人巨細(xì)胞病毒UL55編碼蛋白結(jié)合蛋白的篩選與鑒定

吉耀華， 劉 暢， 齊 瑩， 馬艷萍， 黃郁靜， 柳中洋， 阮 強(qiáng)

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 病毒室，遼寧 沈陽(yáng) 110004)

人巨細(xì)胞病毒UL55編碼蛋白結(jié)合蛋白的篩選與鑒定

吉耀華， 劉 暢， 齊 瑩， 馬艷萍， 黃郁靜， 柳中洋， 阮 強(qiáng)*

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 病毒室，遼寧 沈陽(yáng) 110004)

從人胎腦cDNA文庫(kù)中篩選和鑒定出與人巨細(xì)胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV) UL55編碼蛋白結(jié)合的蛋白。將UL55基因編碼區(qū)克隆到誘餌載體pGBKT7中，在證實(shí)UL55蛋白不具有自激活作用的前提下，采用Match-maker GAL酵母雙雜交系統(tǒng)篩選人胎腦cDNA文庫(kù)中與UL55蛋白結(jié)合的宿主蛋白，用酵母雙雜交回轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證UL55蛋白與獲得的蛋白結(jié)合的可靠性。將酵母雙雜交篩選出的文庫(kù)蛋白烯醇化酶1(enolase1, ENO 1)構(gòu)建到pGEX-4T-2載體上，利用GST pull-down技術(shù)體外驗(yàn)證ENO 1與HCMV UL55蛋白的結(jié)合。 并依據(jù)所篩選出蛋白的生物學(xué)功能分析UL55蛋白可能的生物學(xué)功能。結(jié)果顯示有10種蛋白與HCMV UL55編碼蛋白結(jié)合。應(yīng)用GST pull-down技術(shù)檢測(cè)到ENO 1 與HCMV UL55相互結(jié)合的蛋白條帶。成功地篩選出10種與UL55蛋白相互結(jié)合的宿主蛋白，GST pull-down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明ENO 1可以與HCMV UL55蛋白直接結(jié)合，為進(jìn)一步研究UL55蛋白的功能提供了新的線索。

人巨細(xì)胞病毒；UL55編碼蛋白；人胎腦cDNA 文庫(kù)；ENO 1；相互結(jié)合

人巨細(xì)胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)是引起艾滋病、器官移植及免疫功能缺陷患者的致病原，同時(shí)也是引起圍生期感染、新生兒疾病和先天畸形的重要病原體；HCMV先天感染可引起小兒黃疸型肝炎、先天性巨結(jié)腸、肝脾腫大、膽道閉鎖、神經(jīng)性耳聾、小頭畸形和顱內(nèi)鈣化等多種消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病或畸形，嚴(yán)重者發(fā)生全身性感染綜合征[1-2]。在無(wú)癥狀感染的新生兒中，10%～17%在出生后1年或數(shù)年出現(xiàn)遲發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙, 表現(xiàn)為智力發(fā)育遲緩、聽力缺失等[3]。HCMV是人皰疹病毒科中已知基因組最大的病毒，能編碼200多種蛋白質(zhì),包括超過65種糖蛋白，其中至少有10種包膜糖蛋白。糖蛋白B(glycoprotein B，gB) 是由HCMV UL55基因編碼，是 HCMV包膜中最豐富的糖蛋白，占包膜蛋白的一半以上。gB蛋白卷曲在成熟病毒顆粒的包膜上，與病毒增殖周期中的吸附、融合密切相關(guān)[4-5]，而且gB蛋白具有強(qiáng)抗原性, 是中和抗體的關(guān)鍵靶目標(biāo)，且參與細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)，是HCMV潛在的毒力因素。鑒于gB 蛋白在HCMV 感染中的重要作用，為進(jìn)一步探討gB蛋白生物學(xué)特性，本研究采用酵母雙雜交技術(shù)從人胎腦cDNA文庫(kù)中篩選出與gB蛋白相互結(jié)合的蛋白，并采用分子生物學(xué)方法研究UL55基因編碼的gB蛋白生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 材料

樣本采用中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院病毒室分離的臨床低傳代HCMV分離株Han株，且傳代小于5 次。HCMV分離株Han在GenBank收錄中序列號(hào)為GQ981646。Match-maker GAL Two-Hybrid System的酵母雙雜交系統(tǒng)購(gòu)自Clontech公司；MatchmakerTMcDNA Libraries人胎腦cDNA文庫(kù)由中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所肖庚富(教授)贈(zèng)予。采用Sigma公司的相關(guān)篩選試劑； DNA測(cè)序由Invitrogen公司完成。

