釀酒酵母細胞基因組中與轉(zhuǎn)錄因子Rim101亞細胞定位相關(guān)的磷酸酶和激酶基因的篩選

張 艷， 王 頔， 趙運英， 蔣伶活

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122)

釀酒酵母細胞基因組中與轉(zhuǎn)錄因子Rim101亞細胞定位相關(guān)的磷酸酶和激酶基因的篩選

張 艷， 王 頔， 趙運英， 蔣伶活*

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122)

Rim101是一個具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控釀酒酵母細胞耐受堿性和高鹽環(huán)境、鈣離子穩(wěn)態(tài)、細胞分裂以及硒毒性方面起作用。前人研究結(jié)果顯示，細胞周期依賴性激酶基因PHO85的缺失，導(dǎo)致Rim101蛋白在細胞核內(nèi)積累。為了探索Rim101亞細胞定位的新調(diào)節(jié)因子，通過熒光顯微鏡技術(shù)對釀酒酵母細胞基因組中編碼磷酸酶的73個非必需基因缺失株和編碼激酶的139個非必需基因缺失株進行了篩選，發(fā)現(xiàn)編碼磷脂酰肌醇磷酸(PtdInsP)的磷酸酶Sac1調(diào)控Rim101的亞細胞定位。

RIM101;Sac1; 磷酸酶; 激酶

釀酒酵母細胞中Rim101是一個具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，在應(yīng)答堿性pH條件、鹽耐受性、鈣離子穩(wěn)態(tài)、細胞分裂以及硒毒性方面起作用[1-4]。通過蛋白水解過程,Rim101被半胱氨酸蛋白酶Rim13去掉C末端大約100個氨基酸殘基而被激活[5]。Rim13的水解過程需要3個不同的蛋白復(fù)合體(Endosomal Sorting Complex Required for Transport: ESCRT)ECSRT-Ⅰ、ECSRT-Ⅱ和ECSRT-Ⅲ的參與[6]。 編碼ECSRT復(fù)合體組分的7個基因(SNF7、SNF8、STP22、VPS20、VPS25、VPS28 和VPS36)中的任一基因的缺失都會導(dǎo)致堿性條件下的生長缺陷，以及對CaCl2、LiCl和NaCl的敏感[2,7-9]。Nrg1作為鈉離子泵基因ENA1的轉(zhuǎn)錄抑制子，而ENA1的轉(zhuǎn)錄又受到離子濃度、Rim101途徑、鈣調(diào)磷酸酶途徑、Snf1 途徑和Ppz1蛋白磷酸酶的調(diào)控[1,10-11]。Smp1主要在浸潤性生長、產(chǎn)孢和促進光滑的菌落形態(tài)方面起作用[1]。Rim101的核積累可能被細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶Pho85通過磷酸化作用調(diào)控，在體外Pho85能夠磷酸化 Rim101[12]。本文研究了磷酸酶和激酶對Rim101在細胞中定位的影響，證明了磷脂酰肌醇磷酸(PtdInsP)磷酸酶Sac1也調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Rim101在酵母細胞核中的積累。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 釀酒酵母菌株為野生型BY4741(MATahis3、leu2、met15、ura3),以及單倍體BY4741(MATahis3、leu2、met15、ura3)為背景的與磷酸酶相關(guān)的73個單基因缺失株(表1)，與激酶相關(guān)的139個單基因缺失株(表2)購自美國Invitrogen 公司。

表1 釀酒酵母73個編碼磷酸酶的非必需基因Table 1 List of 73 nonessential yeast genes encoding phosphatases in this study

表2 釀酒酵母139個編碼激酶的非必需基因Table 2 List of 139 nonessential yeast genes encoding kinases in this study

續(xù)表2

1.1.2 培養(yǎng)基(質(zhì)量分數(shù)，%) ①LB培養(yǎng)基: 蛋白胨1，酵母提取物0.5，NaCl 1，pH 7.0。配置固體培養(yǎng)基時加入質(zhì)量分數(shù)為1.5%的瓊脂粉。② YPD培養(yǎng)基：蛋白胨2，葡萄糖2，酵母提取物1，配置固體培養(yǎng)基時加入質(zhì)量分數(shù)為2%的瓊脂粉。③SD-His培養(yǎng)基：酵母氮源0.67，葡萄糖2，滅菌后加入過濾滅菌過的10×必需氨基酸混合母液(不含組氨酸)，配置固體培養(yǎng)基時加入質(zhì)量分數(shù)為2%的瓊脂粉。

