目前諸多報(bào)道都提示單純的生物分子標(biāo)志物無(wú)法理想地診斷AD，越來(lái)越多學(xué)者傾向于蛋白質(zhì)組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)領(lǐng)域試圖構(gòu)建多種生物分子組成的模塊對(duì)疾病進(jìn)行診斷。拉曼光譜技術(shù)所檢測(cè)的光譜信號(hào)正是混合物中各成分信號(hào)的總和，它整體反映研究對(duì)象的變化，可對(duì)患者病理變化進(jìn)行全面分析，對(duì)AD這類機(jī)制復(fù)雜不清的全身性疾病的診斷應(yīng)該會(huì)有所裨益。

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