超聲輔助提取漸尖毛蕨總黃酮的工藝研究

摘要：采用正交優(yōu)化試驗，以總黃酮得率作為考察指標(biāo)，對影響超聲輔助漸尖毛蕨總黃酮提取的因素進(jìn)行了研究。結(jié)果表明漸尖毛蕨總黃酮的最佳提取工藝條件：乙醇濃度為60%，時間為40min，料液比為1∶30，溫度為60℃。在最佳提取條件下，其得率可達(dá)43.62mg/g。

關(guān)鍵詞：漸尖毛蕨；總黃酮；超聲輔助；提取工藝

Abstract：The factors of ultrasonic assisted extraxtion of total flavonoids from Cyclosorus acuminatus was studied by the orthogonal test in this paper.The results showed that the optimal extraction conditions were as flows：alcohol concentratrion 60%，extraction time 40 min，material liquid 1：30，temperature at 60℃.The yield can reach 43.62mg/g under the optimum extracting conditions.

Key words：Cyclosorus acuminatus；Total flavonoids；Ultrasonic assisted；Extraction technics

重慶縉云山的已經(jīng)記載蕨類植物有38科74屬，149種，4變種。其中漸尖毛蕨Cyclosorus acuminatus（Houtt.）Nakai為金星蕨科毛蕨屬植物[1]，屬于縉云山廣布種，資源豐富，生于路邊濕地或溝邊、林緣。藥用。黃酮類化合物是植物的次級代謝產(chǎn)物，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃酮類化合物具有明顯的抗?jié)儭⒔獐d、抗炎、抗菌、抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫力、軟化血管、降血糖及降血脂等生理活性作用；如何在植物中提取黃酮類化合物進(jìn)行了廣泛的研究，但是目前中國對于漸尖毛蕨黃酮類化合物提取分離和應(yīng)用的研究較少[2～10]。本文采用單因素和正交試驗方法研究超聲輔助對漸尖毛蕨中總黃酮提取效率的影響，為更合理開發(fā)利用蕨類藥用植物提供理論參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 漸尖毛蕨于2014年5月采重慶市沙坪壩區(qū)縉云山海拔400m處（經(jīng)本校生藥學(xué)博士費(fèi)曜鑒定），干燥，用粉碎機(jī)粉碎，過5目篩；鹽酸（重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司）；鎂粉（湖北省天門市化學(xué)試劑廠）；三氯化鐵；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（UV≥98%，批號：130507，北京德威鈉生物技術(shù)有限公司）；Al（NO3）3·9H2O（上海振欣試劑廠，AR）；NaNO2（重慶北碚化學(xué)試劑廠，AR）；NaOH（重慶博藝化學(xué)試劑有限公司，AR）。

FW177型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；DGG-9240B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；SF-400A電子天平；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器（上海亞榮生化儀器廠）；電磁爐（格蘭氏生活電器）；藥典篩（浙江上虞市五四儀器廠）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用電器有限責(zé)任公司）；UV-1200型紫外可見分光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；SB-5200DT超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，200W）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.2方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取在干燥至恒重的蘆丁對照品20mg，置50ml量瓶中，加70%乙醇適量，超聲使其溶解，放冷后加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻。分別吸取0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml分別置于15ml具塞試管中，加5%亞硝酸鈉溶液0.5ml，搖勻，放置6min；加10%硝酸鋁溶液0.5ml，搖勻，放置6min，加4%氫氧化鈉溶液5ml，搖勻，靜置15min，于510nm處測吸光度。以濃度（C）與吸光度（A）進(jìn)行直線回歸，得方程：A=1.8064C-0.0188，r=0.9983。結(jié)果表明，在0.04～1.60mg/ml范圍內(nèi)，吸光度與蘆丁溶液濃度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

1.2.2漸尖毛蕨總黃酮含量及得率的測定 精密稱取漸尖毛蕨粉末1g（過藥典篩3號篩），置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇20ml，30℃超聲提取2次，30min/次，抽濾，合并2次濾液，水浴蒸干，殘渣加適量70%乙醇溶解轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，即得漸尖毛蕨供試品溶液。精密吸取樣品溶液1mL，按“1.2.1”項下方法顯色后立即測定吸光度，由回歸方程計算出供試樣品中總黃酮的得率?？傸S酮得率（%）=提取液中總黃酮質(zhì)量/漸尖毛蕨質(zhì)量×100%。

1.2.3超聲提取漸尖毛蕨總黃酮的研究 通過對超聲波法提取工藝中料液比、超聲時間超聲次數(shù)、乙醇濃度等影響漸尖毛蕨根中總黃酮提取率的因素進(jìn)行單因素試驗，并在超聲溫度為60℃的情況下，在單因素的基礎(chǔ)上對其他因素進(jìn)行正交試驗，確定最佳的工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1定性實驗 ①鹽酸-鎂粉反應(yīng)：取乙醇提取液2ml于試管中加鎂粉，再加入濃鹽酸數(shù)滴（1次加入），在泡沫處呈紫紅色。②三氯化鋁反應(yīng)：取樣品溶液點在濾紙上，滴加1%三氯化鋁的乙醇溶液，吹干，在可見光下呈灰黃色，在紫外光下呈黃色熒光斑點。通過上述兩個定性實驗證明漸尖毛蕨根中含有黃酮類物質(zhì)。

