蠶豆根瘤菌接種效應(yīng)研究

韓 梅， 張宏亮， 曹衛(wèi)東

(1.青海省農(nóng)林科學(xué)院 土壤肥料研究所，青海 西寧 810016；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081)

蠶豆根瘤菌接種效應(yīng)研究

韓 梅1， 張宏亮1， 曹衛(wèi)東2

(1.青海省農(nóng)林科學(xué)院 土壤肥料研究所，青海 西寧 810016；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081)

為發(fā)掘和利用青海冷涼地區(qū)蠶豆優(yōu)良的根瘤菌種質(zhì)資源，確定根瘤菌的接種效應(yīng)。將分離、純化、分子鑒定的16株蠶豆根瘤菌通過(guò)盆栽回接試驗(yàn)的方法進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，篩選出6株根瘤菌，它們與青海13號(hào)蠶豆共生匹配效果較好，共生固氮能力強(qiáng)，促進(jìn)蠶豆生長(zhǎng)效果明顯。

蠶豆根瘤菌；接種；固氮

蠶豆是青海省重要的農(nóng)作物之一，也是青海省“十大”特色支柱產(chǎn)業(yè)。蠶豆生產(chǎn)具有推動(dòng)區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展、增加出口創(chuàng)匯和農(nóng)民經(jīng)濟(jì)收益以及保護(hù)農(nóng)田生態(tài)環(huán)境等經(jīng)濟(jì)、社會(huì)與生態(tài)三重效益。年種植面積2.67萬(wàn)hm2左右，產(chǎn)量基本穩(wěn)定在7.0～9.0萬(wàn)t之間，商品率在70%以上。主產(chǎn)區(qū)分布在東部農(nóng)業(yè)區(qū)的川水和低、中位山旱區(qū)，具有單產(chǎn)高、品質(zhì)好、商品率高等特點(diǎn)[1]。但干旱半干旱區(qū)的蠶豆，由于土壤堿性重，鹽分高，土著根瘤菌的數(shù)量相對(duì)較少，結(jié)瘤能力弱。為了提高干旱半干旱區(qū)的蠶豆結(jié)瘤能力，有針對(duì)性地選擇高效、抗逆性強(qiáng)的菌株接種，提高固氮能力，增加產(chǎn)量。本研究是通過(guò)采集青海地區(qū)蠶豆根瘤菌，分離、純化、PCR鑒定得到根瘤菌純培養(yǎng)物，經(jīng)過(guò)蠶豆盆栽回接試驗(yàn)，初步篩選出能在蠶豆根部結(jié)瘤的根瘤菌菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蠶豆品種 青海13號(hào)蠶豆。

1.1.2 菌株 分離鑒定的蠶豆根瘤菌，1～16號(hào)菌株采自蠶豆。采集時(shí)間為2013年7月。

1.1.3 低氮培養(yǎng)液 Ca(NO3)2·4H2O 0.03 g，CaSO40.46 g，KCl 0.075 g，MgSO4·H2O 0.06 g，K2HPO40.136 g，檸檬酸鐵0.075 g，1%Na2MoO31 mL，1%H2BO31 mL，水1 000 mL[2]。

1.1.4 YMA培養(yǎng)基 甘露醇10 g，酵母浸膏 0.5 g，MgSO40.2 g，NaCl 0.1 g，K2HPO40.5 g，瓊脂18 g，水 1000 mL，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 根瘤菌的鑒定 采用16S rDNA全序列測(cè)定及鑒定。從分離、純化的蠶豆根瘤菌提取總DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增、電泳技術(shù)及凝膠成像，形成指紋圖譜，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 根瘤菌的回接 ①種子的處理：用75%乙醇浸泡種子5 min后，用無(wú)菌水清洗5～8次。將消毒后的種子播于鋪有無(wú)菌濕潤(rùn)濾紙的平皿內(nèi)，封好后置于25～28 ℃溫箱中保溫催芽48 h，種子催芽長(zhǎng)為0.5～1.0 cm[3]。② 培養(yǎng)基質(zhì)處理：將土壤與蛭石按1∶2.0的比例混合拌勻，加入低氮培養(yǎng)液，使蛭石飽和(蛭石和液體的比例為1∶2.5左右)，裝入菌袋中，高壓滅菌2 h。滅菌后將基質(zhì)裝入花盆，基質(zhì)界面以距盆口2 cm左右為宜。③菌液制備：將分離純化的16個(gè)蠶豆根瘤菌菌株分別接種于YMA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)72 h。無(wú)菌水10 mL將根瘤菌菌體洗下并置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，菌懸液調(diào)至光密度值為OD=0.8～0.9，待用。④接種：設(shè)計(jì)16個(gè)處理，每處理挑選12粒芽長(zhǎng)均為1 cm左右發(fā)芽一致的蠶豆種子。置于根瘤菌液中，浸泡15～30 min(以淹沒(méi)種子為宜)，用

