東亞飛蝗腸道內高產纖維素酶菌株篩選及鑒定

徐 沖， 鐘麗娟， 陳麗媛， 陳 杰， 孫翠煥， 朱巍巍， 關艷麗

(遼寧省微生物科學研究院，遼寧 朝陽 122000)

東亞飛蝗腸道內高產纖維素酶菌株篩選及鑒定

徐 沖， 鐘麗娟*， 陳麗媛， 陳 杰， 孫翠煥， 朱巍巍， 關艷麗

(遼寧省微生物科學研究院，遼寧 朝陽 122000)

為微生物制劑生產篩選菌種資源。運用昆蟲解剖技術取出東亞飛蝗(Locustamigratoriamanilensis)腸道，采用稀釋涂板法對腸道內的菌種進行分離，并利用羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)改良培養(yǎng)基初篩產纖維素酶菌株。結果表明，從東亞飛蝗腸道內共分離得到12株產纖維素酶菌株，均為細菌，并對纖維素酶活較高的菌株K005進行了形態(tài)學和分子生物學鑒定，通過菌落及菌體形態(tài)特征、生理生化特性、16S rDNA序列測定結果，將該菌株鑒定為蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)。

東亞飛蝗；腸道；纖維素酶；蠟樣芽胞桿菌

近些年，人們對環(huán)保、生態(tài)、資源循環(huán)利用等日益重視，纖維素的利用也在不同領域得到了擴展。隨之而來的關于纖維素相關的科學研究也逐漸增多，主流為兩個方向，即農業(yè)和畜牧業(yè)，通過微生物的作用將纖維素類資源降解后為作物或牲畜所用，因此高纖維素酶活菌種的篩選與應用成為十分必要的工作。已報道的文獻[1-4]中，科研人員主要通過土壤、腐爛的秸稈、食草動物的瘤胃等樣品進行菌種的分離，也有從白蟻和西伯利亞蝗蟲腸道中分離纖維素酶菌株[5]，這些研究不僅豐富了菌種的來源，也為更有效利用纖維素提供了更多的可能。本研究對東亞飛蝗腸道內的產纖維素菌種進行了分離，并對其進行了形態(tài)、生理生化及分子生物學鑒定。旨在通過更多途徑篩選可降解纖維素的菌株，進而滿足科研與應用的需要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 分離樣品為東亞飛蝗腸道，飛蝗樣品采集自遼寧省朝陽市市郊大凌河流域的草地。

1.1.2 培養(yǎng)基 CMC-Na培養(yǎng)基：CMC-Na 5.0 g，MgSO40.5 g，KH2PO42.0 g，蛋白胨2.5 g，酵母膏0.5 g，瓊脂粉20 g，水1 000 mL，pH 7.0～8.0；NA培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.1.3 試劑 ①剛果紅10 mg/mL；②呂氏美藍染色液：配制A液(亞甲基藍0.3 g，95%酒精30 mL)、B液(稱取氫氧化鉀(KOH) 0.01 g，加入100 mL蒸餾水)，然后A液和B液混合即成呂氏美藍染色液。

1.2 方法

1.2.1 菌種篩選[6]將蝗蟲蟲體浸于70%酒精中約7～8 min，至其死亡，于超凈工作臺上，將其移至滅菌平皿中，剪去足與翅，用剪刀從背部肛門處剪至胸部，用已事先滅菌的解剖針撥開蟲體體表，用無菌鑷子取出消化道，放于事先滅菌的研缽中研磨。然后加入10 mL無菌水制成菌懸液，依次稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9。分別取0.1 mL稀釋液于平板中，涂抹均勻，30 ℃培養(yǎng)。

1.2.2 菌種的分離純化[7]定期檢查平板菌落的生長情況，采用劃線法進行菌種的分離與純化，待純化2～3次后備用。

1.2.3 產纖維素酶菌株初篩[8-9]將純化好的菌株點接至CMC-Na的平板上培養(yǎng)48 h，記錄菌落直徑，將每塊平板中倒入剛果紅染液進行染色1 h后，將平板置于緩慢的流水下沖洗3～5 min，有纖維素酶活的菌種會出現透明圈，用游標卡尺測定透明圈的直徑。透明圈越大表明其產纖維素酶的能力越強。

1.2.4 菌種鑒定 ①生理生化鑒定：菌落、菌體形態(tài)及生理生化特性參照《伯杰細菌鑒定手冊》[10]和東秀珠編著的《常見細菌系統鑒定手冊》[11]等方法進行鑒定。②PCR擴增16S rRNA基因測序與分析[12-14]：變性反應液使用TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.D304)試劑盒(反應條件：80 ℃，15 min)；PCR 擴增使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.D310)試劑盒；使用 TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No. DV805A)切膠回收目的片段進行 DNA 測序；以 16S Forward、16S Internal 和 16S Reverse 為引物進行測序。將所得序列在GenBank數據庫經BLAST比對后對菌株進行同源性分析，根據相似性最高的序列推測待鑒定細菌可能的分類地位。相關序列經分析軟件CLUSTAL X 1.81比對后，通過MEGA3.1采用鄰近法繪制相關菌株的系統發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 菌種分離及產纖維素酶菌株初篩結果