2.2單因素試驗結(jié)果與分析

2.2.1乙醇濃度對漸尖毛蕨總黃酮提取效果的影響 在超聲溫度40℃，超聲時間30min，料液比1∶20，提取2次條件下，選取乙醇溶劑濃度50%、60%、70%、80%、90%進(jìn)行超聲提取。從實驗結(jié)果圖1-a可知，隨著乙醇濃度的增加，總黃酮得率增加，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%以上時，增大乙醇濃度，總黃酮得率增加緩慢，說明乙醇濃度過大時，雜質(zhì)的溶出率大于總黃酮，再增加乙醇濃度意義不大，并且還會造成資源浪費(fèi)，故超聲乙醇濃度選用50%～70%。

2.2.2超聲時間對漸尖毛蕨總黃酮提取效果的影響 在超聲溫度40℃，乙醇濃度60%，料液比1∶20提取2次條件下，選取超聲時間為20、30、40、50、60min進(jìn)行超聲提取。實驗結(jié)果見圖1-b，隨著超聲時間的延長，總黃酮得率增加，當(dāng)超聲時間延長到40min以上時，繼續(xù)延長超聲時間，總黃酮得率呈下降趨勢，說明時間延長，雜質(zhì)溶出率大于總黃酮，故超聲時間選用30～50min。

2.2.3料液比對漸尖毛蕨總黃酮提取效果的影響 在超聲溫度40℃，超聲時間30min，乙醇濃度為60%，提取2次條件下，選取料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/ml）進(jìn)行超聲提取，實驗結(jié)果見圖1-c。，隨著料液比的增加，總黃酮得率增加，當(dāng)料液比達(dá)到1∶30（g/ml）以上時，增加料液比，總黃酮得率下降，故超聲料液比選用1∶20～1∶40。

2.2.4超聲溫度對漸尖毛蕨總黃酮提取效果的影響 在超聲時間30min，乙醇濃度60%，料液比1∶20（g/ml），提取2次條件下，選取超聲溫度30、40、50、60、70℃進(jìn)行超聲提取實驗見圖1-d。隨著超聲提取溫度的升高，總黃酮得率增加，當(dāng)超聲溫度升高到60℃以上時，總黃酮得率增加緩慢。若溫度繼續(xù)升高，漸尖毛蕨總黃酮可能受到破壞，得率也不會提高，故超聲提取溫度選用40～60℃。

2.3漸尖毛蕨總黃酮超聲提取的工藝優(yōu)化 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度，提取時間、料液比和超聲溫度4個因素進(jìn)行正交試驗L9（43）見表1，以總黃酮得率為考察指標(biāo)，確定提取漸尖毛蕨總黃酮的最佳工藝條件。

從表2極差分析結(jié)果得出，影響漸尖毛蕨總黃酮提取效率的影響因素：D>A>B>C，最佳工藝組合為A2B2C2D3，即乙醇濃度為60%，超聲處理時間40min，料液比1∶30（g/ml）和溫度60℃，因最佳提取工藝不在正交試驗設(shè)計之中，需要驗證試驗。

從方差分析結(jié)果表3可知，乙醇濃度（A）和超聲提取溫度（D）對超聲輔助提取漸尖毛蕨總黃酮有顯著性差異，超聲提取時間和料液比則無顯著性差異，如果產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)就主要考慮乙醇濃度和控制好提取溫度，在節(jié)約成本的前提下選擇適當(dāng)?shù)臈l件。

2.4驗證實驗 稱取漸尖毛蕨粉末3份，每份1g，按正交實驗所得的最佳提取工藝條件A2B2C2D3，進(jìn)行驗證實驗，測定漸尖毛蕨中總黃酮的含量，測得黃酮得率43.62mg/g，RSD=1.471%（n=3），所得結(jié)果比正交試驗表中各組合效果要好，表明試驗所確定的最佳工藝為較優(yōu)工藝。

3 結(jié)論與討論

本文研究了在超聲輔助下乙醇濃度、超聲時間、料液比、溫度等因素對漸尖毛蕨總黃酮提取的影響，結(jié)合正交試驗設(shè)計，確定了漸尖毛蕨總黃酮的最佳提取工藝為：乙醇濃度為60%，時間為40min，料液比為1∶30，溫度為60℃，影響漸尖毛蕨總黃酮提取效率的因素主次順序溫度>乙醇濃度>時間>料液比，其中超聲溫度和乙醇濃度對漸尖毛蕨總黃酮提取具有顯著性作用，在工業(yè)化生產(chǎn)時需要重點考慮。以最佳提取工藝提取漸尖毛蕨總黃酮的得率可達(dá)43.62mg/g。

西南地區(qū)蕨類資源十分豐富，如何開發(fā)利用蕨類資源中黃酮類資源是我們所要做的基本工作，本研究就是選用西南地區(qū)常見的一種蕨類為研究對象，采取超聲輔助的方法，以總黃酮得率為考察指標(biāo)，力求為更好地開發(fā)蕨類植物中所含黃酮類化合物提供理論依據(jù)。

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編輯/安樺