miR—150促進鼻咽癌細胞放療抵抗

摘要：目的 探討miR-150介導(dǎo)鼻咽癌放療抵抗，揭示miR-150作為癌基因作用。方法 Real-time PCR檢測miR-150在鼻咽癌細胞系中的含量；將miR-150 模擬物轉(zhuǎn)染CNE-2，miR-150 抑制劑轉(zhuǎn)染CNE-2R，采用MTS檢測其對CNE-2細胞生長的影響。結(jié)果 miR-150在CNE-2R 細胞中表達上調(diào)。特異性miR-150抑制劑具有逆轉(zhuǎn)CNE-2R細胞的輻射抗性作用，而轉(zhuǎn)染miR-150 模擬物可增強CNE- 2細胞的輻射抗性。過表達miR-150可促進鼻咽癌細胞的生長。結(jié)論 miR-150參與了鼻咽癌細胞的放射抵抗，miR-150可能成為一種新的用于合理治療鼻咽癌的治療策略。

關(guān)鍵詞：鼻咽癌；放療抵抗；miR-150

鼻咽癌是一種具有較強局部侵襲力以及早期轉(zhuǎn)移特點的惡性腫瘤。由于其解剖位置特殊且對放射線較為敏感，放射治療是鼻咽癌最重要的治療方法。然而，放療抵抗仍然是鼻咽癌治療中的一大難題[1]。MicroRNA（miRNA）是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，作為一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子廣泛參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程。在多種腫瘤中均伴隨有miRNA表達的失調(diào)，一些miRNA家族顯示出類似癌基因或抑癌基因的功能。研究腫瘤相關(guān)miRNA的切入點一般是通過高通量的芯片篩選。迄今為止，僅有兩個獨立實驗組對鼻咽癌組織進行了miRNA分子差異表達譜分析，分別發(fā)現(xiàn)了9個和35個在鼻咽癌和正常鼻咽上皮中差異表達的miRNA，其中有3個miRNA 分子具有共同變化趨勢：miRNA 29c、miRNA 34b和miRNA 34c。與正常對照鼻咽上皮相比，miRNA-29c在鼻咽癌中下調(diào)3～5倍。目前對miR-150在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的研究尚無人涉足[2]。尤其在鼻咽癌輻射抵抗中所發(fā)揮的作用至今鮮有報道。

本文通過將抗輻射的鼻咽癌細胞株CNE-2R與CNE-2對比發(fā)現(xiàn)，miR-150在CNE-2R中表達上調(diào)，過表達miR-150可抑制鼻咽癌細胞的生長，該研究結(jié)果表明miR-150是評估鼻咽癌放療敏感性的潛在生物標(biāo)志物，將有助于合理制定鼻咽癌治療策略。

1 材料與方法

1.1主要材料 miR-150 模擬物及scramble購自Ambion公司。

1.2建立CNE-2R與細胞培養(yǎng) 建立放射抵抗的鼻咽癌細胞亞系CNE-2R。取指數(shù)生長期的鼻咽癌CNE-2細胞株，予以依次遞增的放療劑量1Gy，2Gy，4Gy，6Gy和8Gy照射，每個劑量至少照射三次，直到細胞增殖到80%再進行下一個劑量的照射，該階段共12個月。

1.3 MTS法檢測細胞增殖活性 采用MTS法檢測細胞增殖，根據(jù)CellTiter 96R〇AQueous單溶液細胞增殖檢測試劑盒（Promega公司）說明書方法對細胞增殖進行檢測。

1.4 Real-timePCR檢測 取適量細胞，提取用試劑盒（OMEGA Bio-Tek）提取純化miRNA，并利用miScript II RT Kit（QIAGEN）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照SYBR Green PCR試劑盒（QIAGEN）說明書進行Real-time PCR。研究miR-150含量時，選取RUN6作為內(nèi)參。提取總RNA，實驗獨立重復(fù)三次。

