洗發(fā)、護(hù)發(fā)化妝品微生物檢查方法學(xué)研究

閔 紅， 周志云， 楊曉莉， 李 翠

( 陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安 710065)

洗發(fā)、護(hù)發(fā)化妝品微生物檢查方法學(xué)研究

閔 紅， 周志云， 楊曉莉， 李 翠

( 陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安 710065)

為提高化妝品潛在微生物的陽性檢出率，建立洗發(fā)、護(hù)發(fā)類化妝品微生物限度和控制菌檢查方法。采用常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過濾法對4種洗發(fā)、護(hù)發(fā)類化妝品進(jìn)行微生物限度與控制菌方法學(xué)研究。結(jié)果顯示，飄柔長效柔順滋養(yǎng)洗發(fā)露、海飛絲去屑洗發(fā)露、飄柔人參滋養(yǎng)潤發(fā)精華素、力士密集滋養(yǎng)修復(fù)-發(fā)膜級精華素菌落總數(shù)檢測方法分別為0.2 mL/皿法、800 mL/膜法、0.5 mL/皿法和300 mL/膜法；霉菌及酵母菌檢測方法分別為300 mL/膜法、300 mL/膜法、1 mL/皿法和1 mL/皿法；除海飛絲去屑洗發(fā)露采用培養(yǎng)基稀釋法，其他均采用常規(guī)法進(jìn)行控制菌檢查。建議在化妝品微生物檢驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行微生物方法研究，從而提高化妝品“潛在”病原菌的檢出率。

洗發(fā)、護(hù)發(fā)類化妝品；抑菌性；微生物方法學(xué)

洗發(fā)、護(hù)發(fā)類化妝品是現(xiàn)代人生活不可缺少的日用品，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、無機(jī)鹽和水分，有些還含有水解膠原蛋白、植物提取物、多種氨基酸等，是微生物生長良好的培養(yǎng)基。化妝品中常被添加防腐劑用來有效防止化妝品的二次污染，即消費(fèi)者使用過程中發(fā)生的污染[1]。我國衛(wèi)生部頒布的《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中允許使用的化妝品防腐劑有56種，其中，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、凱松使用頻率分別排名在前三位[2-3]?，F(xiàn)行2007年版《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》[4]中微生物檢驗(yàn)通過在培養(yǎng)基加入吐溫-80或在稀釋液加入卵磷脂來中和化妝品中的防腐劑等抑菌性物質(zhì)。現(xiàn)實(shí)生活中化妝品所添加防腐劑種類繁雜，不同類化妝品防腐劑含量的差異也較大[5-7]，很難確保其能否被有效中和，從而造成化妝品中潛在致病菌的“漏檢”。廣州市對241份化妝品留樣進(jìn)行復(fù)檢，發(fā)現(xiàn)許多合格產(chǎn)品在復(fù)檢中超標(biāo)，其中存放3年內(nèi)的產(chǎn)品微生物復(fù)檢超標(biāo)率為0.82%，3年以上的為5.88%[8]。該研究同樣證明了現(xiàn)行2007年版《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》[4]中微生物檢驗(yàn)方法會(huì)造成化妝品中微生物的“漏檢”，化妝品污染的微生物受防腐劑抑菌作用不能成長繁殖，細(xì)胞受到損傷但并未死亡，隨著時(shí)間延長，防腐劑抑菌效力逐漸降低，受損微生物逐漸復(fù)蘇并進(jìn)行生長繁殖，從而對人類健康造成危害。因此，本研究參考USP34版中防腐體系對微生物的抑殺效果試驗(yàn)[9]和中國藥典2010年版中微生物限度檢查方法學(xué)研究[10]，選取4種常見洗發(fā)、護(hù)發(fā)類化妝品進(jìn)行微生物檢驗(yàn)方法學(xué)研究，以期通過有效減弱或消除化妝品中防腐劑等物質(zhì)的抑菌作用，達(dá)到提高化妝品微生物陽性檢出率的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌 大腸埃希菌(Escherichiacoli)CMCC(B) 44102、金黃色葡萄球菌(Staphylococccusaureus)CMCC(B) 26003、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)CMCC(B) 63501、白色念珠菌(Candidaalbicans) CMCC(F) 98001、黑曲霉 (Aspergillusniger) CMCC(F) 98003、銅綠假單胞菌 (Pseudomonasaeruginosa)CMCC(B) 10104，均由中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心提供。