1.2 方法

1.2.1 酵母表達(dá)重組質(zhì)粒pGBKT7-UL55的構(gòu)建 將HCMV分離株Han感染人胚肺成纖維細(xì)胞并提取DNA，以此作為HCMV UL55基因擴(kuò)增模板。按照HCMV分離株Han 基因序列，應(yīng)用軟件primer 5.0 設(shè)計(jì)引物，用于擴(kuò)增HCMV UL55 的編碼序列，通過引物的5′末端引入載體pGBKT7的多克隆位點(diǎn)序列的EcoRⅠ和BamHⅠ兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)(下劃線)并加入保護(hù)性核苷酸。上游引物序列：5′-CGCGAATTCGAATCCAGGATCTGGTGCCTG-3′(含EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn))；下游引物序列：5′-CGCGGATCCATAGAGCCAGGTGCTGCCGCG-3′(含BamHⅠ酶切位點(diǎn))，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為50 μL，PCR 條件為94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸10 min。將UL55擴(kuò)增產(chǎn)物純化后依次用EcoRⅠ、BamH I進(jìn)行酶切，在T4 DNA 連接酶的作用下與使用相同內(nèi)切酶處理的載體連接。得到的連接產(chǎn)物被轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的大腸埃希菌DH5α中，然后將已轉(zhuǎn)化的DH5α菌接種到LB 固體培養(yǎng)基(含有卡那霉素)，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落克隆菌，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增克隆中的插入片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳篩選出含有UL55特異性序列的陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆菌接種到LB液體培養(yǎng)基(含有卡那霉素)，37 ℃培養(yǎng)過夜后，提取質(zhì)粒。質(zhì)粒測(cè)序后驗(yàn)證克隆菌中插入序列的正確性。

表1 引物及序列Table 1 Primer and sequences

1.2.2 應(yīng)用酵母雙雜交篩選人胎腦cDNA文庫(kù)中與HCMV UL55基因編碼蛋白相互結(jié)合的蛋白 ①提取以pACT2(含轉(zhuǎn)錄激活域)為載體的人胎腦cDNA文庫(kù)質(zhì)粒。②實(shí)驗(yàn)中酵母雙雜交篩選嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行。將重組質(zhì)粒pGBKT7-UL55用醋酸鋰(LiAc)法轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞AH109中，把提取的cDNA文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含有pGBKT7-UL55的AH109酵母細(xì)胞中，把轉(zhuǎn)化后的菌液涂布到亮氨酸/色氨酸缺陷(-Leu/-Trp)的二缺平板和腺嘌呤/組氨酸/亮氨酸/色氨酸缺陷(-Ade/-His/-Leu/-Trp)的四缺平板，置于30 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)。挑取生長(zhǎng)良好的克隆進(jìn)行酵母菌增殖。③進(jìn)行顯色反應(yīng)，30 ℃溫箱孵育8 h，用玻璃珠法將酵母菌中顯藍(lán)色的克隆提取酵母質(zhì)粒，應(yīng)用電穿孔的轉(zhuǎn)化方法(電壓2.5 kV，電阻200 Ω，電脈沖25 μF)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒到TG1大腸埃希菌中，在平板中(氨卞青霉素抗性)篩選人胎腦文庫(kù)克隆。④將提取的大腸埃希菌中的文庫(kù)質(zhì)?；剞D(zhuǎn)到含重組質(zhì)粒pGBKT7-UL55的酵母菌中，把轉(zhuǎn)化后的菌液涂布到四缺缺陷培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)觀察其生長(zhǎng)情況。選取可在缺陷培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好的菌落，增殖陽(yáng)性菌并提取質(zhì)粒。采用DNA測(cè)序方法檢測(cè)與pGBKT7-UL55相互結(jié)合的人胎腦cDNA 文庫(kù)基因序列。應(yīng)用程序BLAST和數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank分析篩選出序列對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)種類。

