TGF—α、VEGF在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)及其與微血管密度的相關(guān)性研究

摘要：目的 探討轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α（TGF-α）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）在皮膚鱗狀細(xì)胞癌患者皮損血管生成機(jī)制中的作用。方法 采用SP免疫組化法檢測(cè)皮膚鱗狀細(xì)胞癌患者皮損處TGF-α、VEGF及微血管密度（MVD）的表達(dá)情況，并以正常人皮膚作對(duì)照。結(jié)果 皮膚鱗狀細(xì)胞癌患者皮損處TGF-α、VEGF的表達(dá)及MVD值顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01）；皮膚鱗狀細(xì)胞癌患者皮損中的TGF-α、VEGF表達(dá)與MVD呈正相關(guān)（r=0.668， r=0.720，均P<0.01），TGF-α與VEGF的表達(dá)也呈正相關(guān)（r=0.769，P<0.01）。結(jié)論 皮膚鱗狀細(xì)胞癌患者皮損中TGF-α、VEGF及MVD的表達(dá)水平均增高，表明TGF-α及VEGF可能引起皮膚鱗狀細(xì)胞癌患者皮損處血管增生，三者在皮膚鱗狀細(xì)胞癌皮損的形成發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮協(xié)同促進(jìn)調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞：皮膚鱗狀細(xì)胞癌；TGF-α；VEGF；MVD

Abstract：Objective To explore the effect of TGF-α and VEGF in the mechanism of the angiogenesis of squamous cell carcinoma.Methods SP immunohistochemistry was used to detect the the expression of TGF-α，VEGF and MVD from samples of squamous cell carcinoma tissue. Meanwhile，those factors were detected in normal skin tissue as control. Results The expression of TGF-α，VEGF and MVD in squamous cell carcinoma tissue group were signifcantly higher than those in the normal group （P<0.05）.The expression of TGF-α，VEGF were positively correlated with MVD levels in squamous cell carcinoma tissue group（r=0.668， r=0.720， allP<0.01）， the expression of TGF-α was also positively correlated with VEGF（r=0.769， P<0.01）. Conclusion The expression are increased of. TGF-α，VEGF and MVD in squamous cell carcinoma，they may play positive roles in regulating and facilitating synergy in the lesion specimens of squamous cell carcinoma.

Key words：Squamous cell carcinoma；TGF-α；VEGF；MVD

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）是由表皮和（或）附屬器角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)展演變的一種惡性腫瘤，因此又叫表皮樣癌，具有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)特性。目前研究表明，皮膚鱗狀細(xì)胞癌皮損處暴露部位微血管密度（MVD）之所以增加，是因?yàn)榛颊哌^(guò)度地接受外界的光刺激，大量地接受紫外線輻射更增加了上皮細(xì)胞癌變發(fā)生的幾率，上皮癌細(xì)胞分泌的血管形成因子是促使血管形成的間接因素，微血管生成異常與SCC的發(fā)生、持續(xù)存在有密切關(guān)系，在SCC的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[1]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TGF-α可以誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生VEGF，二者可能在血管增生中起協(xié)同作用[2]。本研究通過(guò)檢測(cè)SCC皮損中TGF-α、VEGF、CD34表達(dá)，旨在探討TGF-α、VEGF與微血管密度（MVD）相互關(guān)系及其在SCC發(fā)生中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 2014年1月～2015年10月我院皮膚科門診的SCC患者20例，均經(jīng)組織病理檢查確診，其中男14例，女6例，年齡35～80（59.7±15.6）歲，病程1月～18.5（6.8±4.9）年。根據(jù)Broders病理法判斷分級(jí)：I級(jí)6例，II級(jí)7例，III級(jí)7例，1V級(jí)0例，所有病例均未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。正常對(duì)照組20例，均為整形外科及骨科手術(shù)的非銀屑病患者的皮膚，男12例，女8例，年齡30～78（57.8±13.2）歲，所有標(biāo)本均有詳細(xì)完整的病歷存檔。兩組年齡、性別等均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較（P>0.05）。

