麻風(fēng)分枝桿菌qPCR鑒定方法的建立及評(píng)價(jià)

溫 晶 王 川 孫樂樂 陳明飛,2 付希安 王建文,2 劉 紅,2 張福仁,2

·技術(shù)與方法·

麻風(fēng)分枝桿菌qPCR鑒定方法的建立及評(píng)價(jià)

溫 晶1王 川1孫樂樂1陳明飛1,2付希安1王建文1,2劉 紅1,2張福仁1,2

目的： 建立麻風(fēng)分枝桿菌qPCR鑒定方法并評(píng)價(jià)該方法的敏感性和特異性。方法： 應(yīng)用qPCR對(duì)135例麻風(fēng)及其他疾病組織蠟塊樣本中麻風(fēng)分枝桿菌特異性基因Ag85B和SodA進(jìn)行檢測(cè)，建立結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)99例病種未知組織臘塊樣本和89例病種未知新鮮皮膚組織樣本以qPCR檢測(cè)麻風(fēng)特異性基因Ag85B和SodA，評(píng)價(jià)該檢測(cè)方法的特異性和敏感性。結(jié)果： qPCR技術(shù)檢測(cè)新鮮皮膚組織麻風(fēng)特異性基因Ag85B和SodA的特異性和敏感性分別為100%和91.7%，高于組織蠟塊樣本。結(jié)論： qPCR技術(shù)可用于麻風(fēng)菌的檢測(cè)。

麻風(fēng)； 麻風(fēng)分枝桿菌； qPCR； 評(píng)價(jià)

麻風(fēng)(leprosy)是麻風(fēng)分枝桿菌感染易感個(gè)體，特異性侵犯皮膚和周圍神經(jīng)組織，晚期可致殘的一種慢性傳染病，可根據(jù)查菌指數(shù)分為多菌型(multibacillary, MB)和少菌型(paucibacillary, PB)兩個(gè)亞型[1]。該病曾在全球廣泛流行，嚴(yán)重危害人民的身心健康。目前全球每年仍有逾20萬的新登記病例，我國每年新登記病例數(shù)始終在1000例左右[2,3]。

由于麻風(fēng)分枝桿菌無法體外培養(yǎng)，此病的診斷主要為組織涂片查菌結(jié)合組織病理學(xué)與臨床表現(xiàn)的方法。有報(bào)道顯示，每克組織中含有104個(gè)病原菌才能通過抗酸染色的方式被檢測(cè)到，足以說明查菌方式靈敏度的不足[4,5]。同時(shí)，抗酸染色的原理基于分枝桿菌中的分枝菌酸與染料的結(jié)合而顯色，沒有種屬的特異性，存在誤診的可能性[6]。傳統(tǒng)組織病理學(xué)依據(jù)組織形態(tài)學(xué)改變，如肉芽腫病變、有無明顯“浸潤帶”特點(diǎn)等，在缺乏典型的組織形態(tài)特點(diǎn)時(shí)往往難以確診，不能及時(shí)有效地為臨床治療提供有力的診斷依據(jù)。

近年來，將實(shí)時(shí)熒光定量與普通 PCR技術(shù)相結(jié)合的qPCR 技術(shù)的快速發(fā)展，以其能夠?qū)δ繕?biāo)微生物進(jìn)行特異性定量及定性檢測(cè)，已被成功用于微生物快速檢測(cè)[7,8]。麻風(fēng)分枝桿菌基因組中種屬特異性的36kDa抗原、18kDa抗原、65kDa抗原、groEL、Ag85B、SodA、16S rRNA基因?yàn)榇朔椒ㄔ跈z測(cè)麻風(fēng)分枝桿菌中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)[9-14]。

本研究旨在以特異性基因?yàn)榛A(chǔ)，建立麻風(fēng)分枝桿菌qPCR檢測(cè)技術(shù)，然后通過對(duì)其靈敏度和特異度進(jìn)行評(píng)價(jià)，為臨床上輔助麻風(fēng)診斷提供一種快捷有效的手段。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 蠟塊組織樣本 均來自我院病理科蠟塊組織樣本庫，選取1990-2009年麻風(fēng)患者85例，其中多菌型(MB)65例，少菌型(PB)20例，其他疾病患者50例。以上樣本用于qPCR方法建立。再次選取蠟塊組織99例，所選病例疾病未知，用于qPCR方法靈敏性與特異性評(píng)價(jià)。所有組織均切取厚度為8 μm蠟片，每例組織切取8片。上述麻風(fēng)的診斷均符合國家GB15973-1995麻風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)和分型標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 臨床病例組織樣本 皮損組織樣本(6 mm3)均來自2014-2015年我院門診疑似麻風(fēng)患者，共計(jì)89例。以上該研究的參與者均簽署了知情同意書。