1.2.3 構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-烯醇化酶1(enolase1, ENO 1) 應(yīng)用Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega, USA)提取pACT2-ENO 1質(zhì)粒，利用EcoRⅠ和XhoⅠ (Takara Bio, Inc., Dalian, China)兩種限制性內(nèi)切酶酶切文庫(kù)質(zhì)粒，在T4 DNA 連接酶的作用下將純化的ENO 1編碼序列與同時(shí)進(jìn)行雙酶切的含有GST標(biāo)簽的pGEX-4T-2載體 (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ, USA) 連接，并轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物到感受態(tài)大腸埃希菌BL21中。并將轉(zhuǎn)化后的大腸埃希菌BL21接種到LB 固體培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基含有氨芐霉素，置于37 ℃溫箱內(nèi)。第2天隨機(jī)挑取陽(yáng)性克隆，將菌落中質(zhì)粒的插入片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳后篩選出陽(yáng)性結(jié)果。并將陽(yáng)性克隆接種到含氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中，過夜后提取菌液質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證克隆結(jié)果。構(gòu)建的ENO 1融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒命名為pGEX-4T-ENO 1。

1.2.4 GST-ENO 1融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-ENO 1轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)菌株，挑取單個(gè)克隆到裝有10 mL LB(含100 μg/mL Amp)的50 mL BD管中，37 ℃、225 r/min 振蕩培養(yǎng)至OD600值為1.0～1.5，加入IPTG(終濃度1 mmol/L)，25 ℃培養(yǎng)3 h，6 000 r/min離心10 min，4 ℃離心收集細(xì)菌，棄上清，將菌體沉淀于-20 ℃保存。

1.2.5 GST pull-down 實(shí)驗(yàn) 利用TNT體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)以pGBKT7-UL55重組質(zhì)粒進(jìn)行體外翻譯表達(dá)pUL55蛋白，作為捕獲蛋白；按照MagneGSTMPull-down System操作說明將提取的大pGEX-4T-ENO 1蛋白菌體裂解作為誘餌蛋白，室溫下?lián)u床孵育30 min, 捕獲帶有GST標(biāo)簽的蛋白及蛋白復(fù)合體。經(jīng)3次洗脫后，20 μL MagneGSTTMBinding/Wash Buffer 重懸GST-ENO 1，加入TNT 體外表達(dá)的pGBKT7-UL55重組質(zhì)粒 (80 μL)，MagneGSTTM Binding/Wash Buffer定量至800 μL，于4 ℃層析柜中孵育1.5 h，加入MagneGSTTM Binding/Wash Buffer洗滌3次。將上述樣品加入含SDS 的上樣緩沖液，100 ℃下處理5 min，13 000 r/min 離心2 min, 采用GST抗體進(jìn)行Western blot分析回收樣本中的蛋白復(fù)合物，ECL化學(xué)發(fā)光法鑒定結(jié)果并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pGBKT7-UL55的構(gòu)建及鑒定

把HCMV UL55基因片段應(yīng)用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增長(zhǎng)度為723 bp，并將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到酵母表達(dá)載體pGBKT7上。之后采用pGBKT7質(zhì)粒兩端的上、下游通用引物對(duì)得到的pGBKT7-UL55克隆鑒定。擴(kuò)增含pGBKT7-UL55質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆(圖1)，通過DNA測(cè)序分析證明插入序列及插入位置符合預(yù)期。

圖1 PCR 擴(kuò)增pGBKT7-UL55 重組 質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 PCR amplification pGBKT7-UL55 recombinant plasmid by agarose gel electrophoresisM:DNA marker；1：pGBKT7-UL55

2.2 從文庫(kù)中篩選出與質(zhì)粒pGBKT7-UL55相互作用的蛋白

在色氨酸缺陷(SD/-Trp)的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，由于SD/-Trp的酵母細(xì)胞AH109株可被pGBKT7為表達(dá)載體的蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生Trp。結(jié)果表明，在SD/-Trp 的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化pGBKT7-UL55的AH109酵母細(xì)胞能夠成功生長(zhǎng)。在1∶10色氨酸缺陷(SD/-Trp)的培養(yǎng)基中觀察有75個(gè)酵母菌生長(zhǎng)，計(jì)算轉(zhuǎn)化效率為6×103cfu/ng。 利用醋酸鋰順序轉(zhuǎn)化法，在含有重組質(zhì)粒pGBKT7-UL55的酵母菌AH109中成功轉(zhuǎn)入人胎腦cDNA文庫(kù)。把轉(zhuǎn)化后的菌液涂布到亮氨酸/色氨酸缺陷的二缺平板和腺嘌呤/組氨酸/亮氨酸/色氨酸缺陷的四缺平板培養(yǎng)基中，置于30 ℃孵箱培養(yǎng)5 d，共計(jì)15個(gè)四種氨基酸缺陷的平板上有65個(gè)酵母菌落，隨后進(jìn)行多次篩選以避免文庫(kù)信息丟失。

