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    心肌細胞中微小核糖核酸 let-7c對肌營養(yǎng)素基因表達的調(diào)控作用

    2017-01-07 03:48:21王玉瑤王玉璇翟翔劉銘解軍
    中國循環(huán)雜志 2016年12期
    關(guān)鍵詞:前體營養(yǎng)素熒光素酶

    王玉瑤,王玉璇,翟翔,劉銘,解軍

    心肌細胞中微小核糖核酸 let-7c對肌營養(yǎng)素基因表達的調(diào)控作用

    王玉瑤,王玉璇,翟翔,劉銘,解軍

    目的:探討心肌細胞中微小核糖核酸(miR)let-7c(miR-let-7c)對肌營養(yǎng)素基因表達是否具有調(diào)控作用以及可能的作用機制。

    微小核糖核酸;肌營養(yǎng)素;核轉(zhuǎn)錄因子-κB

    (Chinese Circulation Journal, 2016,31:1215.)

    微小核糖核酸(miR)通過降解靶mRNA或抑制靶mRNA的翻譯來調(diào)控基因表達[1]。最近研究發(fā)現(xiàn)miR-let-7家族在心臟組織中高表達,參與許多重要的心臟功能調(diào)控[2],miR-let-7c可能在心肌肥厚中發(fā)揮重要作用,但其具體作用靶標和機制仍不清楚[3]。肌營養(yǎng)素(myotrophin, MTPN)是從原發(fā)性高血壓大鼠的心臟中分離得到的低分子量蛋白,經(jīng)研究證實肌營養(yǎng)素參與心臟肥厚的起始環(huán)節(jié),并在心臟肥厚向心力衰竭的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[4-7]。生物信息學(xué)分析表明,肌營養(yǎng)素mRNA 的3'非編碼區(qū)(3'-UTR)可能受miR-let-7c調(diào)控,但尚少有切實實驗證據(jù)的支持。我們擬構(gòu)建攜帶有肌營養(yǎng)素mRNA 3'-UTR的重組質(zhì)粒載體,與miR-let-7c前體共同轉(zhuǎn)入Hela細胞,采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析miR-let-7c對肌營養(yǎng)素表達的調(diào)控作用。進一步通過轉(zhuǎn)染大鼠心肌細胞H9c2,研究miR-let-7c上調(diào)后對肌營養(yǎng)素基因在心肌細胞中表達的影響,以及對肥厚關(guān)鍵信號分子核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)活性的調(diào)控作用,研究結(jié)果有助于闡明miR-let-7c在心肌肥厚中的作用機制。

    1 材料和方法

    實驗材料和試劑:胰蛋白酶購自Sigma公司(美國);胎牛血清、達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司(美國);miR-let-7c前體及抑制劑、pMIRREPORTTMmiRNA表達報告載體購自Ambion公司(美國);Taqman 實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)相關(guān)試劑購自ABI公司(美國);肌營養(yǎng)素抗體、NF-κB p65抗體購自Santa Cruz公司(美國)。

    構(gòu)建熒光素酶報告系統(tǒng):合成含肌營養(yǎng)素3'-UTR關(guān)鍵區(qū)域的核酸片段,序列為: 5'-TATTAAGACCAAG TCATGCAATAATTGAATGTACCTCAAATTTTTA-3', 經(jīng)PCR,HindⅢ和SpeⅠ雙酶切,將上述序列克隆入pMIR-REPORT熒光素酶報告基因表達載體,重組載體經(jīng)測序驗證后命名為重組熒光素酶報告基因表達載體(pMIR-MTPN)。Hela細胞培養(yǎng)在含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,轉(zhuǎn)染前1天給細胞換液至無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,每孔接種1×105細胞于24孔細胞培養(yǎng)板中,每孔200 ng 重組載體DNA pMIR-MTPN和miR-let-7c前體或者陰性對照(終濃度為50 nmol/L)與Lipofectamine 2000試劑混合后分別對Hela細胞進行共轉(zhuǎn)染,分為3個實驗組(n=3):(1)pMIR-MTPN單純載體組;(2)pMIR-MTPN +miR前體陰性對照組;(3)pMIRMTPN + miR-let-7c前體組。各組細胞培養(yǎng)48 h后,用磷酸鹽(PBS)緩沖液洗滌三遍,加入被動裂解緩沖液(PLB),細胞裂解液檢測并計算標準熒光素酶活性(熒光素酶活性檢測儀,美國Turner 公司)。