1.2 組織DNA的提取

1.2.1 蠟塊組織DNA的提取 切取的8片組織蠟片立即放置于1.5 mL滅菌EP管中，然后向管中加入1 mL二甲苯中，充分溶解并置換石蠟。棄去上清后加入30 μL蛋白酶K，90℃條件下解交聯(lián)裂解組織，然后按照蠟塊組織DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)操作說明書進(jìn)行操作，最后DNA溶解于TE緩沖液中備用。

1.2.2 皮損組織DNA的提取 臨床收取的新鮮皮損組織(6 mm3)在生物安全柜中利用手術(shù)刀片切成很小的碎塊，將組織碎塊轉(zhuǎn)移至1.5 mL無菌EP管中加入30 μL蛋白酶K，56℃條件下裂解組織，然后按照組織和全血DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)操作說明書進(jìn)行操作，最后DNA溶解于TE緩沖液中備用。

1.3 麻風(fēng)分枝桿菌qPCR檢測(cè) 以麻風(fēng)分枝桿菌特異性基因Ag85B和SodA為檢測(cè)目標(biāo)，利用Primer Expess 3.0設(shè)計(jì)引物及探針。PCR反應(yīng)體系體積為30 μL，其中包括2xTaqMan Gene Expression Mater Mix15 μL，20 μM上下游引物各0.75 μL，10 μM Taqman探針0.6 μL，模板DNA 2 μL，退火溫度為60℃，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為40，利用ABI 7300熒光定量PCR系統(tǒng)(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 麻風(fēng)分枝桿菌檢出率，qPCR靈敏性及特異性等數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件完成。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 麻風(fēng)蠟塊組織檢出率及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定 以50份其他疾病蠟塊組織中qPCR擴(kuò)增結(jié)果無1例陽性即保證特異性為100%同時(shí)最大可能提高靈敏性為原則，同時(shí)參考以往同類文獻(xiàn)報(bào)道[15],將麻風(fēng)分枝桿菌qPCR檢測(cè)臨界擴(kuò)增Ct值定為35，判讀標(biāo)準(zhǔn)為，當(dāng)Ag85B和SodA擴(kuò)增Ct值均≤35時(shí)，結(jié)果判定為陽性，當(dāng)Ag85B和SodA擴(kuò)增Ct值均>35時(shí)，結(jié)果判定為陰性，若出現(xiàn)一個(gè)基因擴(kuò)增Ct值≤35而另一個(gè)基因擴(kuò)增Ct值>35時(shí)，則重新檢測(cè)，根據(jù)重新檢測(cè)的結(jié)果按照上述標(biāo)準(zhǔn)再進(jìn)行判讀?；谝陨蠘?biāo)準(zhǔn)，麻風(fēng)患者的總體檢出率為82.4%，其中MB型患者的檢出率為89.2%，PB型患者的檢出率為60%見表1。檢測(cè)陰性的麻風(fēng)患者樣本中，有5例MB型患者(占檢測(cè)陰性MB型樣本的71.4%)和3例PB型患者(占檢測(cè)陰性PB型樣本的37.5%)出現(xiàn)了PCR擴(kuò)增，但是Ct值>35，綜上可見，MB型患者的檢出率高于PB型患者，且年代越近的樣本的檢出率越高，原因可能為蠟塊組織保存時(shí)間過長造成了病原體DNA的降解，影響了檢出率。

表1 麻風(fēng)蠟塊組織中qPCR技術(shù)檢出率

2.2 qPCR方法在蠟塊樣本中的靈敏性及特異性分析 qPCR方法檢測(cè)病種未知的99例蠟塊組織樣本，麻風(fēng)分枝桿菌陽性樣本為25例，陰性樣本74例；99例蠟塊組織樣本的病理結(jié)合查菌診斷為28例麻風(fēng)，其余為其他疾病，經(jīng)對(duì)比分析，該方法的檢測(cè)敏感性為82.1%，特異性為97.2%(表2)。由于蠟塊組織保存時(shí)間較長及蛋白交聯(lián)給組織裂解帶來的困難，我們推測(cè)該方法在新鮮皮損組織中敏感性和特異性會(huì)更高。