對東亞飛蝗的腸道內微生物進行了多次分離，共分離得到30余菌株，其中有纖維素酶活的菌株有12株，均為細菌。通過比較其透明圈大小以及透明圈與菌落直徑的比值，其中菌株K005的纖維素酶活最高，透明圈與菌落直徑的比值可達5.39，見表1。

表1 產纖維素酶菌株初篩結果Table 1 Preliminary screening results of cellulase producing strains

2.2 K005菌株形態(tài)及生理生化鑒定結果

菌株K005在NA培養(yǎng)基上生長較好，37 ℃，48 h時形成直徑3～5 mm的圓形菌落，菌落乳白色，表面有光澤，濕潤，邊緣整齊。鏡檢菌體為桿狀，可見柱狀芽胞，見圖1。生理生化鑒定結果[12]見表2，參照《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》鑒定菌株K005隸屬芽胞桿菌屬Bacillussp.。

圖1 K005菌落形態(tài)及芽胞形態(tài)Fig.1 Colony morphology and spore morphology of K005

項目K005項目K005革蘭染色+甲基紅+芽胞染色+V-P測定+H2S-淀粉水解+硝酸還原+吲哚產生-卵磷脂水解+明膠液化+接觸酶+阿拉伯糖-厭氧生長+蔗糖+葡萄糖氧化發(fā)酵+木糖產酸-在7%氯化鈉上生長+水解酪氨酸+

注：“+”表示反應為陽性，“-”表示反應為陰性

2.3 16S rDNA擴增及序列測定

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果見圖2，以16S Forward、16S Internal和16S Reverse為引物進行DNA測序，將測序結果向GenBank提交，序列登記號為KX507377。

2.4 菌株K005分子生物學鑒定

利用BasicBLAST將菌株K005的16S rDNA序列和NCBI中已登錄的16S rDNA序列進行同源性比較，結果發(fā)現，該菌株與蠟樣芽胞桿菌Bacilluscereus的同源性高達100%，并利用MEGA3.1進行了系統發(fā)育樹構建(圖3)，結合生理生化鑒定、同源性比對及系統發(fā)育樹等結果，鑒定該菌株屬于芽胞桿菌屬的蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)。

圖2 菌株K005 16S rDNA PCR擴增產物電泳圖Fig.2 K005 16S rDNA amplification patterns M: DL2000 DNA Marker；1：CTD719-ZWW-PCR產 物；+：正對照；-：負對照 M: DL2000 DNA Marker；；1：CTD719-ZWW-PCR product；+：Positive control；-：Negative control

圖3 根據16S rDNA基因序列構建系統發(fā)育進化樹Fig.3 The Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

3 討 論

目前產纖維素酶菌株的研究多集中在真菌方面，對細菌研究報道[15]相對略少。本研究所分離到的12株產纖維素酶菌株均為細菌。其中產纖維素酶活較高的K005經鑒定為蠟樣芽胞桿菌，屬于農業(yè)部批準的生物獸藥可用微生物菌種，且該菌種分離自昆蟲腸道，對氧氣的需求較小，在進行工業(yè)化生產時具備一定的優(yōu)勢。

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Screening and Identification of High-Yielding Cellulase Strain from Enteric Duct in East Asian Locust (Locustamigratoriamanilensis)

XU Chong, ZHONG Li-juan, CHEN Li-yuan, CHEN Jie,SUN Cui-huan, ZHU Wei-wei, GUAN Yan-li

(LiaoningAcad.ofMicrobiol.,Chaoyang122000)

Screening of strain resources for the production of microbial agents. In this study the insect anatomy technology was used to draw out enteric duct in East Asia migratory locust (Locustamigratoriamanilensis), and isolated the bacterial strain with spreading dilution method, and using sodium carboxymethyl cellulose (CMC-Na) modified medium to screen initially the cellulase producing strains. The results showed that a total of 12 intestinal strains were separated from the East Asia migratory locust that produce cellulase, all of them were bacteria, among them strain K005 with fairly high cellulase activity were studied on its morphology and molecular biology aspects of morphological for its identification. The results through colony morphologic features, cell morphologic features, physiological and biochemical specificities and 16S rDNA sequence analysis, the strain was identified asBacilluscereus.

East Asia locust (Locustamigratoriamanilensis); enteric duct; cellulase;Bacilluscereus

國家農業(yè)科技成果轉化項目(國科發(fā)農[2010]297號)

徐沖 男，碩士研究生，助理研究員。主要從事應用微生物學研究。E-mail:sss646@163.com

* 通訊作者。女，碩士，副研究員。主要從事應用微生物學研究。Tel:0421-2976855，E-mail: benxiaohai_6666@163.com

2016-01-23；

2016-04-16

Q939.96

A

1005-7021(2016)03-0069-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.03.013