無(wú)菌鑷子將其植入裝有無(wú)菌蛭石的花盆中，每盆種植3粒,再沿各種子根部加入該菌液2 mL；對(duì)照(CK)選12粒發(fā)芽一致的蠶豆種子用無(wú)菌水浸泡相同的時(shí)間，用無(wú)菌鑷子將其植入裝有無(wú)菌蛭石的花盆中。共17個(gè)處理，4次重復(fù)。培養(yǎng)溫度為(22±2) ℃，光強(qiáng)7 000～8 000 lx，光照時(shí)間16 h，根據(jù)花盆中失水狀況適期在托盤中補(bǔ)充水分。

1.2.3 調(diào)查指標(biāo)與方法 ①調(diào)查指標(biāo)：試驗(yàn)培養(yǎng)30～40 d后收獲，調(diào)查其株高、根長(zhǎng)、根瘤數(shù)量、地上部鮮重、干重等。②植株全氮量的測(cè)定：采用凱氏定氮法。

1.2.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析方法 用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 根瘤菌的鑒定

16S rDNA全序列測(cè)定鑒定結(jié)果表明，蠶豆根瘤菌的16個(gè)代表菌株均位于快生根瘤菌屬(Rhizobium)系統(tǒng)發(fā)育分支，相似性均大于98.00%，在98.76%～99.93%之間[4-6]。

2.2 回接試驗(yàn)

2.2.1 蠶豆接種根瘤菌后生物學(xué)產(chǎn)量、結(jié)瘤情況 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 接種不同根瘤菌對(duì)蠶豆根瘤及生物量的影響Table 1 Effects of different root nodules on the root nodules and biomass of broad bean

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同字母a、b、c、d表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)

接種根瘤菌處理除菌株6-4-2-1、菌株6-1-4-1外，接種其余菌株的蠶豆株高、根長(zhǎng)、單株根瘤數(shù)、單株瘤重、地上部鮮重、地上部干重均高于CK(不接種根瘤)，其中菌株3-10-1-1、3S-1-②、2-2-2-1、5-1-2-1、2-1-4-1、6-6-4-1單株根瘤數(shù)、單株瘤重增加較多，單株根瘤數(shù)比CK分別增加95.64%、97.36%、94.65%、94.58%、93.79%、93.86%；菌株3-10-1-1、3S-1-②、2-2-2-1、5-1-2-1、2-1-4-1、5-5-4-2、6-6-4-1單株地上部鮮重比CK分別增加39.22%、29.00%、30.65%、27.17%、22.32%、42.40%、43.17%；地上部干重比CK分別增加41.85%、19.55%、32.49%、33.33%、26.96%、30.97%、43.98%。

2.2.2 蠶豆接種效應(yīng)各因素間的相關(guān)性研究 結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 接種效應(yīng)各因素間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of the factors of vaccination effect

表2結(jié)果表明，根瘤數(shù)量與根瘤重、地上部鮮重與地上部干重之間具有顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.852、0.792，說(shuō)明這幾個(gè)指標(biāo)對(duì)蠶豆接種效應(yīng)的影響更為明顯；地上部鮮重、地上部干重在本研究中與根瘤數(shù)、根瘤重之間的相關(guān)性沒(méi)有達(dá)到顯著水平。

2.2.3 初篩結(jié)瘤能力強(qiáng)的蠶豆根瘤菌菌株 回接試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，初步篩選出促生能力好、結(jié)瘤能力強(qiáng)的6株蠶豆根瘤菌株，初篩出菌株的名稱及來(lái)源見(jiàn)表3。根據(jù)盆栽試驗(yàn)結(jié)果可知，除CK(不接種根瘤菌)、菌株6-4-2-1、菌株6-1-4-1結(jié)瘤少外，分離純化的14株蠶豆根瘤菌純培養(yǎng)物回接結(jié)瘤率為87.5%，由此說(shuō)明，回接試驗(yàn)為判定是否根瘤菌的主要依據(jù)。