1.1.3 主要試劑 基因克隆相關(guān)用限制性內(nèi)切酶和T4連接酶等試劑購自NEB公司；酵母轉(zhuǎn)化用ssDNA、LiAc和PEG 3350等試劑購自Sigma公司；TaqDNA聚合酶和Trans1-T1大腸埃希菌感受態(tài)細胞購自北京全式金公司；Tris-Base 等其他試劑購自國藥集團。

1.1.4 主要儀器 PCR反應(yīng)儀(德國艾本德公司)、全溫搖瓶柜(太倉強樂實驗設(shè)備廠)、臺式冷凍離心機(日本日立公司)、立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)、熒光顯微鏡(Nikon 80i)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 整合用DNA片段的獲得 以HIS3-ADH1-GFP-T1質(zhì)粒為模板，以Rim101-N-GFP-F:gcttataaaatcatttcagacgggtgagggatgccaatctacgagacaaag-aattcgagctcgtttaaac，Rim101-N-GFP-R:ggtgcggcagt-gccattttctttattaagcagatcttccaatggcaccattttgtatagttcatcc-atgc為引物，通過PCR擴增出3.0 kb的目DNA片段。

1.2.2 酵母細胞的轉(zhuǎn)化 挑取活化的酵母單菌落接種于3 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃過夜培養(yǎng)至飽和。取500 μL過夜培養(yǎng)物接種到4.5 mL 2×YPD中，30 ℃培養(yǎng)3～4 h至對數(shù)期。12 000 r/min瞬時離心10 s收集菌體，用無菌水洗1次，再用100 μL 0.1 mol/L LiAc溶液洗2次。向細胞沉淀中依次加入240 μL 50%(質(zhì)量分數(shù)) PEG，36 μL 1 mol/L LiAc，10 μL 10 mg/mL ssDNA，目的DNA 5～10 μg，1 mL吸頭上下吸3～4次，渦旋充分混勻，置于30 ℃孵育30 min，42 ℃水浴熱激30 min。室溫3 000 r/min離心1 min收集菌體，用1 mL無菌水水洗菌體，涂布到選擇性固體平板上，30 ℃培養(yǎng)3～4 d，獲得酵母轉(zhuǎn)化子。

1.2.3 酵母正確轉(zhuǎn)化子的篩選 從酵母細胞轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化子中挑選出10株轉(zhuǎn)化子接種到3 mL SD-HIS液體培養(yǎng)基中，30 ℃過夜培養(yǎng)。取500 μL培養(yǎng)物室溫3 000 r/min離心1 min收集菌體，熒光顯微鏡觀察篩選出有綠色熒光的轉(zhuǎn)化子。將有綠色熒光轉(zhuǎn)化子的菌液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，10 000 r/min 離心1 min收集菌體(約30～50 μL)。加入和細胞體積相當(dāng)?shù)乃嵝圆Ａе?，將細胞重懸?00 μL STES溶液中，再加入200 μL氯仿/異戊醇(V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1)。劇烈震蕩10×30 s。加入200 μL TE，迅速混合，10 000 r/min離心5 min。將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中，加入1/10體積3.0 mol/L NaNc，2倍體積無水乙醇，混勻，置于-80 ℃ 30 min，12 000 r/min離心10 min，棄上清。加入500 μL 75%的無水乙醇，12 000 r/min 離心5 min，棄上清。室溫干燥DNA 10 min，加入50 μL TE(含Rnase，終濃度為20 μg/mL)，55 ℃消化30 min。PCR擴增，電泳檢測。每株基因缺失株至少獲得2株正確轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 細胞預(yù)處理和熒光顯微鏡觀察 將Rim101蛋白的N端成功整合GFP的酵母轉(zhuǎn)化子的單菌落接種到含有3 mL SD-HIS液體培養(yǎng)基的試管中，30 ℃震蕩過夜培養(yǎng)，取300 μL過夜培養(yǎng)液，加入到2.7 mL新鮮YPD液體培養(yǎng)基中，在30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h至對數(shù)生長期，分別取1 mL培養(yǎng)液，加入到2份1.5 mL離心管中，將其中1份培養(yǎng)液3 000 r/min離心1 min收集菌體，然后在菌體中加入1 mL pH 8.0的YPD培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)30 min后熒光顯微鏡下觀察GFP-Rim101融合蛋白的亞細胞定位情況。每個樣品隨機選取約100～200個酵母細胞進行觀察，拍攝DIC和熒光照片,每個菌株隨機選取2個獨立的轉(zhuǎn)化子做熒光定位實驗。

