中國漢族大皰性皮膚病GLCCI1變異體與糖皮質(zhì)激素不敏感無相關(guān)性

杜甜甜 付希安 孫勇虎 于功奇 王真真 楊寶琦 盧憲梅 劉 紅 張福仁

·短篇論著·

中國漢族大皰性皮膚病GLCCI1變異體與糖皮質(zhì)激素不敏感無相關(guān)性

杜甜甜1，2付希安1孫勇虎1于功奇1王真真1楊寶琦1盧憲梅1劉 紅1張福仁1

目的： 應(yīng)用基因分型技術(shù)分析中國漢族種群大皰性皮膚病GLCCI1變異體與糖皮質(zhì)激素不敏感的相關(guān)性。方法： 將187例大皰性皮膚病患者根據(jù)控制病情所需糖皮質(zhì)激素用量分為實(shí)驗(yàn)組(糖皮質(zhì)激素量≤60 mg，n=129)與對照組(糖皮質(zhì)激素量≥150 mg，n=58)，應(yīng)用Taqman genotyping技術(shù)對研究對象進(jìn)行位于GLCCI1基因的SNP rs37973基因分型，數(shù)據(jù)資料應(yīng)用PLINK軟件進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析。結(jié)果： 未發(fā)現(xiàn)GLCCI1基因的SNP rs37973與中國漢族種群大皰性皮膚病中糖皮質(zhì)激素不敏感存在顯著相關(guān)性(P=0.7881,OR=1.062)。結(jié)論： GLCCI1變異體與中國漢族種群大皰性皮膚病糖皮質(zhì)激素不敏感無顯著相關(guān)。

GLCCI1； 糖皮質(zhì)激素； 大皰性皮膚病

自身免疫性大皰性皮膚病是一組以皮膚黏膜發(fā)生紅斑、 水皰、 大皰、糜爛為臨床特征的慢性復(fù)發(fā)性疾病，代表性的疾病有天皰瘡、大皰性類天皰瘡[1,2]。目前，糖皮質(zhì)激素(GC，簡稱：激素)仍為治療大皰性皮膚病的一線用藥。多數(shù)患者經(jīng)過激素治療能得到有效的長期緩解甚至治愈，但有一少部分患者通過增加激素用量或延長激素的使用療程仍未獲得滿意療效，導(dǎo)致大皰性皮膚病的病死率、費(fèi)用增高，因此闡明激素不敏感的機(jī)制顯得尤為重要。2011年Tantisira等[3]通過全基因組關(guān)聯(lián)分析在哮喘患者中揭示了一種新的影響吸入性激素療效的遺傳藥理學(xué)決定子，發(fā)現(xiàn)功能性GLCCI1變異體(rs 37973)與哮喘病人對吸入性激素的反應(yīng)大大降低相關(guān)。后有學(xué)者不斷在強(qiáng)直性脊柱炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性移植物抗宿主病等中發(fā)現(xiàn)GLCCI1變異體與激素不敏感顯著相關(guān)[4,5]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谘芯恐袊鴿h族種群自身免疫性大皰性皮膚病中激素不敏感與GLCCI1變異體是否存在相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 187例大皰性皮膚病患者(包括111例天皰瘡，76例大皰性類天皰瘡)均為我院門診及住院患者，均經(jīng)山東省皮膚病性病防治研究所臨床+組織病理+免疫病理確診。其中敏感組患者129例(病情控制所需激素相當(dāng)于潑尼松劑量≤60 mg)，男66例，女63例;非敏感組患者58例(病情控制所需激素劑量≥150 mg)，男33例，女25例。所有患者之間無任何血緣關(guān)系?；颊甙凑找韵路矫孢M(jìn)行疾病確診。

天皰瘡：(1)典型臨床表現(xiàn)：外觀正常皮膚或黏膜散發(fā)或簇集分布的大皰、水皰，皰壁多薄而松弛，Nikolsky(尼氏征)陽性；(2)組織病理示：棘層松解、表皮內(nèi)裂隙和水皰；(3)直接免疫熒光：表皮細(xì)胞間可見IgG、C3的沉積，呈網(wǎng)狀分布；(4)間接免疫熒光：血清中查到IgG抗體。

大皰性類天皰瘡：(1)典型的臨床特征：好發(fā)于胸腹部和四肢近端，在外觀正常的皮膚或紅斑基礎(chǔ)上出現(xiàn)緊張性水皰或大皰，呈半球狀，皰壁較厚，不易破潰，破潰后糜爛面常覆以痂皮或血痂，Nikolsky(尼氏征)陰性；(2)組織病理示：表皮下水皰，真皮乳頭血管周圍有嗜酸粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤；(3)直接免疫熒光：基底膜帶可見IgG、C3線狀沉積；(4)間接免疫熒光：血清中查到IgG抗體。

