高位胸段硬膜外阻滯對心房顫動自主神經(jīng)重構(gòu)的影響

曹勇，田曉燕，張苒，代玉川，趙家琦，安毅

高位胸段硬膜外阻滯對心房顫動自主神經(jīng)重構(gòu)的影響

曹勇*，田曉燕，張苒，代玉川，趙家琦，安毅

目的：觀察高位胸段硬膜外阻滯（HTEB）對長期右心耳快速起搏誘發(fā)心房顫動（房顫）犬心房自主神經(jīng)重構(gòu)的影響，并探討心房肌神經(jīng)生長因子（NGF）在心房自主神經(jīng)重構(gòu)中的作用。

心房顫動；自主神經(jīng)重構(gòu);注射，硬膜外；利多卡因

Methods: AF model was established by consistent rapid atrial pacing for 6 weeks. 18 experimental dogs were randomly divided into 3 groups: Sham group, the dogs had no pacing while received normal saline injection; Control group, the dogs had pacing and normal saline injection; HTEB group, the dogs had pacing and 0.5% lidocaine injection for HTEB. n=6 in each group. Atrial myocardium collagen volume fraction (CVF) was examined by Masson staining; sprouting of NGF related protein 43 (GAP43) and tyrosine hydroxylase (TH) were assessed by immunohistochemistry; protein expressions of NGF, GAP43 and TH were measured by Western blot analysis.

Results: Compared with Sham group, HTEB group showed decreased CVF and sprouting of GAP43, TH, P＜0.05; reduced protein expressions of NGF, GAP43 and TH, P＜0.05-0.01. Compared with Sham group, HTEB group presented increased CVF and sprouting of GAP43, TH, P＜0.05-0.01; elevated protein expressions of NGF, GAP43 and TH, P＜0.05.

Conclusion: Long-term rapid atrial pacing induced AF dog had inhomogeneous sprouting of atrial myocardial nerve which may cause autonomic nerve remodeling; NGF played the important role in such process. HTEB could effectively inhibit NGF up-regulation and suppress the autonomic nerve remodeling in experimental dogs.

Key wordsAtrial fbrillation; Autonomic nerve remodeling; Injection, epidural; Lidocaine

(Chinese Circulation Journal, 2016,31:1219.)

心房顫動（房顫）的發(fā)生機制至今仍未明確，目前認(rèn)為房顫是多種機制共同作用的結(jié)果。心房重構(gòu)作為房顫的發(fā)生機制之一已經(jīng)獲得公認(rèn)，房顫時心房重構(gòu)主要包括：電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)和收縮功能重構(gòu)。新近研究表明，除上述三種重構(gòu)外，房顫時心房還存在“自主神經(jīng)重構(gòu)”，主要表現(xiàn)為自主神經(jīng)纖維的顯著萌出及其不均一性分布[1]?！白灾魃窠?jīng)重構(gòu)”可通過多種機制觸發(fā)并維持房顫。因而，有人提出房顫發(fā)生的“自主神經(jīng)機制”。另外，研究發(fā)現(xiàn)[2]，高位胸段硬膜外阻滯（HTEB）可通過抑制交感神經(jīng)系統(tǒng)、血管緊張素系統(tǒng)過度激活，抑制凋亡和氧化應(yīng)激，可用于治療頑固性心絞痛和擴張型心肌病,提示HTEB可能通過多種途徑影響房顫“自主神經(jīng)重構(gòu)”，抑制房顫的發(fā)生和維持。本研究旨在觀察HTEB對房顫犬心房“自主神經(jīng)重構(gòu)”的影響，并探討心房肌神經(jīng)生長因子（NGF）在心房自主神經(jīng)重構(gòu)中的作用。

1 材料與方法

實驗動物：2014-06至2015-06將18只成年健康雜種犬，雌雄不限，體重20～25 kg，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)學(xué)院動物實驗室提供。犬隨機分入假手術(shù)組（n=6）、對照組（n=6）和HTEB組（n=6）。

實驗動物準(zhǔn)備[3]及取材：主要包括麻醉、開胸手術(shù)、硬膜外腔置管術(shù)，在術(shù)后恢復(fù)一周行心房快速起搏6周建立房顫犬模型。起搏6周后快速取出心臟、生理鹽水沖洗，切取左、右心房側(cè)壁心肌組織，固定包埋液氮速凍后-80℃存放。