1.5細胞轉(zhuǎn)染 用胰蛋白酶對細胞進行消化，將細胞計數(shù)并接種在6孔板中，確保在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，70%的細胞匯合。使用Lipofectamine2000（Invitrogen）將濃度均為100nM的miR-150 模擬物，miR-150抑制劑以及相應(yīng)對照物轉(zhuǎn)染至細胞。在轉(zhuǎn)染36h后，進行后續(xù)的實驗。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，當(dāng)P<0.05時，為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-150與CNE-2R細胞放射抗性相關(guān) qRT-PCR檢測結(jié)果顯示miR-150在CNE-2R細胞系中的表達比在CNE-2細胞系中高出。在CNE-2R和CNE-2細胞系中分別進行miR-150過表達與干擾的研究。運用特異性miR-150抑制劑抑制CNE-2R中miR-150的功能以此觀察其生物學(xué)特性，通過MTT分析發(fā)現(xiàn)，加入特異性miR-150抑制劑后，CNE-2R放射敏感性明顯提高。而在對CNE-2細胞轉(zhuǎn)染miR-150 模擬物 之后，CNE-2細胞的放射抗性顯著增加。

2.2過表達miR-150可促進鼻咽癌細胞生長 MTS結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-150組鼻咽癌細胞株CNE2細胞的增殖能力在48h、72h、96h后細胞的增殖能力逐漸增強，與對照組比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。提示外源高表達miR-150表達均能增強鼻咽癌細胞株CNE2細胞的增殖。

3 討論

鼻咽癌系鼻咽部惡性腫瘤，也是我國最常見的癌腫之一，其發(fā)病率有逐年上升的趨勢，嚴(yán)重危害著人民健康。鼻咽癌有明顯的地域和種族分布特征，我國南方及東南亞地區(qū)鼻咽癌發(fā)病率高，歐美地區(qū)則少見，僅占全身惡性腫瘤的1%～2%。鼻咽癌發(fā)病隱秘，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生早，且其發(fā)病機制還不十分清楚，治療效果也不理想，5年生存率仍徘徊在50%左右。因此，尋找鼻咽癌早期診斷的特異性分子標(biāo)志物對于實現(xiàn)鼻咽癌的早期診斷和闡明其發(fā)病機制具有深遠意義。腫瘤的化療和放療抵抗是鼻咽癌臨床治療中的主要障礙。目前，盡管已經(jīng)建立了許多腫瘤化療或放療耐受的細胞模型，且進行了大量的機制研究，但仍然存在許多尚待進一步深入探討的問題。近年來，大量的研究表明miRNA的異常表達在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及放化療耐受中起到了重要的作用。miRNA可作為癌癥的重要潛在的預(yù)后指標(biāo)或治療靶點。例如，miR-200b的表達在耐多西他賽的非小細胞肺癌細胞中顯著下調(diào)[3]，miR-200可通過調(diào)節(jié)膀胱癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程從而逆轉(zhuǎn)膀胱癌對EGFR治療抵抗[4]，并且近期研究發(fā)現(xiàn)，通過在順鉑耐藥舌癌細胞中重新過表達miR-200b和miR-15b能夠減少BMI1表達使該細胞對化療重新敏感[5]。對于鼻咽癌，放射敏感性是鼻咽癌治療成功與否的關(guān)鍵，我們的研究發(fā)現(xiàn)miR-150與CNE-2R細胞放射抗性相關(guān)，且過表達miR-150可促進鼻咽癌細胞的生長，然而關(guān)于miRNA在鼻咽癌放射抗性中的作用仍不清楚，需要更進一步實驗驗證。

參考文獻：

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[2]HC Chen， GH Chen， YH Chen， et al. MicroRNA deregulation and pathway alterations in nasopharyngeal carcinoma[J].British Journal of Cancer， 2009， 100：1002-1011.

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編輯/安樺