抗菌肽對(duì)糜爛型OLP患者唾液中真菌的影響

郭 巖， 張 英

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 急診粘膜科，遼寧 沈陽(yáng) 110001 )

抗菌肽對(duì)糜爛型OLP患者唾液中真菌的影響

郭 巖， 張 英*

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 急診粘膜科，遼寧 沈陽(yáng) 110001 )

抗菌肽經(jīng)臨床研究，發(fā)現(xiàn)具有抗生素不具備的優(yōu)點(diǎn)，可對(duì)糜爛型口腔扁平苔蘚(oral lichen planus，OLP)患者唾液中真菌有抑制和殺菌的作用，彌補(bǔ)了抗生素的缺點(diǎn)。通過(guò)使用不同濃度、不同種類的抗菌肽,作用于自糜爛型OLP患者口腔唾液標(biāo)本中提取并經(jīng)鑒定的菌種，對(duì)三種常見(jiàn)菌——白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。結(jié)果表明，抗菌肽使用前后的數(shù)值比對(duì)、菌落生長(zhǎng)情況、最小抑菌值有明顯變化。發(fā)現(xiàn)RISE-AP12對(duì)三種常見(jiàn)真菌的抑菌、殺菌效果優(yōu)于其他的抗菌肽，在臨床上有較大應(yīng)用前景。

口腔糜爛型扁平苔蘚；念珠菌；抗菌肽

口腔扁平苔蘚(oral lichen planus，OLP)是慢性淺表性炎癥的黏膜角化異常性疾病，是口腔黏膜病中最常見(jiàn)的疾病之一。其特點(diǎn)是周期性復(fù)發(fā)，有自限性，并伴有劇烈疼痛，任何年齡人群均可患病。患者會(huì)出現(xiàn)黏膜充血、糜爛、潰瘍、萎縮、水泡等，局部伴有敏感、灼痛，癌前病變。該病病因目前尚不明確，除心理和免疫因素外，感染因素越來(lái)越受重視，主要針對(duì)細(xì)菌、病毒、真菌關(guān)注的較多[1-2]。張英等[3]、徐巖英等[4]通過(guò)多因素分析的結(jié)果表明，念珠菌感染是誘導(dǎo)OLP的危險(xiǎn)因素之一。口腔扁平苔蘚傳統(tǒng)的臨床治療多采用抗菌類、止痛類、免疫調(diào)節(jié)類等藥物進(jìn)行治療，各種藥物配伍復(fù)雜，長(zhǎng)期使用副作用大，且收效甚微[5]?？咕膽?yīng)用于口腔領(lǐng)域越來(lái)越受到重視?？咕氖巧矬w內(nèi)廣泛存在的一類多肽，是用來(lái)抵抗外來(lái)微生物的入侵和體內(nèi)一些突變細(xì)胞而產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物[6-7]，存在于上皮和免疫組織中，具有抗菌、抑菌、抗病毒、抗腫瘤的功能。人類抗菌肽構(gòu)成了機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)的第一道防線。 RISE-AP12是美國(guó)銳瑟公司人工合成的新型抗菌肽，Daptomycin由美國(guó)Cubist pharmaceuticals公司生產(chǎn)，主要治療革蘭陽(yáng)性菌引起的疾病。P113/P113D由美國(guó)Demegen/pacgen公司研制，主要治療口腔真菌感染[8-9]。但是關(guān)于抗菌肽治療口腔糜爛型扁平苔蘚的研究目前少見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)提取糜爛型OLP患者唾液中常見(jiàn)菌種，經(jīng)體外鑒定，用不同種類、不同濃度的抗菌肽對(duì)其作用，觀察其抑菌和殺菌結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 患者來(lái)源 選取2015年9月至2016年6月于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院黏膜病科就診患者40例，所有OLP患者由2名醫(yī)生臨床診斷，并由組織病理學(xué)確診。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病例均符合OLP診斷標(biāo)準(zhǔn)；②糜爛面發(fā)生時(shí)間7 d，患者需具備清晰判斷及表達(dá)疼痛程度能力，自愿參加臨床實(shí)驗(yàn)，并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患口腔白斑、多形性紅斑者；②患全身系統(tǒng)性疾病、貧血、消化性潰瘍、急性感染性疾病、自身免疫性疾病者；③24 h內(nèi)使用鎮(zhèn)痛藥、1個(gè)月內(nèi)使用抗生素消炎藥、3個(gè)月內(nèi)吸煙、嗜酒者；④腫瘤患者；⑤不能按時(shí)復(fù)診者；⑥妊娠期者。