表2 蠟塊組織中qPCR技術(shù)靈敏性及特異性分析

2.3 qPCR方法在新鮮皮膚樣本中的靈敏性及特異性分析 2014-2015年，我院門診共收集89例疑似麻風(fēng)患者皮損組織，利用qPCR技術(shù)對(duì)其均進(jìn)行了麻風(fēng)分枝桿菌檢測(cè)，為消除檢測(cè)的偏向性，均在病理診斷之前報(bào)告檢測(cè)結(jié)果。根據(jù)之前制定的檢測(cè)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，判定麻風(fēng)分枝桿菌陽性樣本33例，陰性樣本56例；89例臨床組織樣本病理診斷為36例麻風(fēng)，53例為其他疾病，具體對(duì)比分析結(jié)果見表3?？梢姡琿PCR技術(shù)在新鮮臨床病例樣本的檢測(cè)靈敏度為91.7%，特異度為100%。

表3 新鮮皮膚組織中qPCR技術(shù)靈敏性及特異性分析

3 討論

麻風(fēng)分枝桿菌不能體外培養(yǎng)，給臨床上麻風(fēng)的診斷帶來了較大困難。麻風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)為：①有皮損并伴有淺感覺障礙及閉汗；②周圍神經(jīng)干或皮支粗大；③皮膚切刮組織液及皮膚病理抗酸染色見麻風(fēng)分枝桿菌；④病理檢查見上皮樣細(xì)胞肉芽腫及巨噬細(xì)胞肉芽腫，神經(jīng)可見腫大及浸潤。符合前2項(xiàng)疑似麻風(fēng)，符合以上4項(xiàng)即可確診[16]。以上可見，麻風(fēng)的診斷最核心的指標(biāo)為查見麻風(fēng)分枝桿菌和典型的病理表現(xiàn)。對(duì)于早期或者PB型麻風(fēng)，傳統(tǒng)的抗酸染色由于受其靈敏度限制查見病原菌比較困難，雖然為了提高該方法的靈敏度，諸如使用特殊包被的載玻片，改良的染色步驟及校準(zhǔn)的顯微鏡等措施被使用，但是特異性方面的缺陷，限制了其在臨床診斷的應(yīng)用[17，18]；對(duì)于缺乏典型病理表現(xiàn)的病例，病理檢查也不能及時(shí)提供明確的診斷依據(jù)。此外，利用酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)技術(shù)檢測(cè)機(jī)體針對(duì)酚糖脂的IgM抗體等血清學(xué)檢查手段也被用以麻風(fēng)的輔助診斷[19，20]，該方法是非侵入性的且對(duì)抗酸染色檢查是一種有效的補(bǔ)充。此方法的檢測(cè)結(jié)果反映的是機(jī)體的病原菌載量，可根據(jù)其結(jié)果對(duì)麻風(fēng)患者作進(jìn)一步的細(xì)化分型[21]。但是，PCR技術(shù)，特別是qPCR技術(shù)已經(jīng)被證明在靈敏度方面相對(duì)于血清學(xué)檢查有著無可比擬的優(yōu)勢(shì)[22]。

