破格救心湯對心衰大鼠血小板膜糖蛋白ⅡbⅢa濃度的影響

李煥彬，陳法桂，陳 嘉

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，廣東 廣州 510405）

現(xiàn)代臨床上應(yīng)用破格救心湯治療慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）療效確切，但其作用機(jī)制尚未明確。研究表明，CHF引起血栓形成或血栓栓塞是導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一[1]。血小板聚集是血栓形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而血小板膜糖蛋ⅡbⅢa（GP－ⅡbⅢa）與纖維蛋白原等黏附蛋白結(jié)合，是多種因素引起血小板活化的最終共同通路，與血栓性疾病特別是缺血性心、腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，從而成為血小板活化的標(biāo)志物之一[2]。因此，GP－ⅡbⅢa濃度升高可能明顯增加CHF患者的死亡率。本試驗研究了破格救心湯對CHF大鼠GP－ⅡbⅢa濃度的影響，旨在探討其治療CHF的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性8周齡清潔級SD大鼠36只，體重180g～200g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：4405900082。

1.1.2 藥物 破格救心湯[3]：附子150g、干姜60 g、炙甘草60g、山萸肉120g、生龍骨粉30g、生牡蠣粉30g、活磁石粉30g、高麗參30g（另煎）、麝香0.5g（沖），加水2000mL文火煮取400mL。藥物購自廣州采芝林藥業(yè)。

1.1.3 主要試劑 鹽酸阿霉素，CUSABIO BIOTE CH CO.，LTD，Lot：702012；注射用水，四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號M11031617；大鼠血小板膜糖蛋白ⅡbⅢa ELISA試劑，CUSABIO BIOTE CH CO.，LTD，Lot：W09073328。

1.1.4 主要設(shè)備 心電圖機(jī)，型號CARDIMAX FX－2111，北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司；酶標(biāo)儀，DG5033A型，南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備 采用李玉玲等[4]建立的阿霉素誘導(dǎo)心衰大鼠模型造模法，將注射用的鹽酸阿霉素，用注射用水配制成2mg／mL溶液，按4mg／kg體重，即2mL／kg腹腔注射SD大鼠，每周1次，共6周，累積總量24mg／kg體重。6周后檢測心電圖肢體Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高伴T波高尖即為造模成功[5]。

1.2.2 試驗分組與給藥 36只大鼠自由飲水進(jìn)食，飼養(yǎng)于18℃～25℃明暗各12h的清潔級動物實驗室內(nèi)，喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組?？瞻捉M：造模時按2mL／kg體重腹腔注射注射用水，每周1次，共6周，累積總量24mg／kg體重，造模6周后，每天2次灌胃飲用水10mL／kg；模型組：造模6周后，每天2次灌胃飲用水10mL／kg；破格救心湯組：造模6周后，每天2次灌胃破格救心湯10mL／kg。每組給藥連續(xù)6周。

1.2.3 指標(biāo)檢測 采用ELISA試劑盒進(jìn)行GP－ⅡbⅢa濃度的測定。

1.2.4 GP－ⅡbⅢa樣品及其標(biāo)準(zhǔn)品的制備 制備GP－ⅡbⅢa樣品：在試驗開始后第6周末將全部動物經(jīng)眼眶靜脈采血，全血樣本于室溫放置2h后于3000r／min離心10min，取上層澄清液作為GP－ⅡbⅢa樣品。制備GP－ⅡbⅢa標(biāo)準(zhǔn)品：取2份GP－ⅡbⅢa樣品以樣品稀釋液稀釋至1mL，蓋好后靜置15min后，反復(fù)顛倒、搓動以助溶解，其濃度為400ng／mL，分別稀釋至200，100，50，25，12.5，6.25 ng／mL，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0ng／mL。

1.2.5 GP－ⅡbⅢa樣品及其標(biāo)準(zhǔn)品的加樣與顯色酶標(biāo)板設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔，分別對應(yīng)加樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品各100μL，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板蓋上覆膜，37℃反應(yīng)120min；棄去液體，甩干后每孔加新配制的生物素化抗GP－ⅡbⅢa抗體工作液100μL，37℃溫育60min；棄去液體，甩干后洗板3次；甩干后每孔加HRP標(biāo)記的親和素工作液100μL，操作步驟同抗GP－ⅡbⅢa抗體工作液；甩干后每孔加TMB溶液90μL，37℃避光顯色約25min，立即每孔加1mol／L H2SO4終止液50μL終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。

1.2.6 GP－ⅡbⅢa濃度的檢測 在加終止液后立即用酶標(biāo)儀在450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。本試驗均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2.7 GP－ⅡbⅢa濃度計算方法 根據(jù)一系列標(biāo)準(zhǔn)品的濃度以及相對應(yīng)的OD 450nm通過CurveExpert1.3軟件分析得到其二次方程式為：y＝8.7402469＋9.729678x＋50.013467x2（其中x為OD 450nm值，y為GP－ⅡbⅢa標(biāo)準(zhǔn)品的濃度）。將樣品的OD 450nm值代入方程式，計算出樣品濃度。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)結(jié)果以“ˉx±SD”表示，2組間比較用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠死亡情況和一般情況觀察

模型組死亡4只，破格救心湯組和空白組無死亡。模型組大鼠造模后出現(xiàn)鼻唇紫紺、四肢末梢蒼白、被毛粗糙變黃、腹部脫毛、反應(yīng)遲鈍、進(jìn)食減少、行動緩慢等心衰癥狀。與模型組比較，破格救心湯組大鼠心衰癥狀明顯減輕，毛色白而具有光澤，反應(yīng)靈敏，進(jìn)食增多，活動度加強(qiáng)。