實驗方法：（1）分組：假手術(shù)組：不起搏、硬膜外腔注射生理鹽水4 ml/次；對照組：起搏、硬膜外腔注射生理鹽水4 ml/次；HTEB組：起搏、硬膜外腔注射0.5%利多卡因4 ml/次。（2）各組犬心房肌纖維化程度測定：取各組犬心房肌石蠟組織切片、脫蠟后，固定于Bouin氏液，常規(guī)脫水包埋，行Masson膠原染色。用計算機圖像分析系統(tǒng)（Motic Images Advanced 3.0）進行膠原半定量分析。（3）免疫組化方法檢測心房肌自主神經(jīng)萌出：選取各組石蠟包埋的左、右房心肌組織行5 μm連續(xù)切片脫蠟、水化，3%過氧化氫孵育10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。滴加兔抗酪氨酸羥化酶（TH）多克隆抗體（1：600，英國Abcam公司）和兔抗神經(jīng)生長相關(guān)蛋白43（GAP43）多克隆抗體（1：600，英國Abcam公司），磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，0.01 mol/L）陰性對照，4℃孵育過夜，PBS沖洗后滴加羊抗兔-HRP二抗（北京中杉生物公司提供），37℃孵育20 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色[4]。酪氨酸羥化酶（TH）標(biāo)志心臟交感神經(jīng)分布，神經(jīng)生長相關(guān)蛋白43（GAP43）標(biāo)志再生神經(jīng)纖維。（4） 蛋白免疫印跡法測定犬心房肌神經(jīng)生長因子 （NGF）、酪氨酸羥化酶（TH）及GAP43蛋白表達：取液氮凍存心房肌組織500 mg，加入裂解液，冰浴勻漿，115g離心40 min。在生物分光光度計上比色分析對上清液進行蛋白測定。取蛋白質(zhì)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，濕轉(zhuǎn)膜，BSA封閉后磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST，pH 7.4，PBS液中加入0.05% Tween20）漂洗。加入兔抗NGF多克隆抗體（1：200 美國Santa Cruz公司）、兔抗TH多克隆抗體（1：200，英國Abcam公司）、兔抗GAP43多克隆抗體（1：400，英國Abcam公司）、小鼠抗GAPDH多克隆抗體（1：10000，上?？党缮锕荆┮豢梗?℃過夜。TBST（pH 7.4，Tris緩沖液中加入0.05% Tween20）漂洗后，分別與堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG及馬抗小鼠IgG（1：1000，北京中杉生物公司）二抗進行雜交，37℃平搖1 h。將濾膜用TBST搖動洗滌3次。NBT/BICP（四唑氮藍/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽）顯色，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)進行蛋白條帶光密度掃描分析。

統(tǒng)計學(xué)方法：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料組間比較采用方差分析。 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組犬心房肌纖維化程度（表1，圖1）

HTEB組及假手術(shù)組犬左、右心房肌CVF值較對照組犬明顯降低（P＜0.05～0.01）。且假手術(shù)組低于HTEB組（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。各組犬左、右心房肌CVF值無差異（P＞0.05），假手術(shù)組心肌間質(zhì)中可見極少量膠原纖維散在分布，排列整齊，細(xì)胞形態(tài)規(guī)整；對照組膠原纖維彌漫性增生分布，膠原明顯增粗，肌絲排列紊亂松散，間質(zhì)明顯纖維化；HTEB組膠原纖維少量增生，膠原有所增粗，肌絲排列不規(guī)整，間質(zhì)可見部分纖維化。

表1 Masson膠原染色三組犬左、右心房肌膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF值）比較（%，n=6，

表1 Masson膠原染色三組犬左、右心房肌膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF值）比較（%，n=6，

注：HTEB：高位胸段硬膜外阻滯。與對照組比較*P＜0.05**P＜0.01；與假手術(shù)組比較△P＜0.05

部位 對照組 HTEB組 假手術(shù)組右心房 6.016±0.273 5.580±0.265* 3.422±0.256**△左心房 5.818±0.303 5.328±0.399* 3.262±0.169**△

圖1 各組犬心房肌Masson膠原染色(×400)