本研究選取麻風(fēng)分枝桿菌特異性基因Ag85B和SodA作為檢測(cè)目標(biāo)，設(shè)計(jì)特異性引物及探針，對(duì)前期85例麻風(fēng)蠟塊組織樣本(65例MB型和20例PB型)和50例其他疾病蠟塊組織樣本進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)PCR的擴(kuò)增結(jié)果及充分保證特異性并最大可能提高靈敏性的原則，我們將PCR擴(kuò)增臨界Ct值定為35。按照此標(biāo)準(zhǔn)，85例麻風(fēng)蠟塊組織樣本檢出率為82.4%。然后，我們檢測(cè)了病種未知的99例蠟塊組織樣本的麻風(fēng)分枝桿菌，將判讀結(jié)果與臨床診斷結(jié)果進(jìn)行比對(duì)后，計(jì)算出qPCR方法的特異度為97.2%，靈敏度為82.1%。接下來在89例新鮮皮損組織中進(jìn)行了麻風(fēng)分枝桿菌檢測(cè)，經(jīng)比對(duì)計(jì)算后，特異度為100%，靈敏度為91.7%，其中多菌型的靈敏度達(dá)100%，而少菌型的靈敏度為50%。以上結(jié)果證實(shí)了我們對(duì)蠟塊組織中靈敏度偏低原因的推測(cè)；同時(shí)，我們的上述研究結(jié)果與國內(nèi)外研究團(tuán)隊(duì)研究結(jié)果基本保持一致。葉理等[24]利用qPCR方法在52例皮膚組織標(biāo)本中檢測(cè)麻風(fēng)分枝桿菌DNA的檢出率為90.38%；覃曉琳等[25]利用單管巢式qPCR在54例疑似麻風(fēng)組織液標(biāo)本中檢測(cè)麻風(fēng)分枝桿菌DNA，其中多菌性的檢出率為96.9%，少菌型檢出率為83.3%。另外，Martinez等[15]于2006年利用qPCR技術(shù)在69例皮膚組織樣本中檢測(cè)麻風(fēng)分枝桿菌Ag85B基因的靈敏度達(dá)91.3%；而后于2011年再次利用qPCR技術(shù)在62例皮膚組織樣本中同時(shí)檢測(cè)麻風(fēng)分枝桿菌Ag85B基因和SodA基因，其靈敏度分別為68.8%和75%；對(duì)于Ag85B基因，多菌型的靈敏度為95.2%，而少菌型的靈敏度為36.4%[23]。

本研究結(jié)果表明，同時(shí)選取麻風(fēng)分枝桿菌特異性基因Ag85B和SodA作為檢測(cè)目標(biāo)的qPCR技術(shù)，具有較高的靈敏度和最高的特異度；輔之以蛋白酶K裂解為核心的麻風(fēng)分枝桿菌DNA提取方法，是一種快捷有效的臨床診斷麻風(fēng)的輔助手段，特別是對(duì)于BT型麻風(fēng)和缺乏典型組織形態(tài)學(xué)改變的麻風(fēng)診斷則意義更為明顯。

[1]Bennett BH, Parker DL, Robson M. Leprosy: steps along the journey of eradication[J]. Public Health Rep,2008,123(2):198-205.

[2]Goulart LR, Goulart IM. Leprosy pathogenetic background: a review and lessons from other mycobacterial diseases[J]. Arch Dermatol Res,2009,301(2):123-137.

[3]WHO. Global leprosy situation[J]. Weekly Epidemiological Record,2010,85:337-348.

[4]Shepard CC, McRae DH. A method for counting acid-fast bacteria[J]. Int J Lepr Other Mycobact Dis,1968,36:78-82.

[5]Williams DL, Gillis TP, Fiallo P. Detection of Mycobacterium leprae and the potential for monitoring antileprosy drug therapy directly from skin biopsies by PCR[J]. Molecular & Cellular Probes,1992,4:401-410.

[6]譚笑.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室快速診斷方法的研究[J].湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2007,4(2):58- 59.

[7]Harris KA, Turner P, Green EA. Duplex real-time PCR assay for detection of streptococcus pneumoniae in clinical samples and determination of penicillin susceptibility[J]. J Clin Microbiol,2008,46(8):2751-2758.

[8]Espy MJ, Uhl JR, Sloan LM. Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing[J]. Clin Microbiol Rev,2006,19(1):165-256.

[9]De Wit MYL, Faber WR, Krieg SR, et al. Application of a polymerase chain reaction for the detection of Mycobacterium leprae in skin tissues[J]. J Clin Microbiol,1991,29(5):906-910.

[10]Hartskeerl RA, De Wit MYL, Klatser PR. Polymerase chain reaction for the detection of Mycobacterium leprae[J]. J Gen Microbiol,1989,135:2357-2364.

[11]Williams DL, Gillis TP, JBooth R, et al. The use of a specific DNA probe and polymerase chain reaction for the detection of Mycobacterium leprae[J]. J Infect Dis,1990,162:193-200.

[12]Plikaytis BB, Gelber RH, Shinnick TM. Rapid and sensitive detection of Mycobacterium leprae using a nestedprimer gene amplification assay[J]. J Clin Microbiol,1990,28:1913-1917.

[13]Woods SA, Cole ST. A rapid method for the detection of potentially viable Mycobactenium leprae in human biopsies: a novel application of PCR[J]. FEMS Microbiol Lett,1989,65:305-310.

[14]Woods SA, Cole ST. A family of dispersed repeats in Mycobactenium leprae[J]. Mol Microbiol,1990,4:1745-1751.

