順鉑對秀麗隱桿線蟲的急性毒性研究

摘要：目的 通過急性毒性實驗確定順鉑對秀麗隱桿線蟲24h的半數(shù)致死濃度（median lethal concentration，LC50），然后根據(jù)LC50確定亞致死暴露濃度，為進(jìn)一步的亞急性毒性實驗提供參考依據(jù)。方法 用K-medium溶液配制不同濃度的順鉑樣品溶液，K-medium溶液作對照液，同步化后的秀麗隱桿線蟲分別暴露于樣品液和對照液，觀察24h后秀麗隱桿線蟲的死亡與存活情況，同時觀察24h線蟲的生長發(fā)育、繁殖和運動情況，用Probit方法計算秀麗隱桿線蟲的24h LC50。結(jié)果 順鉑對秀麗隱桿線蟲24h LC50為617 mg·L-1，95% 置信區(qū)間為580～647 mg·L-1；在實驗過程可發(fā)現(xiàn)線蟲的生長發(fā)育、繁殖和運動能力都受到抑制，隨著順鉑濃度的升高，抑制越明顯。結(jié)論 順鉑對秀麗隱桿線蟲具有一定的毒性，特別是對線蟲的生長發(fā)育、運動和繁殖能力都有不同程度的影響。關(guān)鍵詞：順鉑；秀麗隱桿線蟲；LC50

Abstract：Objective To determine the median lethal concentration（LC50）of cisplatin to Caenorhabditis elegans in the acute toxicity test of 24h，Then according to LC50 to determine the sublethal exposure concentration， which provides reference for further subacute toxicity experiments. Methods K-medium solution was used to prepare a series of concentrations of cisplatin as the experimental groups， K-medium solution as the control solution. Synchronized Caenorhabditis elegans exposure in experimental and control solutions 24h，then observe the mortality， growth， development，reproduction and movement of C. elegans. LC50 were derived through Probits analysis. Results The LC50 was 617mg.L-1， and its 95% confidence interval was 580～647 mg.L-1， the growth and development， reproduction and movement ability of the nematodes were inhibited in the experimental process. Increasing the concentration of cisplatin， the restrain more obvious. Conclusion Cisplatin has a certain degree of toxicity to the nematodes， especially，the effects on the growth and development， movement and reproduction ability of the nematode is different.

Key words：Cisplatin；Caenorhabditis elegans；LC50

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，C.elegans）因其蟲體?。ǔ上x長1mm）、身體透明、世代和生命周期短（20℃，3.5d）、后代繁殖量大（一只雌雄同體的線蟲可產(chǎn)下300多個后代，與雄性交配可產(chǎn)下1000多個后代）和易于實驗室培養(yǎng)等諸多優(yōu)點，自20世紀(jì)60、70年代開始成為模式生物，前期主要用于神經(jīng)生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)研究，現(xiàn)逐步用于基因組學(xué)、藥物篩選、環(huán)境毒理學(xué)等眾多研究領(lǐng)域[1-3]。隨著COPAS系統(tǒng)的出現(xiàn)和微流控技術(shù)的快速發(fā)展，目前已建立了基于C.elegans的高通量篩選模型[4，5]，如抗感染藥物模型[6-9]、抗衰老模型[10-12]和小分子化合物篩選模型[12，13]等?；谄渑c人類基因的同源性高達(dá)60%～80%，近期用于許多人類疾病模型，例如：阿爾茨海默病、帕金森病、糖尿病、脂肪代謝、杜氏肌營養(yǎng)不良和腫瘤等[6]。順鉑（cisplatin）為細(xì)胞周期非特異性的化療藥物，主要作用于癌細(xì)胞DNA的嘌呤和嘧啶堿基，從而抑制癌細(xì)胞的DNA復(fù)制，廣泛用于生殖系統(tǒng)腫瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌等腫瘤的治療，在臨床應(yīng)用中以惡心、嘔吐、腎毒性、耳毒性及周圍神經(jīng)損傷等不良反應(yīng)最為常見。在腫瘤治療過程中，抗腫瘤藥物的配置環(huán)境對醫(yī)務(wù)人員的潛在毒性損害的相關(guān)報道少見，本文利用秀麗隱桿線蟲作為模型探討此問題。

1材料與方法

1.1藥物試劑和儀器 順鉑（江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司）、AIRTECH SW-CJ-1FD超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、XTL-3400E連續(xù)變倍體視顯微鏡（上海思長約光學(xué)儀器有限公司）、SPX-70B型生化培養(yǎng)箱（上海邦西儀器科技有限公司）、DRP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實驗儀器有限公司）、Avanti J-26 XP型高效離心機(jī)（美國Beckman coulter）。酵母粉、胰蛋白胨均購自英國OXIDE公司，瓊脂（Agar）購自美國Biosharp公司，其他化學(xué)藥品及試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2溶液的配置 NGM培養(yǎng)基：每升NGM培養(yǎng)基中含3g NaCl，17g瓊脂，2.5g蛋白胨，975ml雙蒸水，高溫高壓滅菌后冷卻至55℃，再依次加入無菌的25ml 1M 磷酸鉀緩沖液（PH=6.0），1ml 1M MgSO4，1ml 1M CaCl2，1ml 5mg·ml-1膽固醇乙醇溶液（用無水乙醇）。