1.1.2 供試品 A：飄柔長效柔順滋養(yǎng)洗發(fā)露(批號：40141864F6)；B：海飛絲去屑洗發(fā)露(批號：32441864GKJ)；C：飄柔人參滋養(yǎng)潤發(fā)精華素(批號：40350385DB)；D：力士密集滋養(yǎng)修復(fù)-發(fā)膜級精華素(批號：20161008BP4I)。

1.1.3 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂、孟加拉紅培養(yǎng)基、SCDLP液體培養(yǎng)基、含中和劑雙料膽鹽乳糖、十六烷三甲基溴化銨瓊脂、Baird-Parker培養(yǎng)基，均由北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1.1.4 儀器 HFSafe-1200LC生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器公司)、 FC752型HTY一次性薄膜過濾器(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司)、LRH-250生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)、WGP-600隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備 根據(jù)中國藥典微生物限度檢查法[10]進(jìn)行菌液制備，采用10倍稀釋法將6種試驗(yàn)菌稀釋至50～100 cfu/mL。

1.2.2 供試液制備 根據(jù)2007年版《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》[4]進(jìn)行供試品制備，首先稱取樣品10 g，加入90 mL滅菌生理鹽水，充分振蕩混勻，靜置15 min，取其上清液作為1∶10的供試液。

1.2.3 微生物限度方法驗(yàn)證 ①常規(guī)法(1 mL/皿法)：取1 mL供試液和50～100 CFU的大腸埃希菌加入培養(yǎng)皿，立即傾注20 mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后35 ℃培養(yǎng)48 h，記錄菌落數(shù)作為試驗(yàn)組；測定供試品本底菌落數(shù)，作為供試品對照組；測定相應(yīng)加入的大腸埃希菌菌落數(shù)，作為菌液組。回收率(%)=((試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù))/菌液組菌落數(shù))×100%。根據(jù)公式計(jì)算供試品大腸埃希菌回收率，同法計(jì)算供試品金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率。加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌的培養(yǎng)皿傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，白色念珠菌和黑曲霉傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。供試品5種試驗(yàn)菌的回收率均需進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。若大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌3次重復(fù)試驗(yàn)所得回收率均高于70%，可采用常規(guī)法對供試品進(jìn)行菌落總數(shù)檢查；若白色念珠菌和黑曲霉的回收率均高于70%，可采用常規(guī)法對供試品進(jìn)行霉菌及酵母菌數(shù)檢查。若供試品任意試驗(yàn)菌任意一次回收率低于70%，需采用培養(yǎng)基稀釋法繼續(xù)對供試品此試驗(yàn)菌進(jìn)行微生物方法研究。②培養(yǎng)基稀釋法(包括0.5 mL/皿法和0.2 mL/皿法)：試驗(yàn)組：分別向培養(yǎng)皿加入供試液0.5 mL和0.2 mL，再加入各50～100 CFU試驗(yàn)菌，其余操作同常規(guī)法。若供試品任意試驗(yàn)菌任意一次回收率低于70%，需采用薄膜過濾法繼續(xù)對供試品此試驗(yàn)菌進(jìn)行微生物方法研究。③薄膜過濾法(包括300 mL/膜法與800 mL/膜法)： 試驗(yàn)組：將供試液以500 r/min離心3 min，取上清液10 mL加入100 mL稀釋液中，再加入50～100 CFU試驗(yàn)菌，用1%蛋白胨緩沖液進(jìn)行沖洗過濾，沖洗量分別為300 mL/膜與800 mL/膜，濾干后取出濾膜貼于培養(yǎng)基，測定其菌落數(shù)，作為試驗(yàn)組。其余操作同常規(guī)法。