2.2 各組大鼠GP－ⅡbⅢa濃度結(jié)果分析

與空白組比較，模型組大鼠GP－ⅡbⅢa濃度顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，破格救心湯組心衰大鼠GP－ⅡbⅢa濃度顯著降低（P＜0.01）；與空白組比較，破格救心湯組大鼠GP－ⅡbⅢa濃度稍高，但差異不顯著（P＞0.05）（表1）。

3 討論

CHF屬于中醫(yī)的心悸、怔忡、咳喘、水腫、胸痹、積聚、虛勞等病證的范疇，陽氣虧虛、血瘀水停為其主要病機(jī)，益氣溫陽、活血利水為其有效治法[6]。破格救心湯經(jīng)40年臨床驗證，其治療CHF療效確切。組方中附子回陽救逆；干姜和附子則“甘與辛合而生陽”，又牽制附子之毒；炙甘草既有扶正作用又能制附子之毒；山茱萸助附子固守已復(fù)之陽，挽五臟氣血之脫失，加強(qiáng)了此方扶正固脫，活血化淤的力量；高麗參大補(bǔ)元?dú)?，滋陰和陽；龍骨、牡蠣固腎攝精，收斂元?dú)?；磁石?zhèn)驚安神，納氣平喘；麝香開竅醒神，活血散結(jié)。諸藥相配，可助元陽固，陰陽和，開中有補(bǔ)。該方注重整體，增強(qiáng)了仲景四逆湯類方的回陽救逆功效，這對進(jìn)一步穩(wěn)定生命體征、救治心衰等起到了重要作用[7]。

表1 各組大鼠GP－ⅡbⅢa濃度Table1 The GP－IIbIIIa concentrations in the rats of each group

研究表明，CHF患者血栓栓塞性疾病的發(fā)生率明顯升高，增加了CHF患者的死亡率。血栓形成和血栓栓塞的發(fā)生與血小板活化聚集密切相關(guān)。血小板聚集由血小板GP－ⅡbⅢa受體所調(diào)節(jié)，激活的GP－ⅡbⅢa受體主要結(jié)合纖維蛋白原，纖維蛋白原分子在相鄰的血小板之間形成橫橋，構(gòu)成血小板骨架，這是血小板聚集的關(guān)鍵[8]。因此，GP－ⅡbⅢa濃度是血小板活化程度的重要標(biāo)志，檢測GP－ⅡbⅢa濃度的變化可以判斷冠脈缺血患者體內(nèi)血小板活化情況。同時，GP－ⅡbⅢa受體頡頏劑運(yùn)用于抗血小板治療有確切療效[9－10]。由此可見，在心力衰竭的治療中，降低GP－ⅡbⅢa濃度，減少血栓栓塞性疾病的發(fā)生率，從而降低CHF患者的死亡率，可能是新的治療途徑。

試驗結(jié)果顯示，心衰大鼠用破格救心湯灌胃治療后心衰癥狀明顯減輕，且未出現(xiàn)死亡，說明其治療心衰大鼠有效。采用酶聯(lián)免疫分析法，分析了其對心衰大鼠GP－ⅡbⅢa濃度的影響。結(jié)果顯示，模型組大鼠GP－ⅡbⅢa濃度較空白組顯著升高，表明破格救心湯能明顯降低心衰大鼠GP－ⅡbⅢa濃度至接近空白組水平。說明造模后心衰大鼠血小板明顯活化，發(fā)生其凝集作用；予以破格救心湯治療后，大鼠血小板凝集作用明顯受到抑制。說明破格救心湯治療心衰大鼠的作用機(jī)制可能與其對GP－ⅡbⅢa濃度的影響有關(guān)。

綜上所述，破格救心湯能降低心衰大鼠GP－ⅡbⅢa濃度，減少血栓栓塞性疾病的發(fā)生率，這可能是其治療CHF的作用機(jī)制之一。

[1]李志斌，買買提·阿不都熱依木.慢性心力衰竭與血栓栓塞的研究現(xiàn)狀[J].心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2010，19（1）：110－112.

[2]王振華，薛 梅，殷惠軍，等.血小板膜GP－ⅡbⅢa活性與缺血性心腦血管疾病[J].中國臨床康復(fù)，2006，48（10）：142－144.

[3]李 可.李可老中醫(yī)急危重癥疑難病經(jīng)驗專輯 [M].2版.山西太原：山西科學(xué)技術(shù)出版社，2004：1－17.

[4]李玉玲，楊建業(yè)，唐俊明，等.阿霉素誘導(dǎo)大鼠心衰模型不同方案的比較[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2006，16（2）：93－96.

[5]梁逸強(qiáng)，陳遠(yuǎn)平.破格救心湯對心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，15（6）：716－717.

[6]翟卷平，郭秋紅，王 卓，等.葶藶生脈方對心衰大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響[J].河北中醫(yī)藥學(xué)報，2010，25（3）：5－6.

[7]吳錦波，曾 勇.破格救心湯救治過敏性休克合并急性心力衰竭1例[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，20（2）：106－107.

[8]阮長耿.血小板與血栓性疾病[J].醫(yī)學(xué)研究通訊，2004，33（7）：7－10.

[9]李迎雪，孫 強(qiáng)，靖博彬，等.新型血小板GPⅡb／Ⅲa受體拮抗劑Z4A5抗血小板作用的研究[J].中國藥理學(xué)通報，2012，28（2）：227－230.

[10]李仲培.血小板GPⅡb／Ⅲa受體拮抗劑臨床應(yīng)用觀察[J].現(xiàn)代醫(yī)院，2010，10（2）：42－43.