[15]Martinez AN, Britto CF, Nery JA, et al. Evaluation of real-time and conventional PCR targeting complex 85 genes for detection of Mycobacterium leprae DNA in skin biopsy samples from patients diagnosed with leprosy[J]. J Clin Microbiol,2006,44(9):3154-3159.

[16]Jardim MR, Antunes SLG, Santos AR. Criteria for diagnosis of pure neural leprosy[J]. J Neurol,2003,250(7):806-809.

[17]Levy L, Ji B. The mouse foot-pad technique for cultivation of Mycobacterium leprae[J]. Lepr Rev,2006,77:5-24.

[18]Job CK, Chacko CJG. A modification of Fite's stain for demonstration of Mycobacterium leprae in tissue sections[J]. Indian Journal of Leprosy,1986,57:17-18.

[19]Torres P, Camarena JJ, Gomez JR, et al. Comparison of PCR mediated amplification of DNA and the classical methods for detection of Mycobacterium leprae in different types of clinical samples in leprosy patients and contacts[J]. Lepr Rev,2003,74:18-30.

[20]Jardim MR, Antunes SL, Simons B, et al. Role of PGL-I antibody detection in the diagnosis of pure neural leprosy[J]. Lepr Rev,2005,76:232-240.

[21]Schuring RP, Moet FJ, Pahan D, et al. Association between anti-pGL-I IgM and clinical and demographic parameters in leprosy[J]. Lepr Rev,2006,77:343-355.

[22]Wichitwechkarn J, Karnjan S, Shuntawuttisettee S, et al. Detection of Mycobacterium leprae infection by PCR[J]. J Clin Microbiol,1995,33:45-49.

[23]Martinez AN, Ribeiro-Alves M, Sarno EN, et al. Evaluation of qPCR- based Assays for leprosy diagnosis directly in clinical specimens[J]. Plos Neglect Trop D,2011,5:1-8.

[24]葉理,呂志成,靳亞麗,等.麻風(fēng)分支桿菌PCR檢測(cè)方法的優(yōu)化與應(yīng)用[J].皮膚性病診療學(xué)雜志,2016,23:23-26.

[25]覃曉琳,黃進(jìn)梅,薛耀華,等.單管巢式實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)麻風(fēng)桿菌方法的建立及初步應(yīng)用[J].中國麻風(fēng)皮膚病雜志,2014,30:579-582.

(收稿：2016-06-21 修回：2016-06-24)

Establishment and evaluation of quantitative PCR method for detection of Mycobacterium leprae DNA

WENJing1,WANGChuan1,SUNLele1,CHENMingfei1,2,FUXi'an1,WANGJianwen1,2,LIUHong1,2,ZHANGFuren1,2.

1.ShandongProvincialInstituteofDermatologyandVenereology,AcademyofMedicalSciences,Jinan250022,China; 2.ShandongProvincialDermatologyHospital,ShandongUniversity,Jinan250022,China

Correspondenceauthor:ZHANGFuren,E-mail:zhangfuren@hotmail.com

Objective: To establish the detection method of Mycobacterium leprae DNA using quantitative PCR (qPCR) and to analyze the sensitivity and specificity of qPCR in identifyingMycobacteriumlepraeDNA. Methods: The special gene sequences Ag85B and soda ofMycobacteriumlepraeDNA were detected in 135 formalin-fixed, paraffin-embedded skin tissues of leprosy or non-leprosy patients using qPCR to establish the criterion for this method. Then the special gene sequences Ag85B and sodA ofMycobacteriumlepraeDNA were also detected in 99 formalin-fixed, paraffin-embedded skin tissues of unknown disease and 89 frozen skin tissues of unknown diseases to evaluate the sensitivity and specificity of qPCR. Results: The specificity and sensitivity of qPCR were 100% and 91.7% in frozen skin tissues and higher than those in formalin-fixed, paraffin-embedded skin tissues. Conclusion: qPCR is an useful method in detectingMycobacteriumlepraeDNA.

leprosy;Mycobacteriumleprae; qPCR; evaluation

山東省自然科學(xué)基金青年基金(編號(hào)：ZR2013HQ041)

1山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山東省皮膚病性病防治研究所，濟(jì)南，250022

2山東省皮膚病醫(yī)院，山東大學(xué)，濟(jì)南，250022

張福仁，E-mail：zhangfuren@hotmail.com