2.3 對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒的驗(yàn)證、鑒定和序列分析

通過顯色反應(yīng)，選取13個(gè)增殖獲得的陽(yáng)性克隆。將提取的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸埃希菌TG1，擴(kuò)增后得到片段大小不同的產(chǎn)物。用回轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)對(duì)得到的文庫(kù)質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證后，挑選26個(gè)克隆。對(duì)這些克隆進(jìn)行DNA測(cè)序，同源序列比對(duì)使用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST程序進(jìn)行，最后獲得13個(gè)與HCMV UL55基因編碼蛋白有結(jié)合的多肽序列,共篩選出10種與HCMV UL55相互作用蛋白。

2.4 回轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

篩選后文庫(kù)質(zhì)粒再次回轉(zhuǎn)到含有pGBKT7-UL55基因的酵母菌中，涂布于四缺培養(yǎng)基平板進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)篩選后，挑取序列結(jié)果一致的陽(yáng)性克隆，進(jìn)行DNA測(cè)序，應(yīng)用軟件分析后，有10種蛋白的編碼序列與篩選獲得序列的同源性在90%以上(表2)。

表2 酵母雙雜交篩選陽(yáng)性克隆與GenBank同源比對(duì)結(jié)果Table 2 Positive clones with GenBank homology alignment results by yeast two-hybrid screening

2.5 pGEX-4T-2-ENO 1 的構(gòu)建與鑒定

利用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切文庫(kù)質(zhì)粒pACT2-ENO 1和pGEX-4T-2載體，經(jīng)T4 DNA ligase過夜連接后純化，將連接純化產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)BL21細(xì)胞，得到pGEX-4T-ENO 1，瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果見圖2。

圖2 pGEX-4T-ENO 1重組質(zhì)粒PCR鑒定Fig.2 The recombinant plasmid of pGEX-4T-ENO 1 identified by PCR

M:DNA marker;1～6：陰性結(jié)果；7：陽(yáng)性條帶為成功構(gòu)建pGEX-4T-2-ENO 1

M:DNA marker;1-6:Negative results;7:pGEX-4T-2-ENO 1

2.6 GST-ENO 1 與HCMV UL55編碼蛋白相互結(jié)合的體外驗(yàn)證

用 GST pull-down 技術(shù)驗(yàn)證GST-ENO 1 與HCMV UL55編碼蛋白的相互結(jié)合，融合蛋白GST-ENO 1 與MagneGSTTMParticles結(jié)合，再將pGBKT7-UL55與GST-ENO 1充分結(jié)合，用上樣緩沖液將結(jié)合在MagneGSTTMParticles上的蛋白溶解，樣品處理后進(jìn)行SDS-PAGE，用GST抗體進(jìn)行Western印跡檢測(cè)，結(jié)果見圖3。與酵母雙雜交結(jié)果一致，GST-ENO 1 可以捕獲pGBKT7-UL55, 兩者在體外存在直接的相互結(jié)合能力。

圖3 GST-ENO 1與HCMV UL55相互作用Fig.3 GST-ENO 1 interaction with HCMV UL55A：所用一抗為抗GST；B：所用一抗為抗c-Myc；1：pGBKT7 UL55；2：GST pulldown回收蛋白，3：GST-ENO 1A：GST-ENO l detected with a mouse anti-GST monoclonal antibody; B: GST-ENO l detected with a mouse anti-c-Myc monoclonal antibody; 1: the UL55 protein alone;2: GST-ENO l and pGBKT7 UL55 captured by MagneGSTTM particles;3: GST-ENO l expressed in transformed BL21

3 討 論

HCMV重要的包膜糖蛋白——gB蛋白, 由HCMV UL55編碼，屬于I型膜蛋白。病毒的復(fù)制周期可分為即刻早期、早期和晚期三個(gè)階段。gB蛋白屬晚期蛋白[6]。成熟gB由907個(gè)氨基酸的蛋白前體經(jīng)糖基化加上N-及O-連接糖鏈后，最后在461 aa裂解為以二硫鍵相連的gp55和gpll6而形成，組成病毒包膜成分或被運(yùn)送至感染細(xì)胞表面[4]。近年的研究認(rèn)為HCMV主要包膜糖蛋白gB在病毒的感染和誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，并參與病毒穿入宿主細(xì)胞以及細(xì)胞間傳播和感染細(xì)胞間融合過程，也是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要靶位[7]。