1.2.4 控制菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證 ①常規(guī)法(大腸埃希菌：10 mL/管法，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌：90 mL/瓶法)：大腸埃希菌：取1∶10供試液10 mL，分別接入2管(10 mL/管)雙倍乳糖膽鹽(含中和劑)培養(yǎng)基，其中1管接種50～100 CFU大腸埃希菌作為試驗(yàn)組，另一管作為陰性對照組；金黃色葡萄球菌：取1∶10供試液10 mL，分別接入2瓶(90 mL/瓶)SCDLP液體培養(yǎng)基，其中1瓶接種50～100 CFU金黃色葡萄球菌作為試驗(yàn)組，另一管作為陰性對照組；銅綠假單胞菌：取1∶10供試液10 mL，分別接入2瓶(90 mL/瓶)SCDLP液體培養(yǎng)基，其中1瓶接種10～100 CFU銅綠假單胞菌作為試驗(yàn)組，另一管作為陰性對照組。試驗(yàn)組與陰性對照組均置規(guī)定溫度下培養(yǎng)24 h后按照2007年版《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》規(guī)定[4]進(jìn)行后續(xù)鑒定試驗(yàn)。②培養(yǎng)基稀釋法(大腸埃希菌：10 mL/管法和50 mL/管法，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌：90 mL/瓶法和400 mL/瓶法)：大腸埃希菌：取1∶10供試液10 mL，分別接入2管(20 mL/管)和2管(50 mL/管)雙倍乳糖膽鹽(含中和劑)培養(yǎng)基；金黃色葡萄球菌：取1∶10供試液10 mL，分別接入2瓶(200 mL/瓶)和2瓶(400 mL/瓶)SCDLP液體培養(yǎng)基；銅綠假單胞菌：取1∶10供試液10 mL，分別接入2瓶(200 mL/瓶)和2瓶(400 mL/瓶)SCDLP液體培養(yǎng)基，其余操作同常規(guī)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物限度方法學(xué)

飄柔長效柔順滋養(yǎng)洗發(fā)露(樣品A)采用1 mL/皿法進(jìn)行菌落總數(shù)方法學(xué)研究時(shí)(表1)，大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌回收率高于70%，而金黃色葡萄球菌平均回收率僅為29%，當(dāng)采用0.5 mL/皿法與0.2 mL/皿法時(shí)，金黃色葡萄球菌平均回收率分別為52%和89%，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2 mL/皿法)對樣品A進(jìn)行菌落總數(shù)檢查；飄柔長效柔順滋養(yǎng)洗發(fā)露采用1、0.5和0.2 mL/皿法進(jìn)行霉菌及酵母菌方法學(xué)研究時(shí)，黑曲霉回收率均為0，直到采用300 mL/膜法時(shí)，平均回收率為86%，應(yīng)采用薄膜過濾法(300 mL/膜)對樣品A進(jìn)行霉菌及酵母菌檢查。海飛絲去屑洗發(fā)露(樣品B)采用1、0.5和0.2 mL/皿法進(jìn)行微生物方法學(xué)研究時(shí)，5種試驗(yàn)菌的回收率均為0，當(dāng)采用300 mL/膜法時(shí)，金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、白色念珠菌和黑曲霉回收率均高于70%，大腸埃希菌回收率為0，當(dāng)采用800 mL/膜法時(shí)，回收率為96%，應(yīng)采用薄膜過濾法(800 mL/膜)對樣品B進(jìn)行菌落總數(shù)檢查，采用薄膜過濾法(300 mL/膜)進(jìn)行霉菌及酵母菌檢查。飄柔人參滋養(yǎng)潤發(fā)精華素(樣品C)采用1 mL/皿法進(jìn)行微生物方法學(xué)研究時(shí)，除大腸埃希菌的回收率為61%，其他4種試驗(yàn)菌回收率均高于70%，直到采用0.5 mL/皿法時(shí)，大腸埃希菌回收率才高于70%，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法(0.5 mL/皿)對樣品C進(jìn)行菌落總數(shù)檢查，采用常規(guī)法(1 mL/皿)進(jìn)行霉菌及酵母菌檢查。力士密集滋養(yǎng)修復(fù)-發(fā)膜級精華素(樣品D)采用1 mL/皿法進(jìn)行微生物方法學(xué)研究時(shí)，除金黃色葡萄球菌外，其他4種試驗(yàn)菌回收率均高于70%，采用0.5和0.2 mL/皿法時(shí)，金黃色葡萄球菌回收率分別為44%和61%，直到采用300 mL/膜法時(shí)，金黃色葡萄球菌回收率才高于70%，應(yīng)采用薄膜過濾法(300 mL/膜)對樣品D進(jìn)行菌落總數(shù)檢查，采用常規(guī)法(1 mL/皿)進(jìn)行霉菌及酵母菌檢查。