2.2各組犬心房肌神經(jīng)纖維萌出情況

各組犬心房肌GAP43免疫組化染色 （圖2，圖3）：與對照組犬相比，HTEB組和假手術(shù)組犬左、右心房肌GAP43陽性纖維密度顯著降低（P＜0.01），且假手術(shù)組低于HTEB組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。假手術(shù)組左、右心房肌GAP43陽性纖維分布規(guī)整；對照組左、右心房肌GAP43陽性纖維顯著增生，排列明顯紊亂，呈高度不均一性分布，右心房較左心房GAP43陽性纖維增生更明顯（P＜0.05）； HTEB組左、右心房肌GAP43陽性纖維少量增生，呈不均一性分布，右心房GAP43陽性纖維增生更明顯（P＜0.05）。

圖2 免疫組化染色分析各組犬心房肌神經(jīng)生長相關(guān)蛋白43（GAP43）陽性纖維密度

圖3 各組犬心房肌神經(jīng)生長相關(guān)蛋白43（GAP43） 免疫組化染色

各組犬心房肌TH免疫組化染色（表2）： 與對照組犬相比，假手術(shù)組犬左、右心房肌TH陽性纖維密度顯著降低（P＜0.01），對照組犬左心房間TH陽性纖維密度顯著低于右心房（P＜0.05）；HTEB組犬左、右心房肌TH陽性纖維密度明顯低于對照組（P＜0.05），但仍顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01）；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 免疫組化染色分析各組犬心房肌酪氨酸羥化酶（TH）陽性纖維密度（μm2/mm2 ，n， ±s）

表2 免疫組化染色分析各組犬心房肌酪氨酸羥化酶（TH）陽性纖維密度（μm2/mm2 ，n， ±s）

注：HTEB：高位胸段硬膜外阻滯。與對照組比較*P＜0.05**P＜0.01；與假手術(shù)組比較△△P＜0.01；與同組右心房比較▲P＜0.05

部位 對照組 HTEB組 假手術(shù)組右心房 4514.2±293.7 4164.0±184.3*△△ 684.4±26.1**左心房 4166.8±339.3▲ 3928.1±143.4*△△ 651.0±38.2**

各組犬心房肌NGF,GAP43和TH蛋白表達情況（表3）：與對照組犬相比，假手術(shù)組犬左、右心房肌NGF 蛋白表達降低（P＜0.01）；對照組犬左心房心房肌NGF 蛋白表達較右心房降低（P＜0.05）；HTEB組犬左、右心房肌NGF蛋白表達較對照組降低（P＜0.05），但仍高于假手術(shù)組（P＜0.05）；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組犬相比，假手術(shù)組犬左、右心房肌GAP43蛋白表達降低（P＜0.01）；對照組犬左心房心房肌GAP43 蛋白表達較右心房降低（P＜0.05）；HTEB組犬左、右心房肌GAP43 蛋白表達較對照組降低（P＜0.05），但仍高于假手術(shù)組（P＜0.05）；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組犬相比，假手術(shù)組犬左、右心房肌TH蛋白表達降低（P＜0.01）；對照組犬左心房心房肌TH 蛋白表達較右心房降低（P＜0.05）；HTEB組犬左、右心房肌TH蛋白表達較對照組降低（P＜0.05），但仍高于假手術(shù)組（P＜0.01）；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 半定量分析各組犬心房肌蛋白含量（NGF/GAPDH光密度比值）(n=6，）

表3 半定量分析各組犬心房肌蛋白含量（NGF/GAPDH光密度比值）(n=6，）

注：GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶;NGF：神經(jīng)生長因子；GAP43：神經(jīng)生長相關(guān)蛋白43；TH：酪氨酸羥化酶。與對照組比較*P＜0.05**P＜0.01；與假手術(shù)組比較△P＜0.05；與同組右心房比較▲P＜0.05

部位 對照組 HTEB組 假手術(shù)組NGF蛋白右心房 0.671±0.061 0.606±0.037*△ 0.537±0.027**左心房 0.618±0.029▲ 0.562±0.015*△ 0.497±0.045**GAP43蛋白右心房 0.686±0.034 0.626±0.034*△ 0.562±0.042**左心房 0.635±0.047▲ 0.585±0.020*△ 0.518±0.046**TH蛋白右心房 0.571±0.031 0.530±0.029**△ 0.124±0.007**左心房 0.536±0.031▲ 0.496±0.036**△ 0.111±0.010**