近年來有國(guó)外學(xué)者分別對(duì)UL50、UL77和UL93編碼蛋白的結(jié)合蛋白進(jìn)行了報(bào)道[8-10]，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)UL/b′區(qū)的UL135、UL136、UL141和UL142進(jìn)行了研究[11-14]，但尚無(wú)HCMV UL55編碼蛋白相關(guān)結(jié)合蛋白的研究報(bào)道。本研究采用酵母雙雜交技術(shù)對(duì)人胎腦cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，最終篩選到10種與gB蛋白相互結(jié)合的蛋白。但這些結(jié)合蛋白中只有編碼烯醇化酶1(enolase1, ENO 1) 的基因序列是其完整的開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF) ， 更能證實(shí)篩選出的蛋白通過與UL55編碼蛋白相互作用而影響HCMV的致病性。因此選取了ENO 1，應(yīng)用 GST pull-down 技術(shù)體外實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步驗(yàn)證GST-ENO 1與HCMV UL55的相互結(jié)合。通過Western blot檢測(cè)，首先應(yīng)用抗GST抗體，顯示UL55編碼蛋白與ENO 1 pulldown回收蛋白具有直接相互作用；然后又應(yīng)用抗MYC抗體，再次驗(yàn)證了UL55編碼蛋白與ENO 1 pulldown回收蛋白間的直接相互作用，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)UL55編碼蛋白與ENO 1的相互作用。

烯醇化酶是糖酵解過程中的重要酶類之一，能催化2-磷酸甘油酸(2-PGE)與磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)之間的相互轉(zhuǎn)化[15]。在脊椎動(dòng)物中ENO分為ENO 1 (α-ENO)、ENO 2 (γ-EN0)和ENO 3 (β-ENO)三種亞型，各亞型間存在高度的序列相似性和近似的酶動(dòng)力學(xué)特性。有研究證實(shí)，ENO 1可催化PGA與PEP之間的轉(zhuǎn)化，并可通過糖酵解途徑參與心臟功能的調(diào)節(jié)。近年來研究表明，ENO 1在纖溶酶原激活和纖溶酶活性、細(xì)胞凋亡、肌生成和肌肉再生和腫瘤發(fā)生發(fā)展等許多生物學(xué)過程中發(fā)揮調(diào)控作用[16]。ENO 1作為纖溶酶原受體，通過介導(dǎo)纖溶酶活性調(diào)控細(xì)胞浸潤(rùn)、參與傷口愈合，以及組織重朔、胚胎發(fā)育和體內(nèi)細(xì)胞遷移等過程[17]。

本研究通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出人胎腦cDNA文庫(kù)中與UL55蛋白結(jié)合的宿主蛋白，同時(shí)應(yīng)用 GST pull-down 技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)了ENO 1與HCMV UL55蛋白的相互作用。推測(cè)在HCMV侵入人體后，gB蛋白與ENO 1結(jié)合可能激活細(xì)胞纖溶系統(tǒng)以改變細(xì)胞活性和通透性，參與穿入細(xì)胞和細(xì)胞間的播散的過程；gB蛋白也可能通過與ENO 1結(jié)合提高病毒的穿透力及加強(qiáng)感染細(xì)胞間的傳播，gB蛋白是參與病毒感染的關(guān)鍵蛋白。同時(shí)gB蛋白在HCMV感染過程中起到的作用也可能是與多種類基因共同參與作用的結(jié)果，這些基因共同作用的機(jī)制也是我們要深入進(jìn)行的功能性研究。

[1] Halwachs-Baumann G.Recent developments in human cytomegalovirus diagnosis[J].Expert Rev Expert Anti Infect Ther, 2007, 5(3): 427-439.

[2] Kosugi I. Cytomegalovirus (CMV) [J]. Uirusu, 2010, 60(2): 209-220.

[3] 陳娟娟, 陳素華, 馮燕，等. 胎盤接種小鼠巨細(xì)胞病毒對(duì)仔鼠物體識(shí)別能力的影響[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2007，15(2)：30-31.

[4] 李敏環(huán)，范駿. 人巨細(xì)胞病毒gB糖蛋白研究進(jìn)展[J]. 國(guó)際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志，2011，38(1)：59-62.