表1 微生物限度方法研究回收率Table 1 Recovery rate of microbial limit methodology

續(xù)表1

注：“/”表示由于供試品回收率已經(jīng)高于70%，未進(jìn)行方法學(xué)研究試驗(yàn)

2.2 控制菌檢查方法學(xué)

飄柔長效柔順滋養(yǎng)洗發(fā)露(樣品A)、飄柔人參滋養(yǎng)潤發(fā)精華素(樣品C)與力士密集滋養(yǎng)修復(fù)-發(fā)膜級精華素(樣品D)采用常規(guī)法(糞大腸菌群10 mL/管、銅綠假單胞菌90 mL/瓶、金黃色葡萄球菌90 mL/瓶)進(jìn)行控制菌方法學(xué)研究時(shí)(表2～4)，試驗(yàn)組均檢出糞大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌，陰性對照無菌生長，可采用常規(guī)法對樣品A、C、D進(jìn)行控制菌檢查。海飛絲去屑洗發(fā)露(樣品B)采用10 mL/管法與20 mL/管法進(jìn)行糞大腸菌群方法學(xué)研究時(shí)，試驗(yàn)組無菌生長，采用50 mL/管法時(shí)，試驗(yàn)組均檢出糞大腸菌群，陰性對照無菌生長，可采用培養(yǎng)基稀釋法(50 mL/管)對樣品B進(jìn)行糞大腸菌群檢查；樣品B采用90 mL/瓶法與200 mL/瓶法分別進(jìn)行銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌方法學(xué)研究時(shí)，試驗(yàn)組均無菌生長，采用400 mL/瓶法時(shí)，試驗(yàn)組分別檢出銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌，陰性對照無菌生長，可采用培養(yǎng)基稀釋法(400 mL/瓶)對樣品B進(jìn)行銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌檢查。

表2 洗發(fā)、護(hù)發(fā)類化妝品糞大腸菌群方法學(xué)研究Table 2 Research result on methodology of fecal coliforms for shampoo and hair conditioner

注：“/”表示由于無菌落生長，未進(jìn)行方法學(xué)研究試驗(yàn)，下表同

表3 洗發(fā)、護(hù)發(fā)類化妝品銅綠假單胞菌方法學(xué)研究結(jié)果Table 3 Research result on methodology of Pseudomonas aeruginosa for shampoo and hair conditioner

表4 洗發(fā)、護(hù)發(fā)類化妝品金黃色葡萄球菌方法學(xué)研究結(jié)果Table 4 Research result on methodology of Staphylococccus aureus for shampoo and hair conditioner

3 討 論

在微生物限度方法學(xué)研究中，金黃色葡萄球菌代表革蘭陽性菌，大腸埃希菌代表革蘭陰性菌，枯草芽胞桿菌代表芽胞桿菌，白色念珠菌代表酵母菌，黑曲霉代表霉菌[11]。對抑菌物質(zhì)含量低的供試品，可通過培養(yǎng)基稀釋法減少供試品抑菌物質(zhì)的濃度，從而消除其對微生物生長的影響[12]。對抑菌物質(zhì)含量高的供試品，可通過薄膜過濾法將抑菌物質(zhì)沖洗過濾，微生物截留在濾膜上，再將濾膜貼到適宜的培養(yǎng)基培養(yǎng)，進(jìn)行微生物限度檢查[13]。