1.2 材料 經(jīng)患者知情同意后，采集其上肢靜脈血液(至少5 mL)，將血樣用抗凝管盛裝，放入超低溫冰箱(-80℃)中存放。采用AXYGEN試劑盒提取基因組DNA，取適量DNA進(jìn)行純度檢測并標(biāo)化。

1.3 方法

1.3.1 引物和探針設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)所用GLCCI1基因上的SNP rs37973引物及探針由美國ABI公司設(shè)計(jì)并合成(表1)。

1.3.2 Taqman PCR 將標(biāo)準(zhǔn)化制備成同一濃度后的DNA上機(jī)，按照絕對定量PCR文件的建立、進(jìn)行重點(diǎn)讀板文件的建立、進(jìn)行背景熒光讀取、進(jìn)行絕對定量PCR、結(jié)果讀取分析、Taqmqn Genotyper software軟件分析等步驟，完成實(shí)時(shí)定量熒光PCR，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析 將Taqman實(shí)時(shí)定量熒光PCR中得到的數(shù)據(jù)資料應(yīng)用PLINK軟件進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析。

2 結(jié)果

分別統(tǒng)計(jì)各組中SNP rs37973最小等位基因位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率，比較各組中該等位基因位點(diǎn)有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，數(shù)據(jù)分析結(jié)果，見表2。

表1 引物和探針序列

表2 SNP rs37973與實(shí)驗(yàn)組、對照組間的關(guān)聯(lián)結(jié)果

3 討論

自身免疫性大皰性皮膚病是一組以皮膚黏膜發(fā)生紅斑、 水皰、 大皰、糜爛為臨床特征的慢性復(fù)發(fā)性疾病，臨床上最常見的為天皰瘡、大皰性類天皰瘡，糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑治療常有效。大皰性皮膚病的診斷必須以三個(gè)獨(dú)立的診斷標(biāo)準(zhǔn)集合為基礎(chǔ)，分別是臨床特征、組織病理學(xué)檢查和免疫學(xué)檢查。

目前，糖皮質(zhì)激素仍是自身免疫性大皰性皮膚病的第一線治療藥物，自其應(yīng)用于臨床以來，天皰瘡[6]及大皰性類天皰瘡的死亡率大大降低。治療時(shí)應(yīng)盡量遵循及時(shí)治療、足量控制、正確減量、最小劑量維持的原則。雖然多數(shù)患者經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療能取得滿意療效，但有少數(shù)患者對大劑量糖皮質(zhì)激素治療反應(yīng)很差或無反應(yīng)，即使加大用量也不能控制病情的進(jìn)展，病人預(yù)后較差。

2011年Tantisira等[3]通過全基因組關(guān)聯(lián)分析在哮喘患者中揭示了一種新的影響吸入性糖皮質(zhì)激素療效的遺傳藥理學(xué)決定子。首先以家庭篩查算法為基礎(chǔ)，從534290單核苷酸多態(tài)性(SNPs)中挑選有統(tǒng)計(jì)學(xué)效力小數(shù)目變異體進(jìn)行分析，以確定吸入性糖皮質(zhì)激素治療反應(yīng)時(shí)的肺功能變化。結(jié)果在SNP rs37972發(fā)現(xiàn)了一種顯著、重復(fù)的相關(guān)性，此相關(guān)在4個(gè)獨(dú)立人群含935人中重復(fù)出現(xiàn)(P=0.0007)。SNP rs37972在基因圖譜中對應(yīng)于糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄基因1(GLCCI1)，并與rs37973完全連鎖不平衡。SNP rs37972和rs37973均與GLCCI1的表達(dá)減少相關(guān)?？傮w接受治療受試者中，突變r(jià)s37973等位基因純合子者一秒用力呼氣量平均增加僅是接受相同治療野生型等位基因受試者的1/3[(3.2±1.6)%與(9.4±1.1%)]，且其不良風(fēng)險(xiǎn)明顯要高[OR=2.36，95%CI(1.27，4.41)]，基因型占總吸入性糖皮質(zhì)激素反應(yīng)變異性的6.6%。因此學(xué)者們得出結(jié)論功能性GLCCI1變異體與哮喘患者對吸入性糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)明顯下降相關(guān)。