2.2.4 接種根瘤菌對(duì)蠶豆固氮的影響 對(duì)盆栽試驗(yàn)蠶豆地上部分植株全氮含量進(jìn)行測(cè)定[7](見(jiàn)表4)，計(jì)算地上部分氮攜出，結(jié)果顯示，蠶豆接種根瘤菌，蠶豆地上部分氮攜出量與CK相比均顯著增加，增幅為14.97%～55.33%，其中菌株3-10-1-1、2-2-2-1氮攜出量最多，分別為50.01%、47.82%[8-9]。

表3 初篩出蠶豆根瘤菌株的名稱及來(lái)源Table 3 The name and source of the initial screening of the strain of the bean root nodules

表4 不同根瘤菌株對(duì)蠶豆植株中氮攜出量的影響Table 4 Effect of different root nodules on the nitrogen content of the broad bean plant

3 討 論

經(jīng)分離、純化、生物鑒定得到的16株菌株，除CK(不接種根瘤菌)、菌株6-4-2-1、菌株6-1-4-1結(jié)瘤少外，分離純化的14個(gè)蠶豆根瘤菌純培養(yǎng)物，回接結(jié)瘤率為87.5%。根瘤數(shù)量做為考察接種效應(yīng)的一個(gè)重要指標(biāo)。接種根瘤菌處理除菌株6-4-2-1、菌株6-1-4-1處理外，其余菌株蠶豆單株根瘤數(shù)、單株瘤重均高于CK(不接種根瘤菌)，其中菌株3-10-1-1、3S-1-②、2-2-2-1、5-1-2-1、2-1-4-1、6-6-4-1單株根瘤數(shù)、單株瘤重增加較多。蠶豆接種根瘤菌后地上部分氮攜出量也顯著增加。

根瘤菌-蠶豆共生體系能否高效地固氮除與雙方的基因有關(guān)外,還與土壤、環(huán)境條件等密切相關(guān)[10-11]，根瘤菌的有效性還要受到土壤生態(tài)環(huán)境、宿主植物和土著根瘤菌等環(huán)境因子的影響[12-13]。在人工控制條件下，溫度、濕度以及光照都可以控制，蠶豆接種后，地上部鮮重、干重、根瘤數(shù)、氮攜出量等差異較為明顯。與蛭石相比，土壤條件要復(fù)雜得多。因此，在蛭石初篩的基礎(chǔ)上，應(yīng)進(jìn)一步在土壤中做驗(yàn)證試驗(yàn)，篩選的根瘤菌才能充分發(fā)揮其高效共生固氮作用[14]。

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Rhizobium Inoculation Effect on Broad Bean (Viciafaba)

HAN Mei1, ZHANG Hong-liang1, CAO Wei-dong2

(1.Inst.ofSoil&Fertil.,QinghaiAcad.ofAgric. &Forest.Scis.,Xining810016;2.KeyLab.ofPlantNutrit'n&Fertil.,Minist.ofAgric.,Beijing100081)

In order to explore and exploit broad bean (Viciafaba)Rhizobiumexcellent germ plasm in the cold area of Qinghai, and to determine theRhizobiuminoculation effects, 16 isolated, purified, and molecularly characterized broad bean rhizobia strains were screened by pot-back test method in this study. The results showed that six rhizobia strains were screened out, they match well symbiotically with Qinghai No 13 broad bean, and had strong symbiotic nitrogen fixation capacity, and had obvious promotion of growth effects of the broad bean.

broad beanRhizobium; inoculation; nitrogen fixation

青海大學(xué)中青年基金項(xiàng)目(2013-QNY-2)；國(guó)家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺(tái)運(yùn)行服務(wù)項(xiàng)目(2012)；作物種質(zhì)資源保護(hù)和利用項(xiàng)

韓梅 女，副研究員。主要從事耕作與綠肥等方面的研究與推廣工作。E-mail：hanmei20061234@sina.com

2015-08-07；

2015-11-03

Q939.96;S144.3

A

1005-7021(2016)03-0039-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.03.007

目(NB2013-2130135)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201103005)