siRNA沉默LAT2對(duì)RASFs侵襲的影響

摘要：本文主要采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)LATs（L-type amino acid transporters，LATs）家族成員在類風(fēng)濕患者滑膜組織中的表達(dá)。利用人工合成的siRNA沉默LAT2基因，采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)LAT2的沉默效率，采用 Transwell法檢測(cè)沉默LAT2后對(duì)RASFs侵襲的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在類風(fēng)濕滑膜組織中表達(dá)的LATs家族成員主要有LAT1、LAT2和LAT3，其中LAT2的表達(dá)明顯高于LAT1和LAT3，在有效下調(diào)LAT2（P<0.01）后發(fā)現(xiàn)與陰性對(duì)照組（NC對(duì)照組）相比細(xì)胞的侵襲能力明顯下調(diào)（P<0.01）。

關(guān)鍵詞：siRNA；LAT2；類風(fēng)濕滑膜成纖維細(xì)胞；侵襲

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要特征的自身免疫系統(tǒng)疾病。其主要的病理特征為滑膜細(xì)胞異常增殖和炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，侵襲軟骨，破壞骨組織，嚴(yán)重時(shí)可致殘[1]。目前RA已成為危害人類健康的重要疾病之一，但其病因尚不清楚。已有研究證實(shí)，RA成纖維樣滑膜細(xì)胞（rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes， RASFs）作為RA的主要效應(yīng)細(xì)胞，在RA的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用[2～4]。并且在發(fā)病過程中RASFs表現(xiàn)為過度增殖、凋亡不足、炎性因子分泌過多等生物學(xué)特征[5，6]，但其具體機(jī)制尚需探索。

LAT2 （L-type amino acid transporter2，LAT2）是一種非Na+依賴的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體，存在于細(xì)胞膜表面，與4F2的重鏈共價(jià)連接發(fā)揮生物學(xué)功能[7～9]。有文獻(xiàn)報(bào)道，LAT2主要表達(dá)于小腸、腎臟、大腦、胎盤、卵巢、睪丸、骨骼肌和胰腺[10]。細(xì)胞的增殖分化離不開氨基酸，而LAT2作為氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體在異常增殖和侵襲的RASFs中發(fā)揮重要的作用。但目前LAT2在RASFs中仍未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過對(duì)RASFs中高表達(dá)的LAT2進(jìn)行有效下調(diào)，探究其對(duì)細(xì)胞侵襲的影響，以期能夠加深對(duì)RA發(fā)病機(jī)制的了解。

1 材料與方法

1.1主要試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Corning公司；胎牛血清、Ⅱ型膠原酶購(gòu)于美國(guó)Gibco公司； MTS購(gòu)于美國(guó)Promega公司；HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于德國(guó)Qiagen公司；TRIzol Reagant 購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；SYBR Green 購(gòu)于德國(guó)Roche公司； Transwell小室購(gòu)于美國(guó)BD（Becton， Dickinson and Company）公司。

1.2主要儀器 LightCycler480 Thermocycler購(gòu)于德國(guó)羅氏公司；PCR Thermal Cycler購(gòu)于日本TakaRa公司；倒置顯微鏡購(gòu)于日本Nikon公司Synergy HT酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Bio Tek公司。

1.3原代細(xì)胞培養(yǎng) 本文所有樣本來自山東省立醫(yī)院，所有樣品均經(jīng)患者知情并同意，并經(jīng)山東省立醫(yī)院院倫理委員會(huì)通過。RA患者膝關(guān)節(jié)滑膜組織用Hank's平衡鹽溶液沖洗5～10次，將組織充分剪碎分裝于培養(yǎng)皿中，加入4ml DMEM培養(yǎng)基和120μL二型膠原酶，37℃，6h。消化充分后加入3mL無EDTA的胰酶，進(jìn)行吹打、消化、過篩。過篩后的細(xì)胞懸液收集與離心管中，1500r/min，離心5min。棄上清液，沉渣混勻培養(yǎng)至 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.4采用Trizol法提取細(xì)胞或組織中的RNA 向組織或者細(xì)胞中加入Trizol反復(fù)吹打均勻；再加入氯仿（每500μL Trizol加入200μL氯仿），劇烈震蕩15s，4℃靜置15min，12000r/min，4℃離心15min，取上清于1.5ml離心管中，加入異丙醇250μL，震蕩15s，4℃靜置10min。12000r/min，4℃離心10min，棄上清，加入500mL無水乙醇混勻，洗滌RNA。12000r/min，4℃離心5min，棄上清，室溫干燥5～10min。

