高三尖杉酯堿對K562細(xì)胞的影響

摘要：目的 探討不同濃度及時間作用下高三尖杉酯堿對K562細(xì)胞的增殖和凋亡的影響。方法 使用MTT法在不同時間點檢測不同濃度的高三尖杉酯堿對K562細(xì)胞增殖的影響。使用流式細(xì)胞術(shù)在不同時間點檢測不同濃度的高三尖杉酯堿對K562細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 各組濃度的高三尖杉酯堿對K562細(xì)胞增殖均有抑制作用，其差異與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），HHT 24 h的IC50濃度為0.48 ug/mL，48 h的IC50濃度為0.07 ug/mL，兩組作用時間的IC50濃度有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。各組濃度的高三尖杉酯堿均可誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，其差異與對應(yīng)的對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 ①高三尖杉酯堿對K562細(xì)胞的增殖有抑制作用，呈時間及濃度依賴性；②高三尖杉酯堿亦可誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，但與濃度和作用時間不呈正相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：高三尖杉酯堿；K562細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

高三尖杉酯堿（homoharringtonine，HHT）是一種從我國特有的植物海南粗榧（三尖杉屬）中提取分離出的生物堿，它是一種細(xì)胞周期非特異性的抗腫瘤藥。我國學(xué)者已證明HHT對白血病有顯著的療效[1-2]。為明確HHT在白血病細(xì)胞增殖及凋亡方面的作用，本實驗以K562細(xì)胞為實驗對象，探討高三尖杉酯堿對K562細(xì)胞株的增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑 高三尖杉酯堿（杭州民生藥業(yè)），胎牛血清（美國GIBICO公司），RPMI1640培養(yǎng)基（北京索萊寶生物公司），DMSO（美國Amresco公司），MTT（北京全式金公司），Annexin V/7-AAD細(xì)胞凋亡試劑盒（美國BD公司）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) K562細(xì)胞為慢性髓系白血病急變株，于液氮中凍存。將K562細(xì)胞株復(fù)蘇后，在培養(yǎng)瓶中加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，置于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)孵育（37℃，5%CO2），根據(jù)生長狀態(tài)定期換液，將細(xì)胞培養(yǎng)至進(jìn)入對數(shù)生長期。

1.3 MTT細(xì)胞增殖實驗 將對數(shù)生長期的K562細(xì)胞用培養(yǎng)液將細(xì)胞配成濃度為1×104/ml的細(xì)胞懸液并鋪種于96孔板內(nèi)，每孔鋪種細(xì)胞懸液體積為100 μl；在各實驗組加入不同濃度（50 ug/ml，5 ug/ml，0.5 ug/ml，0.05 ug/ml，0.005 ug/ml，0.0005 μg/ml）的高三尖杉酯堿，陰性組為細(xì)胞懸液，空白對照組加入相同體積的培養(yǎng)基，四周預(yù)留空白孔以PBS填充。鋪板后將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h或48 h。根據(jù)各實驗組吸光度依照如下公式計算細(xì)胞增殖抑制率，并分別計算24 h和48 h的IC50濃度。

細(xì)胞增殖抑制率=[1-（藥物組-空白組）/（陰性對照組-空白組）]×100%。

1.4 Annexin V-PE/7-AAD雙染法流式細(xì)胞術(shù) 實驗分組如上所述。選取生長對數(shù)期的細(xì)胞，配制成1×106/ml的細(xì)胞懸液，6孔板每孔加入2 ml的細(xì)胞懸液。各藥物實驗組每孔加入對應(yīng)濃度梯度的藥物，對照組加入培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h，12 h及24 h。Annexin V-PE/7-AAD雙染法檢測HHT作用K562細(xì)胞凋亡率。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用統(tǒng)計軟件SPSS19.0分析所有數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。組間比較采用獨立樣本t檢驗來分析。

2 結(jié)果

2.1高三尖杉酯堿對K562細(xì)胞增殖的影響 MTT實驗結(jié)果顯示各組濃度的高三尖杉酯堿對K562均有抑制作用，呈濃度依賴性，不同濃度組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。HHT作用于K562細(xì)胞24 h的IC50為0.48 ug/mL作用48 h的IC50為0.07 ug/mL，兩組作用時間的IC50濃度有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。除50 ug/mL與5 ug/mL及（P>0.05）比較無統(tǒng)計學(xué)差異外，其余組間藥物兩兩比較，均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。HHT為0.005 μg/ml時，對K562細(xì)胞即可產(chǎn)生明顯的抑制作用，但當(dāng)濃度達(dá)0.5 ug/mL及以上時，增殖抑制率無顯著變化（P>0.05）。

2.2 Annexin V-PE/7-AAD雙染法檢測高三尖杉酯堿對K562細(xì)胞凋亡的影響

HHT可誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，且隨藥物濃度增加凋亡率增加并不顯著，早期+晚期凋亡最高可達(dá)8.32%。HHT作用K562細(xì)胞6 h后，各藥物濃度組與陰性對照組（見圖1）比較，凋亡率均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05，見圖2）。HHT各濃度組間比較，凋亡均無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05，見圖3）。

3 討論

近年來，關(guān)于HHT聯(lián)合細(xì)胞毒性藥物治療惡性腫瘤，并且表現(xiàn)出增強細(xì)胞毒性作用甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥的報道逐漸增多，HHT也成為腫瘤治療研究的熱點。

本研究結(jié)果提示高三尖杉酯堿對K562細(xì)胞的增殖有抑制作用，呈時間和濃度依賴性，同時HHT可誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，但與濃度和作用時間不成正相關(guān)性。

HHT在血液腫瘤方面應(yīng)用廣泛，但有心臟毒性、骨髓抑制以及胃腸道反應(yīng)等毒副作用。骨髓抑制主要表現(xiàn)為可逆性的血小板和中性粒細(xì)胞計數(shù)減少。其副作用的發(fā)生率與藥物劑量有關(guān)，同等輸注時間下，低劑量組患者不良反應(yīng)發(fā)生率低于高劑量組。本次實驗提示HHT可通過抑制細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗白血病效應(yīng)，而且HHT的IC50濃度與HHT對K562細(xì)胞作用時間呈負(fù)相關(guān)。上述結(jié)果可為臨床上使用HHT提供指導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)：

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編輯/肖慧