白胡椒總生物堿的體外抗腫瘤作用研究

摘要：目的 研究白胡椒總生物堿對體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞株生長與集落形成的抑制影響。方法 白胡椒總生物堿用80%的乙醇進(jìn)行索氏提取，再用大孔樹脂進(jìn)行純化，用三氯甲烷萃取得到。采用四甲基噻唑藍(lán)（MTT）法和細(xì)胞集落計數(shù)法檢測生物堿對體外培養(yǎng)的SWWC116癌細(xì)胞、NCI-446癌細(xì)胞和Hela癌細(xì)胞的集落形成與生長的抑制作用。結(jié)果 白胡椒總生物堿顯著抑制了SWWC116細(xì)胞和Hela細(xì)胞的集落形成和生長，抑制生長的IC50值分別為1.8mg/L和10mg/L，抑制集落形成的IC50值分別為0.3mg/L和0.9mg/L。而對NCI-446細(xì)胞的集落形成和生長無顯著性抑制。結(jié)論 白胡椒生物堿對體外培養(yǎng)的兩種癌細(xì)胞具有顯著的抑制作用。

關(guān)鍵詞：白胡椒；總生物堿；集落形成法；MTT法

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

Abstract：Objective To test the antitumor activity of alkaloids from white pepper on NCI-446， SWWC116， Hela tumor cells in vitro. Methods In vitro study on the pharmacological activity of alkaloids from white pepper were performed by using MTT assay and Colony-forming assay. Results The result showed that alkaloids from White pepper had inhibition activity against Hela and SWWC116 tumor cell etc. Conclusion Alkaloids from white pepper has antitumor activity.

Key words：White pepper；Antitumer activitiey；Aalkaloids

白胡椒為胡椒科植物胡椒（Piper nigrum L）的成熟的果實。原產(chǎn)地為東南亞，在我國得主要產(chǎn)區(qū)在海南省，是海南省的特色農(nóng)產(chǎn)品之一[1]。在華南地區(qū)、云南省和臺灣省也有栽培。白胡椒為藥食兩用植物。在食品領(lǐng)域，白胡椒是優(yōu)良的調(diào)味劑，還具有食品天然防腐劑的作用，被廣泛用作腌制品的防腐性香料。在醫(yī)藥領(lǐng)域，白胡椒具有調(diào)熱、健胃、利尿及支氣管黏膜刺激等作用，可治療消化不良、積食、寒痰、腸炎、感冒、支氣管炎和風(fēng)濕病等[2]。最近的研究表明，白胡椒在抗炎、抗驚厥、殺蟲鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、和抗癌等多方面存在活性[3，4]。為了探討白胡椒生物堿的抗癌作用，本實驗對白胡椒總生物堿進(jìn)行體外抗腫瘤研究。現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 實驗用白胡椒產(chǎn)地海南。人大腸癌細(xì)胞SWWC116、人肺腺癌細(xì)胞NCI-446和人宮頸癌細(xì)胞Hela均由吉林省腫瘤醫(yī)院提供。

1.2試劑與儀器 MTT試劑由德國Sigma公司提供；胚胎牛血清（FBS）由杭州四季青生物工程材料有限公司提供；胰蛋白酶由天津市景洋生物制品有限責(zé)任公司提供；RPMI-1640培養(yǎng)基由美國GIBCO公司提供；二甲基亞砜（DMSO）、乙醇、三氯甲烷等均為國產(chǎn)分析純試劑。D106型大孔吸附性樹脂為工業(yè)品。

FZ102型微型植物粉碎機(jī)，主要儀器設(shè)備有MP2002型電子分析天平，KQ3200V型超聲波清洗器，SHZ-D型循環(huán)水多用真空泵，RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，752型紫外分光光度計，SHELLAB型CO2培養(yǎng)箱，BIOCELL酶標(biāo)儀，OLYMPUS倒置顯微鏡等。

1.3生物堿的提取分離方法[5] 將白胡椒粉碎，過100目篩。稱取10 g于1000mL圓底燒瓶中，加90%乙醇200ml，在90℃回流提取2h，抽濾后收集濾液。殘渣加入150ml 80%乙醇重復(fù)提取1次，過濾后棄去殘渣，合并2次濾液，用D106大孔吸附樹脂吸附，60%乙醇洗脫（流速2～3ml/s）。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收洗脫液中的乙醇，濃縮至50ml，加0.5% 鹽酸調(diào)pH至2～3后抽濾。濾液用1倍體積的三氯甲烷萃取2次，棄去三氯甲烷層，合并水層。加0.5%的NaOH調(diào)pH至7左右，抽濾后除去鞣質(zhì)，繼續(xù)加0.5%的NaOH調(diào)pH至9～11，用100ml三氯甲烷萃取3次，棄去水層，合并三氯甲烷相?；厥盏玫降娜燃淄椴糠纸?jīng)濃縮，真空干燥，備用。