1.2方法

1.2.1使用試劑 鼠抗人CD34單克隆抗體、兔抗人VEGF單克隆抗體、鼠抗人TGF-α單克隆抗體（所有試劑均有北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）和即用型SP免疫組化試劑盒也購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2操作方法與評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 在皮損處取1cm×1cm大小的標(biāo)本，深度可達(dá)脂肪層，4～5mm厚度。選擇固定液體，濃度為10%的中性福爾馬林液，容量一般為標(biāo)本體積的10～20倍，用石蠟將包埋，然后切片，SP免疫組化染色，可以根據(jù)試劑盒內(nèi)的說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行操作。對(duì)TGF-α、VEGF進(jìn)行染色處理，要確保在每張切片上都能對(duì)TGF-α、VEGF進(jìn)行整體觀察，可以選擇5個(gè)代表性區(qū)域，每區(qū)200個(gè)細(xì)胞，在400×倍視野下進(jìn)行觀察。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性數(shù)不超過(guò)5%的比例計(jì)為0；陽(yáng)性數(shù)在6%～35%計(jì)為1；陽(yáng)性數(shù)在36%～70%計(jì)為2；陽(yáng)性數(shù)超過(guò)70%的比例計(jì)為3。著色強(qiáng)度計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：0為不著色，1為弱著色（淡棕黃色），2為強(qiáng)著色（顯著棕黃色）。陽(yáng)性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：上述兩項(xiàng)相加，≤2分為陰性（-），3分為弱陽(yáng)性（+），4 分為中等陽(yáng)性（++），5分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。MVD：染色后呈棕黃或棕褐色、分界清楚的內(nèi)皮或內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)簇均可以作為一個(gè)血管計(jì)數(shù)，在100倍光鏡下，對(duì)每張切片選擇血管分布最高區(qū)域者，在200倍光鏡下，選擇5個(gè)視野，計(jì)算微血管的個(gè)數(shù)，并計(jì)算其平均值，得出單位面積的MVD值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，計(jì)量資料以（x±s）的形式表示，組間數(shù)據(jù)比較采用隨機(jī)t檢驗(yàn)，組內(nèi)數(shù)據(jù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析用Sperman處理。

2 結(jié)果

2.1 SCC皮損中與正常皮膚組織中TGF-α和VEGF表達(dá)結(jié)果的比較：TGF-α在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的量較大，在細(xì)胞核中少量表達(dá)，在SCC皮損中的表達(dá)強(qiáng)度與正常皮膚組織中的表達(dá)強(qiáng)度比較差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），在SCC組各層皮損中有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而在正常皮膚組織中各層均為弱陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)的強(qiáng)度都明弱于SCC組。VEGF主要位于表皮全層的角質(zhì)細(xì)胞，而真皮淺層血管內(nèi)皮細(xì)胞及其周圍部分炎細(xì)胞胞漿，在正常人皮膚中VEGF亦有表達(dá)，但表達(dá)弱，VEGF 在銀屑病中的表達(dá)為強(qiáng)陽(yáng)性，高于正常對(duì)照組（P<0.005）。20例SCC皮損組織中TGF-α陽(yáng)性表達(dá)率為90.0%（18/20）與正常皮膚對(duì)照組之間陽(yáng)性表達(dá)率10.0%（2/20）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=25.60，P<0.01）；SCC皮損組織中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率為85.0%（17/20）與正常皮膚對(duì)照組之間陽(yáng)性表達(dá)率15.0% （3/20）之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=19.60，P<0.01）；見(jiàn)表1。

2.2皮損組與正常對(duì)照組中CD34和MVD的比較：CD34在真皮淺層小血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中表達(dá)，呈環(huán)狀或條狀，彌漫分布，正常對(duì)照組的CD34與SC皮損組CD34在真皮層中血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中的表達(dá)均呈陽(yáng)性；皮損組MVD計(jì)數(shù)為（25.76±5.86），明顯高于正常對(duì)照組的（7.25±2.79），兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=12.75，P<0.01）。