1.1.2 主要試劑與材料 改良沙氏瓊脂培養(yǎng)基(青島海博公司)；氯霉素(青島海博公司)；念珠菌顯色培養(yǎng)基(法國(guó)科瑪嘉 CHROMagar)；瓊脂糖 (美國(guó)Promaga公司)；胎牛血清 (賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)；HBIS培養(yǎng)基(取48 g BHI培養(yǎng)基加入1 000 mL雙蒸水，磁力攪拌器常溫?cái)嚢?0 min，高壓10 min后置于45 ℃恒溫水浴，待溫度均衡后，加入過(guò)濾除菌的氯霉素，使其終濃度為5 μg/mL)?？咕腞ISE-AP12(美國(guó)銳瑟公司)，Daptomycin(美國(guó)Cubist pharmaceuticals公司)，P113/P113D(美國(guó)Demegen/Pacgen公司)。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 Nikon正置熒光顯微鏡(日本，80i型)；ATB鑒定試條ID32C(法國(guó)梅里埃公司)；制冰機(jī)(德國(guó)Zigera，2BE-70-25型)；超純水機(jī)(臺(tái)灣艾柯，KL-RO-20型)；高速低溫臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)Sigma，90-2型)；紫外分光光度計(jì)(英國(guó)UV-visible Spectrometer，UV300型)；恒溫孵箱(上海博泰，XMTD-8000型)；超低溫冰箱(青島Haier，DW-40L262型)。

1.2 方法

1.2.1 唾液留存及真菌提取 ①樣本采集：上午10點(diǎn)左右，采集受試者唾液0.5～1 mL送檢； ②樣本稀釋：將樣本稀釋成10-1～10-6濃度備用；③樣本的接種和培養(yǎng)：取稀釋濃度為10-2～10-6的樣本液各0.1 mL，分別接種于普通血瓊脂和HBIS血瓊脂培養(yǎng)基，用玻棒將樣本液均勻涂布后置需氧或厭氧環(huán)境(800 mL/L N2、100 mL/L CO2、100 mL/L H2)，培養(yǎng)24 h或48 h。

1.2.2 唾液菌群菌種鑒定 ①用ATB(automatic testing bacteriology)細(xì)菌自動(dòng)鑒定及藥敏分析儀鑒定(簡(jiǎn)稱ATB法)；②真菌學(xué)檢查的種類：唾液中檢查白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌等；③可疑病原細(xì)菌有葡萄球菌、消化鏈球菌、不產(chǎn)黑色素普氏菌(包括口腔普氏菌、口普氏菌等)，產(chǎn)黑色素厭氧桿菌(包括牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌等)、羧桿菌(包括具核羧桿菌、牙周羧桿菌等)[10]。

1.2.3 受試液的配制及最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 將質(zhì)量濃度為2 mg/mL的3種抗菌肽RISE-AP12、Daptomycin、P113/P113D稀釋至1 mg/mL，直至最低質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。采用平板涂布法，取制備好的菌懸液100 μL，分別加入培養(yǎng)基中，用無(wú)菌涂布棒涂抹均勻；分別取不同濃度的受試液300 μL置于菌懸液的培養(yǎng)基中，用無(wú)菌涂布棒涂抹均勻，重復(fù)試驗(yàn)3次，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，觀查培養(yǎng)皿中真菌生長(zhǎng)情況，記錄菌落。完全沒(méi)有真菌生長(zhǎng)的濃度為最低抑菌濃度MIC(mg/mL)。

1.2.4 菌落形成單位計(jì)數(shù)(colony forming units，cfu)計(jì)數(shù) ①制備培養(yǎng)基：配制沙氏瓊脂培養(yǎng)基,121 ℃、滅菌20 min，置于45 ℃恒溫水浴鍋中，加入過(guò)濾除菌的氯霉素使終濃度為5 μg/mL后備用。②編號(hào)：取3支盛有4.5 mL無(wú)菌水的試管，編號(hào)為10-1、10-2、10-3。③稀釋菌液：稀釋樣品前先將待測(cè)樣品充分搖勻，精確吸取0.5 mL菌液至10-1試管中，如此稀釋至10-3。④取樣：精確吸取10-1、10-2、10-3稀釋液各100 μL，加至相應(yīng)編號(hào)的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，重復(fù)3次。⑤倒培養(yǎng)基：菌液移入培養(yǎng)皿后立即倒入融化并冷卻至45 ℃左右的沙氏瓊脂培養(yǎng)基(倒入量約10～12 mL)，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿使菌液和培養(yǎng)基充分混勻后平置，待凝。搖勻平板菌液。3種濃度的菌液分別放入血瓊脂和HBIS血瓊脂培養(yǎng)。⑥倒置培養(yǎng)：待平板完全凝固后，倒置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。⑦菌落計(jì)數(shù)：培養(yǎng)48 h后取出平板，統(tǒng)計(jì)平皿中的菌落數(shù)并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 糜爛型OLP患者唾液中真菌檢出情況

糜爛型OLP患者40例，檢出白色念珠菌25例，占總?cè)藬?shù)的62.5%；光滑念珠菌檢出9例，占22.5%；熱帶念珠菌檢出6例，占15%(見(jiàn)表1)。

表1 糜爛型OLP患者唾液中不同類型真菌檢出情況Table 1 Erosion type different types of fungus detection in patients with OLP

2.2 抗菌肽的抑菌和殺菌效果

使用質(zhì)量濃度2 mg/mL RISE AP-12、Daptomycin、P113/P113D抗菌肽前后,真菌菌落數(shù)的對(duì)比(X±S)情況見(jiàn)表2。