1.5采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá) ①根據(jù)Solabio反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。②反應(yīng)體系（10μL）：5μL上樣緩沖液，1μL上游引物，1μL下游引物，1μLcDNA，2μL去離子水。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性10s，60℃退火10s ，45個(gè)循環(huán)；72℃延伸10s。mRNA 相對(duì)表達(dá)量采用比較閾值周期（Ct）方法分析。以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.6細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 將RASFs以2×105個(gè)/孔接種于12孔板中。根據(jù)HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)干擾組和陰性對(duì)照組（NC對(duì)照組）。在24、48h收集細(xì)胞。先將siRNA和HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑在200μL高糖DMEM培養(yǎng)基中混合10min，以便形成siRNA-HiPerFect復(fù)合物，加至含有細(xì)胞懸液的12孔板內(nèi)。

1.7采用Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 RASFs以（5～10）×104個(gè)/孔接種于Transwell的小室內(nèi)室，外室加入500μL高糖DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2，24h后換成高糖DMEM培養(yǎng)基（1%的青鏈霉素混合液）進(jìn)行饑餓，37℃、5%CO2培養(yǎng)8h。將小室外室換成高糖DMEN培養(yǎng)基（20%胎牛血清和1%的青鏈霉素混合液），37℃、5%CO2培養(yǎng)24h。棄小室內(nèi)室培養(yǎng)基，外室換成4%多聚甲醛，室溫固定1h，固定結(jié)束后將下室換成瑞氏-姬姆薩復(fù)合染液500μL（A液與B液1：6混合）染色24h，制片。鏡下隨意取5個(gè)視野，細(xì)胞計(jì)數(shù)并比較。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩樣本比較采用t檢驗(yàn)分析。*P<0.05為差異顯著，**P<0.01，***P<0.001為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 LATs在滑膜組織中的表達(dá) 滑膜組織中主要有LAT1、LAT2和LAT3 3個(gè)LATs家族成員表達(dá)，其中LAT2的表達(dá)水平明顯高于LAT1和LAT3（P<0.001），見圖1。

2.2 siRNA的抑制效率 與NC對(duì)照組相比，三組siRNA均可明顯抑制LAT2在mRNA水平的表達(dá)。其中siLAT2-2在24h和48h的抑制效率最為顯著，達(dá)90%左右，見圖2。以下實(shí)驗(yàn)將選取此干擾組繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 siRNA下調(diào)LAT2后對(duì)RASFs侵襲的影響 與NC對(duì)照組相比，siLAT2-2組穿過小室的細(xì)胞數(shù)明顯減少。顯微鏡下任取5個(gè)視野，對(duì)穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，siLAT2-2組與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖3。

3 討論

大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，RASFs在RA的發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用。RA的病理特征為滑膜細(xì)胞增生和炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，而異常增生的細(xì)胞必然需要大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氨基酸，由此推測(cè)，氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)載體在這一過程中可能發(fā)揮重要的作用。本研究通過對(duì)RA患者的滑膜組織檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在RA患者的滑膜組織中主要有LAT1、LAT2和LAT3的表達(dá)，其中LAT2的表達(dá)明顯高于LAT1和LAT3。由此推測(cè)LAT2可能對(duì)RA滑膜組織中氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)以及細(xì)胞的增值侵襲等起重要的作用。氨基酸的異常吸收和代謝往往與疾病的發(fā)生密切相關(guān)[8]，并且已有文獻(xiàn)證實(shí)，類風(fēng)濕患者的氨基酸代謝和吸收異常[7]。因此推測(cè)作為氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體LAT2可能對(duì)RASFs侵襲密切相關(guān)。

目前對(duì)LAT2的研究已經(jīng)應(yīng)用于臨床，并且具有廣闊的治療前景。它可以識(shí)別并轉(zhuǎn)運(yùn)甲狀腺激素，利用LAT2轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的特性可以與左旋多巴結(jié)合穿過血胎屏障和血腦屏障到達(dá)病灶[7]。本文首次探索LAT2的高表達(dá)本身可能是RA 的致病原因之一，期望通過對(duì)LAT2的探索加深對(duì)RA治病機(jī)制的了解，并提供一種潛在的治療途徑。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)LAT2的表達(dá)后RASFs的侵襲能力明顯降低。這也為治療滑膜細(xì)胞侵襲軟骨、破壞骨組織提供一種新的潛在的途徑。

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編輯/安樺