1.2.5 pHAC111-SAC1、pHAC111-PHO85質(zhì)粒的構(gòu)建 用引物SAC1-F(cagtgaattcgagctcggtaccaacgatccttctttccaaacc，下劃線為Kpn1位點)和SAC1-R (gaacatcgtatgggtagcatgcatctctttttaaaggatccg-

gcttgg,下劃線為Sph1位點)擴增含有2.8 kb含有SAC1啟動子和ORF的DNA片段。然后將這個片段克隆到pHAC111的Kpn1位點和Sph1位點。用引物PHO85-F (cgagctcggtacccggggatcccttgacatcttcttcaccgc，下劃線為BanH1位點)和PHO85-R (gaacatcgtatgggtagcatgctgaagcgtggtggtagt-

ac,下劃線為Sph1位點)擴增含有2.0 kb含有PHO85啟動子和ORF的DNA片段。將這個片段克隆到pHAC111的BamH1位點和Sph1位點。

2 結(jié)果與分析

2.1 編碼磷酸酶或激酶的基因缺失對Rim101亞細胞定位的影響

以前的研究表明敲除編碼細胞周期依賴性激酶Pho85的基因，能夠?qū)е罗D(zhuǎn)錄因子Rim101的核內(nèi)積累，這個過程有可能是通過磷酸化作用實現(xiàn)的，因為在體外Pho85能夠磷酸化 Rim101。但是，在PHO85基因的缺失細胞中Rim101的磷酸化水平和野生型相似[12]，這表明Pho85激酶可能不是使Rim101磷酸化的唯一激酶。以HIS3-ADH1-GFP-T1質(zhì)粒為模板， 用引物Rim101-N-GFP-F/ Rim101-N-GFP-R通過PCR擴增出含有His3MX6-PADH1-GFP的3.0 kb左右的DNA整合片段(圖1)。

為了找到Rim101亞細胞定位的新調(diào)節(jié)因子,我們把His3MX6-PADH1-GFP 片段整合到目的菌株RIM101基因的N端，這樣GFP-Rim101融合蛋白的表達就在持續(xù)性(Constitutive)啟動子的控制下。這些目的菌株包括野生型菌株BY4741以及表1和表2中所有基因的缺失菌株。然后在顯微鏡下觀察GFP-Rim101融合蛋白在這些菌株對數(shù)生長期細胞中的亞細胞定位。和以前的報道一致[12]，我們發(fā)現(xiàn)在常用的YPD培養(yǎng)基中(pH 5.4)，野生型細胞中GFP-Rim101分布在細胞質(zhì)內(nèi), 但是在pH 8.0的堿性YPD培養(yǎng)基中, 野生型細胞中GFP-Rim101積累在細胞核中。相比而言, 在pH 5.4和pH 8.0的YPD中,PHO85基因缺失株細胞中GFP-Rim101均積累在細胞核中(圖2)，這說明Pho85是Rim101定位在細胞質(zhì)內(nèi)所必需的。通過質(zhì)粒pHAC181-PHO85把PHO85基因?qū)氲絇HO85基因缺失株細胞后,GFP-Rim101在PHO85基因缺失株細胞中的亞細胞定位變得像野生型細胞中的一樣(圖2)。

在pH 5.4的YPD培養(yǎng)基中,與野生型細胞一致, 72個編碼磷酸酶的非必需基因(表1)和138個編碼激酶的非必需基因(表2)的缺失株細胞中, GFP-Rim101蛋白分布在細胞質(zhì)中(數(shù)據(jù)未顯示)。在pH 8.0的YPD培養(yǎng)基中，這些非必需基因缺失株細胞中的GFP-Rim10都表現(xiàn)出核積累，這一現(xiàn)象與野生型相似(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，篩選結(jié)果表明，在pH 5.4和pH 8.0的YPD培養(yǎng)基中，編碼磷脂酰肌醇磷酸(PtdInsP)磷酸酶的SAC1基因的缺失導(dǎo)致GFP-Rim101在細胞核中積累(圖3)。

圖1 His3MX6-PADH1-GFP 整合 DNA片段的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of the DNA fragment containing the His3MX6-PADH1-GFP cassette