表2 3種相同質(zhì)量濃度的抗菌肽使用前后真菌菌落數(shù)的對(duì)比(X±S)Table 2 Use antibacterial peptide concentration 2 mg/mL RISE-AP12，Daptomycin， P113/P113D fungal colony countbefore and after contrast(X±S)

結(jié)果顯示，2 mg/mL的RISE-AP12對(duì)白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌3種真菌的抑菌作用強(qiáng)于2 mg/mL的Daptomycin 和P113/P113D。在白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌3種真菌平板上，使用不同濃度RISE-AP12、Daptomycin、P113/P113D抗菌肽，真菌的菌落生長(zhǎng)情況見(jiàn)表3。

表3 真菌菌落總數(shù)Table 3 The selected bacteria colony total record results

由表3可知，RISE-AP12對(duì)白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌最低抑菌濃度為1 mg/mL；Daptomycin對(duì)白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌最低抑菌濃度為2 mg/mL，P113/P113D則更高。0.9%生理鹽水有大量菌落生長(zhǎng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)法參照，由此看出RISE-AP12的MIC值低于Daptomycin和P113/P1I13D。

抗菌肽具有廣譜的殺菌特性，對(duì)革蘭陰性菌和革蘭陽(yáng)性菌均有抑制作用[8-9]。 2 mg/mL抗菌肽RISE-AP12對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及細(xì)菌培養(yǎng)前對(duì)照A600nm分別為0.310 3±0.004 2、0.065 53±0.000 8及0.061 7±0.000 22。加入最終質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL、0.5 mg/mL抗菌肽RISE-AP12的A600 nm(0.048 2±0.001 5、0.051 1±0.001 8)分別與陰性對(duì)照組及真菌培養(yǎng)前對(duì)照比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余兩種抗菌肽有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

本研究通過(guò)使用不同濃度、不同種類的抗菌肽，作用于自糜爛型OLP患者口腔唾液標(biāo)本中提取的經(jīng)鑒定的菌種，對(duì)3種常見(jiàn)菌——白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)抗菌肽2 mg/mL RISE-AP12使用前后白色念珠菌的數(shù)值由8 496.95±107.291變?yōu)? 008.95±89.112；光滑念珠菌由8 486.60±106.243變?yōu)? 318.70±99.981;熱帶念珠菌由8 521.30±116.011變?yōu)? 339.35±103.269，其余兩種2 mg/mL Daptomycin和P113/P113D抗菌肽對(duì)以上3種真菌影響小于2 mg/mL RISE-AP12。從菌落生長(zhǎng)情況看，RISE-AP12對(duì)白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌最低抑菌濃度為1 mg/mL，而其余2種抗菌肽對(duì)這三種真菌的最低抑菌濃度則高于RISE-AP12。RISE-AP12對(duì)3種真菌的抑菌殺菌效果優(yōu)于其他2種抗菌肽，在臨床上有較大的應(yīng)用前景。

目前，抗菌肽在口腔中的應(yīng)用研究處于全面起步探索階段，抗菌肽對(duì)OLP病菌的高效殺菌、抑菌作用為口腔真菌的藥物治療提供了新的理論依據(jù)[11]。因此，抗菌肽在治療糜爛型扁平苔蘚感染性疾病中表現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景[12-13]。另外，抗菌肽是生物體先天性免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，同時(shí)也可能是皮膚及糜爛黏膜再生的潛在性物質(zhì)，在治療糜爛型扁平苔蘚方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[14]。

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Antibacterial Peptide Effect on Fungi for Erosion Type OLP Patients Saliva

GUO Yan, ZHANG Ying

(EmergencyDept.ofStomatol.Mucosa,Affil.Hosp.ofStomatol.,ChinaMed.Uni.Shenyang110001)

It was found through clinical studies that antibacterial peptide has the advantages that antibiotics do not have, and could inhibit and kill fungi in saliva of erosion type OLP (oral lichen planus) patients, and makes up the shortcoming of antibiotics. Inhibition experiment using different concentrations, different kinds of antibacterial peptide, action on strains isolated and identified from oral auto-erosion type OLP patients saliva samples against three common fungi,Candidaalbicans, smooth candida, tropical candida were carried out. The results showed that the numerical comparison, the colony growth, the minimum bacteriostatic values before and after using antibacterial peptides have changed significantly. It was found that the inhibition and killing effects of RISE-AP12 against three common fungi excelled or outwent other antibacterial peptides, and has fairly wide prospect in clinical application.

oral erosion type flat moss;Candida; antimicrobial peptides

郭巖 女，副主任醫(yī)師，碩士研究生。主要從事口腔內(nèi)科工作。Tel：024-22892645，E-mail:69055888@qq.com

* 通訊作者。女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。主要從事口腔內(nèi)科研究。Tel: 024-22891863，E-mail:zy_64_04_24@sina.com

2016-04-02；

2016-05-16

Q939.92;R978

A

1005-7021(2016)05-0074-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.05.013