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)長期快速右心耳起搏建立的房顫犬模型，其心房肌NGF蛋白表達明顯增加，TH及GAP43蛋白表達明顯增加；心房肌存在顯著神經(jīng)纖維萌出，右心房神經(jīng)纖維萌出量顯著多于左心房，且萌出神經(jīng)纖維呈高度不均一性分布。HTEB可顯著降低房顫犬心房肌NGF蛋白表達上調(diào)，抑制TH及GAP43蛋白表達上調(diào)；顯著抑制心房肌神經(jīng)萌出及不均一性分布，阻止心房自主神經(jīng)重構(gòu)[5,6]。同時，房顫犬心房肌GAP43陽性纖維密度較TH 陽性纖維密度高[6]，而TH陽性纖維密度未有顯著差別，提示房顫犬心房肌萌出神經(jīng)并非都是交感神經(jīng)，可能也存在迷走神經(jīng)萌出。

房顫時心房肌自主神經(jīng)萌出與NGF、TH、GAP43蛋白表達相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，NGF在心室神經(jīng)重構(gòu)過程中發(fā)揮重要作用，能夠觸發(fā)神經(jīng)纖維再生[7,8]。NGF通過高親和力酪氨酸激酶受體（TrKs，主要為TrKA）和低親和力受體P75NTR對神經(jīng)元的生長、分化和損傷后修復(fù)進行調(diào)節(jié)。TrKs轉(zhuǎn)導(dǎo)的一般是“正性”信號，如維持神經(jīng)元的存活、生長；而P75NTR多表現(xiàn)抑制神經(jīng)生長作用。在衰竭心肌中存在去交感神經(jīng)支配，這與心室肌神經(jīng)細(xì)胞中TrKA表達的減少密切相關(guān)[9]。另外，Zhou等[7]研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死犬左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)NGF蛋白表達明顯增加，因此局部梗死的心室肌誘導(dǎo)NGF表達增加，通過軸漿運輸被逆轉(zhuǎn)運至左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)，觸發(fā)心臟神經(jīng)萌出。GAP43作用于神經(jīng)元觸發(fā)神經(jīng)末梢萌發(fā)[10]。在轉(zhuǎn)基因小鼠中GAP43過度表達將導(dǎo)致新的突觸形成及神經(jīng)萌處[11,12]。因此，可通過檢測心房肌NGF、TH、GAP43蛋白表達評估神經(jīng)纖維萌出情況。

房顫時心房發(fā)生電、結(jié)構(gòu)、功能重構(gòu)導(dǎo)致局部神經(jīng)損傷。Gould等[12]的研究表明，慢性持續(xù)房顫患者心房肌交感神經(jīng)存在不均一性增加。然而，Gould等[12]研究并未發(fā)現(xiàn)NGF mRNA水平增加，可能是mRNA水平并不能代表蛋白表達情況。此外，本研究發(fā)現(xiàn)房顫心房肌GAP43及TH蛋白表達明顯增加，且右心房蛋白表達較左心房高。GAP43蛋白表達同NGF蛋白表達存在高度相關(guān)性，NGF在GAP43表達減少時不能誘發(fā)神經(jīng)萌出[13]。因此我們推測NGF可能通過上調(diào)GAP43表達來誘發(fā)心臟神經(jīng)萌出。然而，房顫心房肌神經(jīng)萌出的作用機制仍不清楚，需進一步研究來證實。