LB培養(yǎng)基：每升溶液中含10g胰蛋白胨，5g NaCl，5g酵母粉，混勻后用1M NaOH調(diào)至PH=7.0。

M9緩沖液：每升溶液中含15.12g Na2HPO4·12H2O，3g KH2PO4，5g NaCl，0.12g 無水MgSO4。

K-medium溶液：每升溶液中含2.36g KCl，3g NaCl。

1.3 秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng) N2野生型秀麗隱桿線蟲（C.elegans， the Bristol strain N2）、埃希氏大腸桿菌OP50（E.coli OP50）均由中國科學(xué)院昆明動物研究所梁斌老師惠贈。N2型線蟲飼養(yǎng)于涂有E.coli OP50的標(biāo)準(zhǔn)線蟲生長培養(yǎng)基（Nematode Growth Medium，NGM）于20℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。E.coli OP50采用 LB培養(yǎng)基于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4線蟲的同步化 將處于產(chǎn)卵階段的線蟲進(jìn)行同期化處理[14]，將懷卵的成蟲用M9緩沖液沖洗至無菌的15ml的離心管中，加M9緩沖液至3.5ml，隨后加入1ml 5% NaCl和0.5ml 5mol·L-1 NaOH（NaOH：NaClO：線蟲懸液的體積比為1：2：7），漩渦振蕩約10min至蟲體大部分溶解，然后1300g離心1min，棄掉上層清液，再用M9緩沖液清洗2次，收集同步化后的蟲卵并置于涂有E.coli OP50的NGM培養(yǎng)基上，20±1℃培養(yǎng)52～54h，獲得同步化的L4期幼蟲 （ 不孕階段），用于藥物急性毒性實驗。本實驗全部采用處于L4期幼蟲。

1.5急性毒性實驗 依照Roh JY [15]等的實驗方法：用K-medium溶液配制不同濃度的順鉑（900、810、720、630和540 mg·L-1 5個濃度組），每個濃度組所配溶液均大于2ml，并設(shè)K-medium溶液為對照組。每個濃度組設(shè)3個復(fù)孔，24孔板中每孔加入500ul不同濃度的順鉑，再挑入10±1條L4期同步化處理過的線蟲。20℃暴露24h后，在體視顯微鏡下觀察并記錄存活和死亡的秀麗隱桿線蟲的數(shù)目，計算秀麗隱桿線蟲的率。秀麗隱桿線蟲死亡判定方法為用鉑絲針觸碰秀麗隱桿線蟲無反應(yīng)即視為死亡。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 實驗重復(fù)4次，LC50通過SPSS16.0軟件， Probit方法進(jìn)行分析。

2結(jié)果

2.1線蟲的急性毒性實驗的外觀變化 在線蟲給藥24h后觀察，死亡的線蟲身體透亮，身體僵硬變直，并且身體較用藥前長度變短，體型稍浮腫，存活的線蟲隨著藥物濃度的升高，其運動能力明顯下降，身體蜷縮，做非正弦運動或Ω形運動，身體擺動的幅度和頻率明顯下降，長勢明顯比對照組弱，線蟲身體細(xì)短，用藥組線蟲幾乎無蟲卵及后代產(chǎn)生，對照組有少量的蟲卵及L1期幼蟲出現(xiàn)。

2.2順鉑對秀麗隱桿線蟲24h LC50的計算 不同劑量順鉑對秀麗隱桿線蟲24h 的死亡率見表1。

3討論

秀麗隱桿線蟲作為毒性評價的模式生物已得到重視，其LC50是常用的評價指標(biāo)，目前已經(jīng)成功的運用于重金屬、藥物和有機(jī)物的急性毒性效應(yīng)。毒性試驗中常用的參考指標(biāo)還有：半數(shù)致死濃度、體長、后代數(shù)目、后代的產(chǎn)卵量、行為、運動能力等。曾迎新[16]等通過液體浸泡法評價各種金屬元素的毒性效應(yīng)，并且證實線蟲LC50與大小鼠的LD50具有一定內(nèi)在關(guān)聯(lián)性，同理，可利用液體浸泡法驗證藥物對線蟲的LC50與對大小鼠的LD50是否也存在一定的關(guān)聯(lián)。

本文通過溶液浸泡的方法觀察了順鉑對秀麗隱桿線蟲的急性毒性反應(yīng)和24h的死亡情況，結(jié)果顯示順鉑對秀麗隱桿線蟲具有一定的毒性，其24h的LC50為617 mg·L-1，95%的置信區(qū)間為580～647 mg·L-1，當(dāng)順鉑濃度達(dá)到810mg·L-1以上時，線蟲在藥物加入后即出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，同時出現(xiàn)肌肉萎縮痙攣的現(xiàn)象，身體變短。隨著藥物作用的濃度升高，線蟲的運動能力、生殖能力、生長狀況受抑制越明顯。順鉑為細(xì)胞毒類化療藥物，在臨床應(yīng)用中，患者常會出現(xiàn)肢端麻痹的周圍神經(jīng)癥狀。此癥狀在本文實驗中也得到驗證：線蟲暴露于順鉑溶液后，表現(xiàn)為非正弦運動，運動能力下降（身體扭曲的幅度和頻率下降、運動的距離變短等）。本文得到的線蟲24h LC50可以為下一步的亞急性暴露實驗提供參考依據(jù)，為細(xì)胞毒藥物潛在毒性評價研究打下基礎(chǔ)。

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