圖2 Pho85 調(diào)控的GFP-Rim101的亞細胞定位Fig.2 Subcellular localization of GFP-Rim101 is regulated by Pho85

2.2 Sac1調(diào)控Rim101的亞細胞定位

為進一步驗證上述結(jié)果，將能夠表達有功能的Sac1-HA融合蛋白的pHAC111-SCA1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到帶有表達融合蛋白GFP-Rim101的SAC1基因缺失株中。結(jié)果表明，導(dǎo)入質(zhì)粒后GFP-Rim101在細胞中的定位與野生型相似，在pH 5.4的YPD培養(yǎng)基中定位在細胞質(zhì)中(圖3)，即Sac1可以調(diào)控Rim101的亞細胞定位。

圖3 Sac1調(diào)控GFP-Rim101的亞細胞定位Fig.3 Subcellular localization of GFP-Rim101 is regulated by Pho85

3 討 論

本文研究了在pH 5.0 和 pH 8.0條件下,釀酒酵母細胞中73個磷酸酶和139個激酶基因?qū)im101在細胞中的定位作用。結(jié)果表明，編碼蛋白激酶Pho85的基因缺失導(dǎo)致GFP-Rim101在pH 5.4條件下就積累在細胞核中，這個結(jié)果與以前報道的一致[12]，同時還發(fā)現(xiàn)編碼磷脂酰肌醇磷酸(PtdInsP)磷酸酶Sac1的基因缺失也使GFP-Rim101在pH 5.4條件下就積累在細胞核中。通過質(zhì)粒把SAC1基因?qū)胨娜笔Ь? 逆轉(zhuǎn)了GFP-Rim101在pH 5.4條件下的亞細胞定位, 說明Sac1確實可以調(diào)控Rim101的亞細胞定位。Sac1在高爾基體中參與磷脂酰肌醇[4]P的水解，也定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，參與蛋白質(zhì)運輸、加工、分泌和細胞壁維護，通過磷脂酰肌醇[4] P的水解調(diào)控鞘脂的生物合成[13-15]。

釀酒酵母細胞中SAC1基因的缺失導(dǎo)致Rim101在細胞核中有積累，說明Rim101在細胞核中的積累需要SAC1基因。但積累在細胞核中的Rim101是否有轉(zhuǎn)錄抑制活性還不能確定，因為全長形式的Rim101也能積累在細胞核并且與DNA結(jié)合，但是其轉(zhuǎn)錄抑制功能仍然依賴于剪切過的被激活的短的Rim101[1]。因此, Sac1調(diào)控Rim101亞細胞定位的具體機制還需進一步研究。本研究結(jié)果為Rim101途徑的調(diào)控機制提供了新線索。

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Genomic Screening of Genes Encoding Phosphatases and Kinases Involved in Regulation of Nuclear Accumulation of the Transcription Factor Rim101 inSaccharomycescerevisiae

ZHANG Yan, WANG Di, ZHAO Yun-ying, JIANG Ling-huo

(Schl.ofBiotechnol. &theNat’lEngin.Lab.forCerealFerment’nTechnol.,JiangnanUni.,Wuxi214122)

Rim101 is a zinc-finger structured transcriptional factor that functions in the response ofSaccharomycescerevisiaecells to both alkaline and salt stress, calcium homeostasis, cell differentiation and selenite toxicity. Previous studies have shown that deletion of the cyclin-dependent kinase genePHO85 leads to the nuclear accumulation of Rim101. In order to identify new regulatory factors in the subcellular localization of Rim101, deletion mutants of non-essential genes encoding 73 phosphatases or 139 kinases was screened through a fluorescent microscopy approach. It was found that the encoded thosphatidylinositol phosphate (PtdInsP) phosphatase Sac1 regulates the subcellular localization of Rim101.

RIM101;Sac1; phosphatase; kinase

國家自然科學(xué)基金項目 (81371784，81571966，31301021);江南大學(xué)自主研究計劃重點項目(JUSRP51313B);

張艷 女，碩士研究生。從事酵母遺傳學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail:1247684304@qq.com

* 通訊作者。男，博士，教授，博士生導(dǎo)師。從事酵母和絲狀真菌遺傳學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail:linghuojiang@Jiangnan.edu.cn

2016-03-04；

2016-03-17

Q814

A

1005-7021(2016)05-0009-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.05.002

江蘇市農(nóng)業(yè)支撐項目(BE2014306)