    miR轉(zhuǎn)染大鼠H9c2心肌細胞:大鼠H9c2細胞株購自中國科學(xué)院細胞庫,于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液,5% 二氧化碳(CO2),37℃條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染實驗前,將終濃度為50 nM miR-let-7c前體或抑制劑100 μl DMEM與加入5 μl Lipofectamine 2000試劑100 μl DMEM配成混合液體,H9c2細胞的6孔板中的細胞中加入1.8 ml無血清DMEM培養(yǎng)液后,加入該混合液體,37℃孵育6 h,去掉轉(zhuǎn)染液,換2.5 ml DMEM培養(yǎng)48 h,進行后續(xù)實驗。實驗分為4個組(n=3):(1)miR陰性對照組;(2)miR-let-7c前體組;(3)抑制物陰性對照組;(4) miR-let-7c抑制物組。

    實時定量PCR:提取轉(zhuǎn)染后的H9c2細胞總RNA,每份標保本取10 ng RNA進行逆轉(zhuǎn)錄,逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋至30 μl后進行實時定量PCR檢測,反應(yīng)體系:0.75 μl 20×探針,2 μl稀釋后逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,7.5 μl 2×Taqman Universal PCR Master Mix Ⅱ,4.75 μl無核酸酶水。反應(yīng)條件:95℃,10 min;95℃,15 s,60℃,60 s,40個循環(huán)。使用U6作為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCt方法計算分析各組miR-let-7c mRNA的相對表達量。

    蛋白質(zhì)提取及Western blot:裂解液裂解轉(zhuǎn)染后的H9c2細胞,提取細胞總蛋白或分離提取細胞核蛋白,BCA法[8]測定樣品蛋白濃度。等量(50 μg)蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙稀酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜,分別加入肌營養(yǎng)素一抗(稀釋倍數(shù)1:1 000)、NF-κB p65以及β-微管蛋白或β-肌動蛋白內(nèi)參一抗(稀釋倍數(shù)1:1 000),于4℃孵育過夜,洗膜后,加辣根過氧化物酶標記二抗(稀釋倍數(shù)1:5 000),室溫孵育2 h。X光片顯色。使用ImageJ軟件分析各條帶與內(nèi)參條帶的吸光度值之比。

    統(tǒng)計學(xué)方法:所有實驗均至少重復(fù)三次,結(jié)果取平均值,數(shù)據(jù)表達為均數(shù)±標準差,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用Student’s t檢驗,統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS 13.0軟件進行,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義(雙側(cè))。

    2 結(jié)果

    2.1miR-let-7c作用于肌營養(yǎng)素mRNA 靶向關(guān)系驗證

    雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗結(jié)果表明(圖1),在Hela細胞中,與pMIR-MTPN+miR前體陰性對照組相比,pMIR-MTPN+ miR-let-7c前體組熒光素酶活性顯著降低,下降了41%[(59.30±9.90)% vs(98.10±15.10)%,P<0.05],表明miR-let-7c能夠直接作用于肌營養(yǎng)素mRNA 3'-UTR區(qū)域。

    圖1 熒光素酶活性檢測miR-let-7c與肌營養(yǎng)素mRNA 3'-UTR區(qū)域相互作用(n=3)

    2.2miR-let-7c轉(zhuǎn)染大鼠H9c2心肌細胞效果

    采用Taqman實時定量PCR法檢測 miR轉(zhuǎn)染效果,結(jié)果表明(圖2),miR-let-7c前體轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞后,與miR陰性對照組相比,miR-let-7c前體組miR-let-7c表達水平顯著升高;而miR-let-7c抑制物轉(zhuǎn)染后,與抑制物陰性對照組相比,miR-let-7c抑制物組miR-let-7c表達水平則顯著降低(0.42±0.11) 倍。差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    圖2 Taqman實時定量PCR法檢測miR-let-7c前體及抑制物轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞后miR-let-7c表達水平(n=3)

    2.3miR-let-7c對肌營養(yǎng)素蛋白表達具有抑制作用

    Western blot法檢測miR-let-7c轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞后肌營養(yǎng)素蛋白表達,結(jié)果表明(圖3),miR-let-7c前體組與miR陰性對照組相比,肌營養(yǎng)素蛋白表達水平顯著降低(0.28±0.05 vs 0.90±0.09);而miR-let-7c抑制物轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞后,miR-let-7c抑制物組與抑制物陰性對照組比較肌營養(yǎng)素蛋白表達水平顯著升高(1.14±0.09 vs 0.44±0.09)。差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    圖3 蛋白免疫印跡法檢測miR-let-7c對大鼠心肌細胞中肌營養(yǎng)素蛋白表達水平的影響(n=3)