[5] Britt WJ, Mach M. Human cytomegalovirus glycoproteins[J]. Intervirology， 1996, 39(5-6): 401-412.

[6] Fan J, Ma WH, Yang MF, et al. Real-time fluorescent quantitative PCR assay for measuring cytomegalovirus DNA load in patients after haematopoietic stem cell transplantation[J]. Chin Med J， 2006, 119(10): 871-874.

[7] Isaacson MK,Compton T.Human cytomegalovirus glycoprotein B is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment, assembly, or egress[J]. J Virol， 2009, 83(8): 3891-3903.

[8] Sonntag E, Hamilton ST, Bahsi H, et al. Cytomegalovirus pUL50 is the multi-interacting determinant of the core nuclear egress complex (NEC) that recruits cellular accessory NEC components[J]. J Gen Virol， 2016，Epub ahead of print.

[10]Borst EM, Bauerfeind R, Binz A, et al. The Essential Human Cytomegalovirus Proteins pUL77 and pUL93 are Structural Components Necessary for Viral Genome Encapsidation[J]. J Virol， 2016, Epub ahead of print.

[11]鄒飛，任高偉，周曉薇，等. 人巨細(xì)胞病毒UL135 蛋白結(jié)合蛋白的酵母雙雜交篩選[J]. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，38(9)：647-650.

[12]Xin Cui, Zheng-Rong Sun, Gao-Wei Ren, et al. Interaction between human cytomegalovirus UL136 protein and ATP1B1 protein[J]. Braz J Med Biol Res, 2011, 44(12): 1251-1255.

[13]盧志濤，王桂麗，馬艷萍，等. 人巨細(xì)胞病毒UL141編碼蛋白相互作用蛋白的篩選和分析[J]. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，42(10)：865-868.

[14]CHANG LIU, YING QI, YANPING MA, et al. Interaction between the human cytomegalovirus encoded UL142 and cellular Snapin proteins[J]. Mol Med Report, 2015, 11: 1069-1072.

[15]高玒，余傳信. 烯醇化酶與寄生蟲感染[J]. 中國(guó)血吸蟲病防治雜志,2014，26(4):445-447.

[16]姜冬梅，康波，馬容，等. 烯醇化酶1的生物學(xué)功能[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2014，26(1)：69-73.

[17]Castellino FJ,Ploplis VA.Structure and function of the plasminogen/ plasmin system[J]. Thromb Haemost, 2005, 93(4):647-654.

Screening and Identification of Proteins Interacted with UL55 Protein

JI Yao-hua, LIU Chang, QI Ying, MA Yan-ping, HUANG Yu-jing, LIU Zhong-yang, RUAN Qiang

(VirusLaboratory，ShengjingHospital，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110004)

The objective of this study was to screen the binding proteins of human cytomegalovirus (HCMV) UL55 protein (pUL55) from an human fetus brain cDNA library and identify the binding ability between protein ENO 1 and HCMV pUL55 in vitro. Coding region of HCMV UL55 gene was cloned into the pGBKT7 vector. GAL4 yeast two-hybrid was used to screen the binding proteins of pUL55 from the human fetal brain cDNA library. After confirming the UL55 coding sequence have no the self-activaty, Yeast two hybrid rotary experiment was used to validate the reliability of interactions. Binding proteins were searched by the Blast network service at the National Center for Biotechnology Information using the sequences of the selected clones. The putative binding protein of pUL55, ENO 1, expressed by recombinant pGEX-4T-2 vector was further identified by GST pull-down technology.Ten proteins were identified to bind pUL55 from the human fetal brain cDNA library by yeast two-hybrid assay. The direct interaction between ENO 1 and pUL55 protein in vitro was confirmed by GST pull-down technology. At least 10 host proteins showed binding abilities to pUL55. Among them, the direct interaction between ENO 1 and pUL55 was demonstrated by GST pull-down experiments. The results provide new clues for further study on biological functions of UL55 protein.

Human cytomegalovirus；UL55-encoded protein；human fetal brain cDNA library；ENO 1；Interaction

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(201202283)

吉耀華 男，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師。主要研究方向?yàn)獒t(yī)學(xué)病毒學(xué)。E-mail: jiyh@sj-hospital.org

* 通訊作者。男，教授，博士生導(dǎo)師。主要研究方向?yàn)獒t(yī)學(xué)病毒學(xué)。E-mail: ruanq@sj-hospital.org

2016-05-31；

2016-07-15

Q78

A

1005-7021(2016)05-0068-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.05.012