用TK基因突變試驗評價三種海洋生物肽的抗誘變性

摘要：目的 評價三種海洋生物肽（包括膠原肽、骨原肽和蛋白肽）的抗誘變作用，為其進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。方法 采用TK基因突變試驗，觀察三種海洋生物肽四個劑量組中（7.5、15、30、60mg/ml）TK6細胞對MMS誘導(dǎo)的tk基因突變頻率的影響。結(jié)果 陰性對照組的總突變頻率顯著低于5μg/ml MMS陽性對照組，陽性對照組的總突變頻率顯著高于100g/ml VitC+5μg/ml MMS抗誘變對照組，可知本試驗系統(tǒng)可靠。與MMS陽性對照組相比，海洋生物肽各劑量組的總突變頻率均顯著降低，且有良好的劑量反應(yīng)關(guān)系。結(jié)論 三種海洋生物肽均具有抑制MMS誘導(dǎo)的tk基因突變作用，且不同劑量抗誘變作用均較為理想。

關(guān)鍵詞：海洋生物肽；TK6細胞；TK基因突變試驗；抗誘變

現(xiàn)代海洋生物活性物質(zhì)的研究始于20世紀60年代，迄今為止多達2000多種具有重要生理及藥理活性的化合物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)[1]。海洋生物生活在一個充滿競爭的與陸地完全不同的環(huán)境中，這種環(huán)境迫使海洋生物必須制造出特殊的、有效的活性分子以適應(yīng)生存[2]。從海洋生物中提取到的生物活性物質(zhì)種類繁多，有多肽類、萜類、生物堿類、大環(huán)聚酯類、聚醚類等化合物。而本課題所用三種海洋生物肽（包括蛋白肽、膠原肽和骨原肽）是由中國食品工業(yè)發(fā)酵研究院提供，是利用生物酶解技術(shù)，分別以海洋水產(chǎn)品的魚肉、魚皮和魚骨為主要原料，生產(chǎn)得到的混合寡肽。在本研究中我們利用TK 基因突變試驗檢測，對三種海洋生物肽（膠原肽、骨原肽和蛋白肽）的抗誘變作用進行探討，為其進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1受試物 海洋膠原肽、骨原肽和蛋白肽均由中食海氏生物技術(shù)有限公司提供，為淡黃色粉末狀，試驗前用蒸餾水稀釋成不同濃度。

1.2細胞株與細胞培養(yǎng) TK6（tk+/-）細胞由日本國立研究所本間正充惠贈。

1.3劑量設(shè)計試驗 TK6細胞測定3d表達期內(nèi)的相對懸浮生長率（RSG）。在RSG20%～80%范圍內(nèi)設(shè)定4個劑量組，另設(shè)抗誘變陽性對照（100μg/ml VitC+5μg/ml MMS）、陽性對照（MMS，5μg/ml）和陰性對照。

1.4清除自發(fā)突變 參照文獻[3]進行。

1.5受試物處理 將TK6細胞調(diào)至2×105/ml，每瓶10ml。按1%加入不同濃度受試物，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中處理4h后，1000r/min離心10min，棄上清液，用PBS緩沖液洗滌細胞兩次，重新懸浮細胞于含10%馬血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，并調(diào)整細胞密度到2×105/ml。

1.6平板接種效率（PE0、PE3）測定 收集、洗滌處理結(jié)束的細胞并調(diào)整細胞密度為2×105/ml，再通過梯度稀釋調(diào)整細胞密度為8個/孔，接種到96孔板，每孔加200μl，每個劑量一塊平板，在37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14d，14d后肉眼計數(shù)每塊平板的集落生長孔數(shù)。1.5中剩余細胞繼續(xù)表達培養(yǎng)3d，表達培養(yǎng)結(jié)束后，按上述PE0方法測定PE3。

1.7突變頻率（MF）測定 取經(jīng)表達培養(yǎng)3d的細胞，將細胞密度調(diào)整為1.5×105/ml，按0.1%加入1000×TFT，使其終濃度為3 g/ml，然后將細胞懸液加到96孔板中，每孔加200μl。每個劑量組做兩個平行，培養(yǎng)14d后，計算集落生長孔數(shù)。

1.8結(jié)果評價及判定標準 PE0、PE3、RS0和RS3、RSG、RTG、TMF、SC%等計算方法和結(jié)果判定標準參照文獻[3]。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用Mutant TM軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

見表1和圖1。

從表1和圖1可見，溶劑對照組的總突變頻率顯著低于MMS陽性對照組（P<0.01），MMS 陽性對照組的總突變頻率顯著高于100g/mlVitC+MMS 組（P<0.01），表明本試驗系統(tǒng)可靠。三種海洋生物肽各劑量+MMS組的總突變頻率顯著低于MMS陽性對照組（P<0.01），且有良好的劑量反應(yīng)關(guān)系，推知三種海洋生物肽均具有抑制MMS誘導(dǎo)的tk基因突變作用。