    圖4 蛋白免疫印跡法檢測miR-let-7c對大鼠心肌細胞核中NF-κB p65蛋白表達的影響(n=3)

    2.4miR-let-7c 轉(zhuǎn)染心肌細胞后NF-κB蛋白水平變化

    Western blot法檢測miR-let-7c轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞后細胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達,結(jié)果表明(圖4),miR-let-7c前體組與miR陰性對照組相比,NF-κB p65蛋白表達水平顯著降低(0.25±0.06 vs 0.75±0.07);而miR-let-7c抑制物組與抑制物陰性對照組比較,NF-κB p65蛋白表達水平顯著升高(1.09±0.05 vs 0.71±0.06)。差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    3 討論

    心肌肥厚是影響心血管疾病發(fā)病率和病死率的獨立危險因素。心肌肥厚過程受到多種因素刺激和多種信號通路調(diào)控,尋找參與調(diào)控心肌肥厚的關(guān)鍵因子,揭示心肌肥厚的分子機制一直以來都是研究熱點[9]。近年來,隨著對miR功能研究的不斷深入,人們已經(jīng)明確證實了一些miR參與心肌肥厚的調(diào)控通路[10-12],但仍有許多miR在心肌肥厚中的調(diào)控機制尚待揭示。miR-let-7是最早被發(fā)現(xiàn)的miR之一,在各物種間高度保守。之前大量研究多關(guān)注于miR-let-7在腫瘤抑制方面的作用[1,13]。近年來,一系列研究表明,miR-let-7家族還參與心血管系統(tǒng)分化、發(fā)育、疾病等諸多生理病理學(xué)過程的調(diào)控,其中miR-let-7c可能參與了心肌肥厚過程,但其靶標及具體作用機制目前仍不清楚[2,3]。

    miR的5’端第2~7或2~8個核苷酸序列稱為“種子序列”,這一區(qū)域具有高度的保守性,與之互補的靶序列在不同物種中通常也具有高度的保守性,種子序列對于miR識別特異性的靶序列是必需的[14]。肌營養(yǎng)素是蛋白分子量為12 kD的錨定重復(fù)序列蛋白,在哺乳動物的組織中廣泛表達[15]。一系列基礎(chǔ)及臨床實驗研究均表明,肌營養(yǎng)素是心肌肥厚和心力衰竭的起始因子[4-7]。我們前期通過文獻調(diào)研和生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)肌營養(yǎng)素基因3'-UTR區(qū)域存在與miR-let-7c種子序列識別和結(jié)合的靶序列,克隆該段序列,并進一步通過分子及細胞生物學(xué)實驗對miR-let-7c能否調(diào)控肌營養(yǎng)素基因表達進行了研究,熒光素酶報告系統(tǒng)實驗結(jié)果證實了miR-let-7c能夠直接作用于肌營養(yǎng)素基因3'-UTR相應(yīng)序列,從而對肌營養(yǎng)素基因表達產(chǎn)生抑制作用。進一步通過在心肌細胞中過表達miR-let-7c前體,發(fā)現(xiàn)miR-let-7c能夠降低肌營養(yǎng)素在心肌細胞中的蛋白表達水平,從而證實了肌營養(yǎng)素是miR-let-7c在心肌肥厚過程中的調(diào)控靶蛋白之一。此外,研究表明,NF-κB信號通路是肌營養(yǎng)素發(fā)揮心肌肥厚調(diào)控的關(guān)鍵分子通路[5],NF-κB通路活化時,NF-κB p65轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi),從而行使一系列調(diào)控作用。本研究結(jié)果表明,miR-let-7c上調(diào)后NF-κB蛋白水平降低,這可能是其參與心肌肥厚的重要分子機制之一。

    綜上所述,本研究在分子、細胞水平上對miR-let-7c與肌營養(yǎng)素基因3'-UTR位點的相互作用以及肥厚關(guān)鍵分子NF-κB的影響進行了驗證,結(jié)果表明,miR-let-7c可能通過調(diào)節(jié)肌營養(yǎng)素基因參與心肌肥厚過程,且該過程涉及NF-κB信號通路,這一結(jié)果有助于闡明miR-let-7c在心肌肥厚中的具體分子機制。

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    Regulative Effect of microRNA let-7c on Myotrophin Gene Expression in Rat’s H9c2 Cardiac Myocytes