2.3 SCC皮損中TGF-α、VEGF與MVD相關(guān)性：SCC患者皮損中的TGF-α、VEGF表達(dá)與MVD呈正相關(guān)（r=0.668， r=0.720，均P<0.01），TGF-α與VEGF的表達(dá)也呈正相關(guān)（r=0.769，P<0.05）。

3 討論

皮膚鱗狀細(xì)胞癌起源于表皮或其附屬器角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocyte，KC）的皮膚惡性腫瘤，其病因復(fù)雜，約占皮膚惡性腫瘤的60%左右，發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。皮膚鱗狀細(xì)胞癌微血管異常包括真皮淺層明顯的微血管擴(kuò)張，內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管生成。原發(fā)皮膚腫瘤的新生血管化程度與腫瘤侵襲性及預(yù)后存在相關(guān)性，為一獨(dú)立的預(yù)后因素。在眾多引起血管生成的誘導(dǎo)劑中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是目前發(fā)現(xiàn)的一類作用最強(qiáng)，特異性最高的促新生血管形成因子，它是內(nèi)皮細(xì)胞選擇性的有絲分裂原，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有特異性，可改變內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)，特異性引起血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖、通透性增加，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞遷移，誘導(dǎo)血管生成及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，從而誘導(dǎo)血管生成及炎癥反應(yīng)[3，4]。Maiolino等[5]檢測(cè)犬皮膚SCC中VEGF的表達(dá)情況，在所有SCC中都發(fā)現(xiàn)有VEGF的存在，提示VEGF可能成為評(píng)估皮膚SCC腫瘤惡性程度和生長(zhǎng)潛力的重要指標(biāo)。TGF-α是表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）家族的重要成員之一，編碼基因定位于2號(hào)染色體，是EGFR的配體，由角質(zhì)形成細(xì)胞生成，可以自分泌的方式與表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）結(jié)合促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的有絲分裂，其作用是刺激上皮細(xì)胞增生并誘導(dǎo)組織細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)化作用。RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)在SCC和BCE的鄰近表皮（距腫瘤邊緣2～3mm的表皮）內(nèi)TGF-α mRNA表達(dá)是正常皮膚的2.0～2.7倍；SCC中瘤組織TGF-α mRNA表達(dá)是正常皮膚的4.9倍，而其在BCE中表達(dá)僅為正常皮膚的78%，TGF-α在SCC中的高表達(dá)為其生長(zhǎng)提供了基礎(chǔ)[6]。CD34抗原是一種階段特異性白細(xì)胞分化抗原，作為普遍認(rèn)同的細(xì)胞標(biāo)記物，它存在于血管的內(nèi)皮。因此，能夠很清晰地把毛細(xì)血管的形態(tài)顯示出來(lái)，使用CD34來(lái)標(biāo)識(shí)血管內(nèi)皮，能夠測(cè)算出MVD，而MVD又能夠反應(yīng)出新生的微血管的增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，能對(duì)血管的生成進(jìn)行定量計(jì)算，CD34在眾多血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物中比較敏感，更具有特異性，觀察也比較方便[7]。TGF-α、VEGF可以旁分泌或自分泌方式影響腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移，許多皮膚腫瘤可產(chǎn)生TGF-α、VEGF，但皮膚腫瘤中TGF-α、VEGF表達(dá)及其與MVD的關(guān)系研究較少。