試驗(yàn)結(jié)果表明，采用常規(guī)法對4種洗發(fā)、護(hù)發(fā)類化妝品進(jìn)行微生物方法學(xué)研究時(shí)，均存在試驗(yàn)菌的回收率低于70%的現(xiàn)象，如果飄柔長效柔順滋養(yǎng)洗發(fā)露金黃色葡萄球菌的平均回收率為29%，黑曲霉為0，表明其對霉菌有較強(qiáng)的抑菌作用，對革蘭陽性菌有較弱的抑菌作用；海飛絲去屑洗發(fā)露所有試驗(yàn)菌的回收率均為0，表明其對所有菌群均表現(xiàn)較強(qiáng)的抑菌作用，其中對革蘭陰性菌抑菌作用最強(qiáng)；飄柔人參滋養(yǎng)潤發(fā)精華素大腸埃希菌的平均回收率為61%，表明其對革蘭陰性菌表現(xiàn)較弱的抑菌作用；力士密集滋養(yǎng)修復(fù)-發(fā)膜級精華素金黃色葡萄球菌的平均回收率為33%，表明其對革蘭陽性菌有較強(qiáng)的抑菌作用。

如果采用常規(guī)法(即化妝品衛(wèi)生規(guī)范(2007)中微生物檢驗(yàn)方法)進(jìn)行微生物檢驗(yàn)，勢必造成“漏檢”現(xiàn)象。因此，建議參考USP34版中防腐劑體系對微生物的抑菌效能試驗(yàn)[9]和中國藥典2010年版中微生物限度方法學(xué)試驗(yàn)[10]，在化妝品微生物檢驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行微生物方法學(xué)研究，即通過培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過濾法結(jié)合加中和劑等方法對化妝品檢驗(yàn)方法進(jìn)行有效性驗(yàn)證；以準(zhǔn)確消除化妝品中防腐劑等抑菌物質(zhì)的抑菌作用，提高化妝品潛在微生物的陽性檢出率。

本研究對市場常見4種洗發(fā)、護(hù)發(fā)類化妝品進(jìn)行微生物方法學(xué)研究，分析了化妝品中防腐劑等抑菌物質(zhì)對特定微生物菌群的抑制作用，提出了化妝品微生物方法學(xué)驗(yàn)證理論。下一步將開展化妝品中防腐劑抑菌效力與微生物污染之間關(guān)系研究，希望通過對化妝品中防腐劑類型與含量的測定，得出微生物限度與控制菌的檢查方法。

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Microbial Limit and Microbe-Controlling Method for Shampoos and Hair Conditioners

MIN Hong, ZHOU Zhi-yun, YANG Xiao-li, LI Cui

(ShaanxiInst.forFood&DrugControl,Xi’an710065)

In order to improve the positive detection rate of potential microbe in cosmetics, a microbial limit and microbe-controlling method for shampoos and hair conditioners was established. Routine method, medium diluting method, membrane filtration method was adopted for the study of microbial limit and microbe-controlling method. The results showed that bacterial count of Rejoice Long-lasting Soft Nourishing Shampoo, Head and Shoulders Anti-dandruff Shampoo, Rejoice Ginseng Nourishing Essence, Lux Intensive Nourishing Repairment Essence should be tested by the method of 0.2 mL/dish method (dm), 800 mL/membrane method (mm), 0.5 mL/dm and 300 mL/mm, respectively. Yeast and mold count were 300 mL/mm, 300 mL/mm, 1 mL/dm and 1 mL/dm; by routine method and routine method. Microbe-controlling except for Head and Shoulders Anti-dandruff Shampoo was tested by medium diluting method, the other were all using routine method to carry out the detection of micro-controlling. Therefore, it is suggested that before verifying microbial method, study on microbial method should be carried out, thus improving detection rates of potential microbe in cosmetics.

cosmetics of shampoos and hair conditioners; microbial inhibition; microbial methodology

陜西省食品藥品檢驗(yàn)所博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(SBSjj-201201)

閔紅 女, 主管藥師,博士。主要從事食品、藥品與化妝品微生物檢測與研究。

Tel: 029-62288452，E-mail: hong-min518@163.com

2016-01-08；

2016-02-18

Q93-332

B

1005-7021(2016)05-0103-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.05.018