3 討論

海洋生物活性肽是近年來臨床醫(yī)學(xué)界較為認同的海洋生物制劑，受到各國生物醫(yī)學(xué)研究者的密切關(guān)注。近年來，關(guān)于海洋生物活性肽的生物學(xué)研究逐漸增多，其活性作用集中在多個方面：①血液系統(tǒng)，降血脂，降膽固醇，降低血液粘稠度，提高造血系統(tǒng)活性；②內(nèi)分泌系統(tǒng)，降血壓、調(diào)節(jié)血糖、糾正內(nèi)分泌紊亂；③消化系統(tǒng)，保護胃黏膜、抗?jié)儭⒋龠M潰瘍面愈合；④免疫系統(tǒng)，增強免疫力、抗過敏；⑤皮膚方面，促進傷口愈合、修復(fù)角膜上皮損傷等；⑥癌癥治療，可抑制腫瘤細胞生長，甚至直接殺死腫瘤細胞；⑦其他作用，如增加骨密度、抗氧化、、抗衰老等[4，6]。世界范圍對海洋生物肽研究尚處于起步階段，而其抗誘變性研究較為稀少，故本次研究深入研究了其抗誘變性生物活性。甲基磺酸甲酯（MMS）是一種直接烷化劑，主要是使嘌呤堿基的氮原子甲基化，導(dǎo)致堿基不穩(wěn)定，進而導(dǎo)致染色體重排或重組。本研究結(jié)果表明，三種海洋生物肽能夠降低MMS誘導(dǎo)的總突變頻率，并有劑量效應(yīng)關(guān)系，表明三種海洋生物肽具有較強的抗誘變作用。

目前，常用于檢測化合物抗誘變性的實驗較多，但是由于這些實驗的檢測終點不同，且一般僅能檢測到單一的遺傳毒性效應(yīng)，可能造成假陰性結(jié)果，故通常需要一組實驗以全面評價受試物的遺傳毒性。目前，Ames實驗、微核試驗、染色體畸變實驗等較為常見，彗星實驗、HPRT實驗應(yīng)用也較多，但是都存在上述缺點，故本次研究重新選擇了實驗方法。1970年以后，誘變性檢測發(fā)展速度加快，其中TK基因突變試驗開始出現(xiàn)，并成為當(dāng)前誘變性檢測的主要方法。TK基因突變試驗是一種體外實驗方法，其對tk位點周圍的基因損傷檢測較為準確，對較大的遺傳性改變檢測準確性極高，如染色體非整倍性，此外，對微小的基因改變也具有較高的檢測準確性，如缺失片段、突變位點、重組片段等，都可以準確檢測獲知，具有高靈敏性，檢測范圍廣等優(yōu)點，因此常被國內(nèi)外用作初篩致癌物和致突變物[7]。TK基因突變實驗常使用L5178Y、WTK1、TK6以及TK6-E6等tk+/-雜合型細胞株，其中TK6屬于人類接觸安全性評價的重要指標，來源于二倍體類淋巴母細胞（人類）[7]，故廣泛應(yīng)用于TK基因突變實驗檢測，對于誘變性結(jié)果安全評價具有重要作用。

目前，國內(nèi)外尚少見有關(guān)海洋生物肽抗誘變性的報道，國外文獻研究開始較早，因而海洋生物肽的抗誘變性逐漸被發(fā)現(xiàn)，而近年來我國海洋生物學(xué)家及醫(yī)學(xué)家也開始對其抗誘變性進行系統(tǒng)性研究。近年來，在生物抗誘變性研究中，食物方向相關(guān)研究開始較早，目前文獻資料較為豐富，目前已知多種食物具有明確的抗誘變活性，可用于日常飲食、養(yǎng)生保健，而食物研制的藥物相對較少，未廣泛應(yīng)用于臨床治療中。由于食品的抗突變作用已引起不少研究者的重視和研究。某些食物中的維生素、氨基酸、礦物質(zhì)本身屬于營養(yǎng)物質(zhì)，而這些營養(yǎng)物質(zhì)具備抗突變、抗癌的作用；此外，食物中的一些含量較少的天然物質(zhì)也具有抗突變、抗癌、抗氧化等活性，而這類物質(zhì)往往不屬于營養(yǎng)物質(zhì)，但是其極高的抗誘變性活性具有極高的研究價值，可提取制成某些特定生理活性的化學(xué)藥物[8]。故本研究利用TK基因突變實驗來研究三種海洋生物肽的抗誘變性，實驗結(jié)果證實三種海洋生物肽在實驗劑量范圍內(nèi)有抗誘變性，其獨特的生理活性對于抗癌藥物開發(fā)具有重要作用。海洋生物肽同樣具有較高的食用價值，可作為日常保健食品進行研發(fā)、生產(chǎn)，為現(xiàn)代人健康提供保障，發(fā)揮其預(yù)防癌癥的作用。

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[8]袁振華.食品中致突變物及抗突變研究進展[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2003， 15（8）：52-56.編輯/倪冰冰