本研究結(jié)果表明，正常人表皮各層均有TGF-α弱表達(dá)，誘導(dǎo)表皮細(xì)胞正常的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)化。在SCC組織表皮各層中的表達(dá)強(qiáng)度均顯著強(qiáng)于正常對(duì)照組，提示TGF-α通過(guò)自分泌調(diào)節(jié)方式刺激和加速角質(zhì)形成細(xì)胞的形成和生長(zhǎng)，表明TGF-α在SCC的發(fā)展和持續(xù)過(guò)程中可能起著一定的作用。其機(jī)制可能是[8]：EGFR效應(yīng)器（Erk1/2、Akt）激活見(jiàn)于SCC癌細(xì)胞和SCC、BCE鄰近表皮，表達(dá)過(guò)度的EGFR和存在過(guò)量的TGF-α互相發(fā)生作用，EGFR和TGF-α相結(jié)合后的受體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生二聚體化和自身磷酸化效應(yīng)，EGFR被活化，同時(shí)激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路，受體上的酪氨酸激酶（PTK）也被激活，然后再激活MAPK信號(hào)系統(tǒng)，信號(hào)傳導(dǎo)因子細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（EPK）通路被激活，然后進(jìn)入細(xì)胞核，使得轉(zhuǎn)錄因子被磷酸化，DNA合成增加，促使細(xì)胞發(fā)生分化增殖，EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與化學(xué)物質(zhì)和癌基因誘導(dǎo)的皮膚癌變。我們的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，在SCC患者皮損中血管內(nèi)皮細(xì)胞和正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞同時(shí)表達(dá)VEGF，在SCC組織表皮各層中的表達(dá)強(qiáng)度均顯著強(qiáng)于正常對(duì)照組，提示VEGF在SCC的發(fā)病機(jī)制中起到了重要的作用。張錫寶等[9]研究表明 VEGF 在 PS 患者皮損及非皮損中的角質(zhì)形成細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，而在正常人中幾乎未見(jiàn)表達(dá)，且與 PS 的病期及疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，與我們的研究結(jié)果相符。SCC中VEGF介導(dǎo)的血管生成過(guò)程機(jī)制可能是：①角蛋白細(xì)胞（Keratinocytes，KC）在受到缺氧等各種刺激后通過(guò)自分泌或旁分泌釋放細(xì)胞因子，促進(jìn)VEGF表達(dá)，同時(shí)缺血缺氧也能導(dǎo)致VEGFR數(shù)量增加和功能增強(qiáng)，又由于有正反饋?zhàn)饔?，VEGF的濃度增高又上調(diào)了VEGFR 的表達(dá)。當(dāng)高濃度的VEGF與VEGFR結(jié)合后，通過(guò)絡(luò)氨酸激酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)使胞內(nèi)發(fā)生一系列改變，促使血管通透性增加及血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移，最終導(dǎo)致新生血管形成[10]；②EGF與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的特異性受體Fit-1和激酶插入嵌合受體（kinase insert domaincontaining receptor，KDR）結(jié)合，激活受體內(nèi)的酪氨酸激酶，引起一系列信號(hào)傳導(dǎo)，促使血管通透性增加及血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移，最終導(dǎo)致新生血管形成[11]。本研究結(jié)果還顯示，SCC患者皮損中MVD值較低正常對(duì)照組顯著升高。SCC皮損中TGF-α、VEGF表達(dá)與MVD相關(guān)性結(jié)果顯示，TGF-α和VEGF的表達(dá)與MVD值呈明顯正相關(guān)，TGF-α與VEGF的表達(dá)也呈正相關(guān)，表明SCC患者皮損中TGF-α和VEGF可能發(fā)揮協(xié)同作用，促進(jìn)血管新生從而促進(jìn)SCC的發(fā)生。

總之，對(duì)SCC血管生成的研究有助于揭示SCC的發(fā)病機(jī)制，并指導(dǎo)臨床治療。綜合我們的研究結(jié)果表明，檢測(cè)TGF-α、VEGF與CD34在SCC皮損中的表達(dá)以及與MVD的相關(guān)性研究，對(duì)進(jìn)一步了解SCC血管生成情況以及為抗SCC新藥開(kāi)發(fā)提供新的藥物靶位。

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