1.4腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)方法[6] 取-15℃冷凍保存的3種癌細(xì)胞于37℃水浴中解凍，加培養(yǎng)液稀釋后，1000r/min的速度離心5分鐘，接種于500ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過夜，換液，待細(xì)胞覆蓋瓶底的70%左右時，經(jīng)0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化，傳代培養(yǎng)。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞生長[7，8] 取數(shù)生長期的3種腫瘤細(xì)胞，各自用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%牛胚胎血清）調(diào)配成濃度為5×104細(xì)胞/mL的細(xì)胞培養(yǎng)液，接種于96孔板中，每孔加100μL細(xì)胞培養(yǎng)液。5% CO2、在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，吸取上清，加含白胡椒生物堿的培養(yǎng)基（濃度為0.01，0.1，1，10，100g/L）200μL，每個濃度設(shè)置5個平行樣，并設(shè)置5個空白對照樣，空白對照里加培養(yǎng)基200μL。在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入180μL培養(yǎng)基（不含血清）和20μL 5mg/ml的MTT。37℃條件下培養(yǎng)4h，用酶標(biāo)儀檢測630nm處的吸光度。按下列公式計算細(xì)胞生長抑制率，重復(fù)3次。抑制率=（A對照組-A藥物組）/A對照組×100%

1.6集落形成抑制作用的檢測方法 用0.5ml、0.25%的胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的癌細(xì)胞，計數(shù)，用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%牛胚胎血清）調(diào)配成濃度為200細(xì)胞/ mL的培養(yǎng)液，接種于24孔板，每孔加入1ml培養(yǎng)液，其中包含900μL癌細(xì)胞培養(yǎng)液和100μL白胡椒生物堿培養(yǎng)液，設(shè)5個不同的濃度梯度，終濃度為0.01，0.1，1，10和100g/L，每種濃度設(shè)5個平行樣，5個對照孔里各加入900μL癌細(xì)胞培養(yǎng)液和100μL不含生物堿的培養(yǎng)基，置5% CO2、37℃條件培養(yǎng)7d。吸取上清液，細(xì)胞集落用瑞氏染液染色5min，用Sorensen磷鉬酸緩沖液和Giemsa's溶液以9∶1混合后再染色5min。流水沖洗，涼干，用顯微鏡計數(shù)含50個細(xì)胞以上的集落，重復(fù)3次。按下列公式計算集落形成的抑制率。集落形成抑制率（%）=1-細(xì)胞集落數(shù)/對照組集落數(shù)×100%

2 結(jié)果

2.1白胡椒生物堿對體外培養(yǎng)的3種癌細(xì)胞生長的影響：MTT法具有良好的穩(wěn)定性和靈敏度，可評價性高、測定結(jié)果客觀及操作簡單等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于藥物篩選和醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域的研究中[8]。本論文利用該方法觀察了白胡椒生物堿對3種體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞生長的抑制作用。從圖1可看出，白胡椒總生物堿顯著抑制了SWWC116細(xì)胞和Hela細(xì)胞的生長，并具有劑量依存關(guān)系，其達(dá)到50%抑制率所需的藥物濃度（IC50值）分別為10mg/L和1.8mg/L。對NCI-446細(xì)胞生長的抑制率雖然較低，但具有明顯的劑量依存關(guān)系。

圖1 白胡椒總生物堿對不同腫瘤細(xì)胞生長的抑制曲線

注：與空白對照組比較，**P<0.01

2.2白胡椒生物堿對體外培養(yǎng)的3種癌細(xì)胞集落形成的抑制作用：計數(shù)集落形成的方法能反映單個細(xì)胞的增殖能力，通過集落計數(shù)能較靈敏地測定藥物的抗癌活性，目前被認(rèn)為是一種較理想的檢測方法[9]。圖2為白胡椒總生物堿對SWWC116、NCI-446和Hela細(xì)胞株集落形成的影響。從圖2可看出，白胡椒總生物堿對3種腫瘤細(xì)胞的集落形成均有抑制作用，且抑制率與濃度成正比。其對Hela和SWWC116細(xì)胞集落形成的抑制作用非常明顯，達(dá)到50%抑制率所需濃度IC50值分別為0.9mg/L 和.3mg/L。在本實驗條件下無法得到對NCI-446細(xì)胞集落抑制的IC50值。

3 討論

胡椒堿是胡椒中主要的活性化學(xué)物質(zhì)，屬于桂皮酞胺類生物堿。目前已發(fā)現(xiàn)胡椒堿具免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、有抗氧化以及促進(jìn)藥物代謝等作用[10～14]。

用體外試驗的方法篩選抗腫瘤藥物時，藥物的50%致死率小于10mg/L，且呈劑量依存性，該藥被認(rèn)為有抗腫瘤活性[15]。白胡椒生物堿顯著抑制Hela細(xì)胞和SWWC116細(xì)胞的生長，且IC50值分別為1.8mg/L、10mg/L，對細(xì)胞集落形成抑制的IC50值分別為0.3mg/L和0.9mg/L，并具有劑量依存型。因此，白胡椒總生物堿對2種體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞具有非常顯著的抑制作用，具有進(jìn)一步研究和開發(fā)價值。但白胡椒生物堿中主要有哪些活性具有抗腫瘤作用不是很清楚。因此，在今后的研究中一方面采用GC-MS或者HPLC-MS對白胡椒主要的抗腫瘤活性成分進(jìn)行定性定量分析，另一方面加強(qiáng)對白胡椒抗腫瘤活性物質(zhì)的應(yīng)用研究，在進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化的基礎(chǔ)上，應(yīng)用到人畜腫瘤治療中去。

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編輯/倪冰冰