HTEB可改善房顫時心房肌自主神經(jīng)重構(gòu)。HTEB通過將麻醉平面控制在胸1-5脊髓階段，抑制心臟交感神經(jīng)節(jié)前纖維，致心交感張力減弱，副交感張力相對增強，減少心臟節(jié)律障礙發(fā)生[14]。因此，HTEB能減少腎上腺素誘發(fā)心律失常的發(fā)生，這與HTEB能夠延長心肌細(xì)胞動作電位時程(APD)、延長有效不應(yīng)期（AERP）密切相關(guān)[15]。研究發(fā)現(xiàn)，局部血管緊張素II含量增加可促進組織NGF表達，促進神經(jīng)萌出。HTEA可抑制機體腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活[16]，間接抑制NGF表達上調(diào)。本研究證實，HTEB組TH 、GAP43免疫組化染色陽性纖維密度較對照組明顯減少，但仍較假手術(shù)組增加，提示HTEB可顯著抑制房顫心房肌神經(jīng)萌出。同時，HTEB組NGF蛋白表達較對照組明顯減少，但仍較假手術(shù)組增加；HTEB組GAP43及TH蛋白表達較對照組明顯減少，但仍較假手術(shù)組增加。我們認(rèn)為可能通過抑制房顫心肌NGF表達上調(diào)，抑制心臟神經(jīng)萌出及不均一分布。HTEB防治房顫發(fā)生的具體機制至今仍未明確，仍有待進一步研究[17]。

本研究局限性：本研究只探討了房顫犬心房肌自主神經(jīng)重構(gòu)中交感神經(jīng)重構(gòu)的情況及其機制，未對房顫時心房肌迷走神經(jīng)重構(gòu)情況作研究分析。此外，心力衰竭可導(dǎo)致心房、心室自主神經(jīng)功能失調(diào)和自主神經(jīng)重構(gòu)[18]，因此，研究中需注意排除合并心力衰竭的動物模型，減少心力衰竭對自主神經(jīng)重構(gòu)的干擾。

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Impact of High Thoracic Epidural Blockade on Autonomic Nerve Remodeling in Experimental Dogs With Atrial Fibrillation

CAO Yong**, TIAN Xiao-yan, ZHANG Ran, DAI Yu-chuan, ZHAO Jia-qi, AN Yi.
Qingdao University Medical College, Qingdao (266000), Shandong, China Corresponding Author: AN Yi, Email: anyiqingdao@126.com

Objective: To observe the impact of high thoracic epidural blockade (HTEB) on atrial autonomic nerve remodeling in dogs with atrial fbrillation (AF) induced by long-term rapid right atrial appendage pacing and to explore the efect of nerve growth factor (NGF) on atrial autonomic nerve remodeling.

2016-03-08)

(編輯：汪碧蓉)

266000 山東省青島市，青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院 心內(nèi)科 （曹勇，安毅）；濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 健康管理與社區(qū)服務(wù)中心（田曉燕），心內(nèi)科（張苒、代玉川、趙家琦）

曹勇 主治醫(yī)師 博士 主要從事心房顫動等心血管相關(guān)疾病診治*現(xiàn)在山東省濟寧市，濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 心內(nèi)科工作**Now Working in Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Jining Medical College, Email：caoyong0419@163.com 通訊作者：安毅 Email：anyiqingdao@126.com

R541

A

1000-3614（2016）12-1219-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2016.12.016

方法：18只犬隨機分為假手術(shù)組、對照組和HTEB組。對照組和HTEB組犬給予持續(xù)快速心房起搏建立房顫模型，HTEB組給予硬膜外腔注射0.5%利多卡因行高位胸段硬膜外阻滯。通過Masson染色檢測犬心房肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)改變，免疫組化法測定犬心房肌神經(jīng)生長相關(guān)蛋白43（GAP43）及酪氨酸羥化酶（TH）表達，蛋白免疫印跡法檢測犬心房肌NGF、GAP43及TH蛋白表達情況。

結(jié)果：與對照組相比，右心耳快速起搏6周后，HTEB組犬心房肌CVF值顯著降低； GAP43及TH神經(jīng)萌出量顯著減少（P＜0.05）; NGF、GAP43及TH蛋白表達量顯著減少（P＜0.05～0.01）。與假手術(shù)組比較，HTEB組犬心房肌CVF值顯著增加；GAP43及TH神經(jīng)萌出量顯著增加（P＜0.05～0.01）; NGF、GAP43及TH蛋白表達量顯著增加（P＜0.05）。

結(jié)論：長期右心耳快速起搏誘發(fā)犬房顫致心房肌神經(jīng)不均一萌出，誘發(fā)自主神經(jīng)重構(gòu)，而NGF在其中發(fā)揮重要作用。HTEB可有效阻止房顫犬心房肌NGF表達上調(diào)，減輕自主神經(jīng)重構(gòu)。