GLCCI1基因位于7號染色體上，包括8個(gè)外顯子，其廣泛分布于肺細(xì)胞與免疫細(xì)胞中，且當(dāng)有外源性糖皮質(zhì)激素存在時(shí)，其表達(dá)量會大大增加。GLCCI1是糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的早期標(biāo)志之一[7]，而細(xì)胞凋亡又是減輕淋巴細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞浸潤的重要機(jī)制。若其表達(dá)減少可影響炎癥細(xì)胞的凋亡，從而進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體對糖皮質(zhì)激素敏感性降低。

迄今為止，已有不少學(xué)者在其它自身免疫性疾病中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，如強(qiáng)直性脊柱炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性移植物抗宿主病等[4,5]。但本研究并未發(fā)現(xiàn)GLCCI1變異體與糖皮質(zhì)激素不敏感存在顯著相關(guān)性。推測可能的原因是種族異質(zhì)性差異及樣本量的不足。

綜上所述糖皮質(zhì)激素不僅參與調(diào)控體內(nèi)免疫與炎性反應(yīng)過程，而且調(diào)控個(gè)體基本的生命過程，為體內(nèi)最重要的糖皮質(zhì)激素，其在臨床治療中的應(yīng)用也備受關(guān)注。因此，臨床治療中所出現(xiàn)的個(gè)體激素敏感性的不同及糖皮質(zhì)激素不敏感甚至抵抗現(xiàn)象的研究也隨之成為熱點(diǎn)。相信隨著人類基因組計(jì)劃的不斷完善，分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，多元化的基因檢測技術(shù)誕生，不久的將來影響糖皮質(zhì)激素敏感性的機(jī)制將最終被一一闡明。

[1] Hammers CM, Schmidt E, Zillikens D. Autoimmune blistering skin diseases: diagnostic and therapeutic approach[J]. Dtsch Med Wochenschr,2014,139(28-29):1473-1477.

[2] Kershenovich R, Hodak E, Mimouni D. Diagnosis and classification of pemphigus and bullous pemphigoid[J]. Autoimmun Rev,2014,13(4-5):477-481.

[3] Tantisira KG, Su JL, Harada M, et al. Genomewide association between GLCCI1 and response to glucocorticoid therapy in asthma[J]. N Engl J Med,2011,365:1173-1183.

[4] Szalai R, Matyas P, Varszegi D, et al. Admixture of beneficial and unfavourable variants of GLCCI1 and FCER2 in Roma samples can implicate different clinical response to corticosteroids[J]. Mol Biol Rep,2014,41:7665-7669.

[5] Meara AO, Boukouaci W, Robin M, et al. GLCCI1 and glucocorticoid receptor genetic diversity and response to glucocorticoid-based treatment of graft-versus-host disease[J]. Biol Blood Marrow Transplant,2015,21:1246-1250.

[6] Rosenberg FR, Sanders S, Nelson CT. Pemphigus. A 20-year review of 107 patients treated with corticosteroids[J]. Arch Dermatol,1976,112:962-970.

[7] Chapman MS, Qu N, Pascoe S, et al. Isolation of differentially expressed sequence tags from steroid-responsive cells using mRNA differential display[J]. Mol Cell Endocrinol,1995,108:R1-7.

(收稿：2016-04-12 修回：2016-08-27)

Lack of association between GLCCI1 variant and glucocorticoid sensitivity in Chinese patients with bullous diseases

DUTiantian1,2,FUXi'an1,SUNYonghu1,YUGongqi1,WANGZhenzhen1,YANGBaoqi1,LUXianmei1,LIUHong1,ZHANGFuren1.

l.ShandongProvincialInstituteofDermatologyandVenerueology,ProvincialAcademyofMedicalScience,Jinan250022,China; 2.SchoolofMedicineandLifeSciences,UniversityofJinan-ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250062,China

ZHANGFuren,E-mail:zhangfuren@hotmail.com

Objective: To investigate the association between GLCCI1 gene and GC sensitivity in Chinese patients with bullous diseases. Methods: A total of 187 subjects were divided into GC-sensitive group (control dose ≤60 mg, n=129) and GC-insensitive group (control dose ≥150 mg, n=58). Single SNP (rs37973) was genotyped with TaqMan SNP Genotyping Assay Kit on the GeneAmp 7900 Sequence Detection System using specific TaqMan probes. The statistical analysis was performed using logistic regression in PLINK. Results: We failed to detect rs37973 variation in the patients with GC-insensitive bullous diseases (P=0.7881, odds ratio=1.062). Conclusion: There is no association between GLCCI1 and glucocorticoids sensitivity in Chinese patients with bullous diseases.

GLCCI1; glucocorticoids; bullous diseases

1山東省皮膚病性病防治研究所，濟(jì)南，250022 2濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南，250062

張福仁，E-mail: zhangfuren@hotmail.com