    WANG Yu-yao, WANG Yu-xuan, ZHAI Xiang, LIU Ming, XIE Jun.
    Department of Biochemistry and Molecular Biology, Shanxi Medical University, Taiyuan (030001), Shanxi, China

    XIE Jun, Email: xiejun1968@126.com

    Objective: To explore weather microRNA let-7c (miR-let-7c) could regulate myotrophin gene expression in rat’s H9c2 cardiac myocytes with possible mechanisms.Methods: Recombinant plasmid carrying 3′ untranslated region (3′-UTR) of myotrophin and miRNA precursor of let-7c was co-transfected into Hela cells to construct the luciferase reporter system in order to measure luciferase activity. Rat’s H9c2 cardiac myocytes were cultured. The let-7c gene expression was detected by Taqman probe-based real-time PCR after let-7c miRNA precursor or let-7c miRNA inhibitor transfection respectively; protein expressions of myotrophin and nuclear factorκB (NF-κB) were examined by Western blot analysis.Results: Luciferase activity examination indicated that compared with recombinant luciferase gene expression carrier (pMIR-MTPN)+miR precursor negative control group, pMIR-MTPN+miR-let-7c miRNA precursor group showed reduced luciferase activity (59.30±9.90) % vs (98.10±15.10) %. Western blot analysis presented that compared with miR negative control group, miR-let-7c precursor group had decreased protein expressions of myotrophin (0.28±0.05) vs (0.90±0.09) and NF-κB (0.25±0.06) vs (0.75±0.07); in contrast, compared with Negative inhibitor group, miR-let-7c inhibitor group had increased protein expressions of myotrophin (1.14±0.09) vs (0.44±0.09) and NF-κB (1.09±0.05) vs (0.71±0.06), all P<0.05.Conclusion: miR-let-7c could inhibit myotrophin expression via acting on its 3′-UTR domain and may also infuence NF-κB signaling pathway in rat’s H9c2 cardiac myocytes.

    microRNA; Myotrophin; Nuclear factor-κB

    2016-06-20)

    (編輯;曹洪紅)

    國家自然科學(xué)基金(81500364);山西省基礎(chǔ)研究項目(2015021187);山西省高等學(xué)??萍紕?chuàng)新項目(2015149)

    030001 山西省太原市,山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室

    王玉瑤 講師 博士 主要從事心血管疾病相關(guān)基因功能研究 Email:wyybio@163.com 通訊作者:解軍 Email: xiejun1968@126.com.

    R541

    A

    1000-3614(2016)12-1215-04

    10.3969/j.issn.1000-3614.2016. 12.015

    方法:首先構(gòu)建攜帶肌營養(yǎng)素基因3'非編碼區(qū)(3'-UTR)片段的熒光素酶報告基因載體,與miR-let-7c前體共轉(zhuǎn)染Hela細胞,雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測熒光素酶活性以驗證miR-let-7c與肌營養(yǎng)素基因的靶向調(diào)控關(guān)系。進而培養(yǎng)大鼠心肌細胞H9c2,Taqman實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)法檢測miR轉(zhuǎn)染效果,蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測miR-let-7c及miR-let-7c抑制物轉(zhuǎn)染心肌細胞后肌營養(yǎng)素蛋白表達,以及心肌肥厚相關(guān)信號通路分子核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的活性變化。

    結(jié)果:熒光素酶活性實驗結(jié)果表明,與重組熒光素酶報告基因表達載體(pMIR-MTPN)+ miR前體陰性對照組相比,pMIR-MTPN+ miR-let-7c前體組熒光素酶活性顯著降低[(59.30±9.90)% vs ( 98.10±15.10)%]。Western blot結(jié)果表明,miR-let-7c前體組與miR陰性對照組相比,肌營養(yǎng)素蛋白表達水平顯著降低[(0.28±0.05) vs (0.90±0.09)],此外,NF-κB蛋白水平顯著降低[(0.25±0.06) vs ( 0.75±0.07)];相反,miR-let-7c抑制物組與抑制物陰性對照組相比,肌營養(yǎng)素蛋白表達水平顯著升高[(1.14±0.09) vs(0.44±0.09)],同時,NF-κB蛋白水平也顯著升高[(1.09±0.05)vs(0.71±0.06)],差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05)。

    結(jié)論:miR-let-7c能夠通過作用于3'UTR區(qū)域,抑制肌營養(yǎng)素基因表達,并影響心肌肥厚關(guān)鍵信號通路分子NF-κB的活性。

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