自噬研究的新動(dòng)向—自噬流

摘要：自噬是目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一，廣泛參與各種生理和病理過(guò)程。既往對(duì)自噬的研究多以自噬體的多少評(píng)價(jià)自噬水平的強(qiáng)弱，新近發(fā)現(xiàn)自噬體的增加并不能從本質(zhì)上反映自噬的水平，僅僅能夠反映自噬的誘導(dǎo)，或者自噬體清除的抑制。因?yàn)閺淖允闪鞯慕嵌葋?lái)看，自噬體的數(shù)量受形成和清除兩方面影響，準(zhǔn)確全面地評(píng)估自噬不僅包括自噬體的檢測(cè)，還包括動(dòng)態(tài)觀察整個(gè)自噬流的過(guò)程是否通暢。我們提倡結(jié)合使用多種自噬檢測(cè)方法以獲取可靠數(shù)據(jù)，將動(dòng)態(tài)和靜態(tài)檢測(cè)方法結(jié)合，更能有效說(shuō)明細(xì)胞自噬的發(fā)生以及自噬流的變化。

關(guān)鍵詞：自噬；自噬流；透射電子顯微鏡

New Trends in Autophagy Research-Autophagy Flow

MA Pei-ze1，SUN Zheng-xin2，JIANG Yue-hua3

（1.Weihai Hospital of Traditional Chinese Medicine，Weihai 264200，Shandong，China；2.Maternal and child health care hospital of Huancui District，Weihai 264200，Shandong，China；3.Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250001，Shandong，China）

Abstract：Autophagy is one of the hot topics in biomedical research.Which is widely involved in various physiological and pathological processes.Previous studies on autophagy have evaluated the level of autophagosome，and recently found that the increase of autophagosome can not reflect the level of autophagy in nature.It can only reflect the induction of autophagy and the inhibition of autophagosome.From the point of autophagy flux，the number of the autophagosome is affected by the formation and removal of the two aspects，accurate and comprehensive assessment of autophagy not only includes the detection of the body，but also includes the dynamic observation of the entire flux ofautophagy is smooth.We promote the combination of dynamic and static detection methods to obtain reliable data，which can effectively explain the occurrence of autophagy and the changes of autophagy flux.

Key words：Autophagy；autophagy flux；Transmission electron microscope

目前，細(xì)胞自噬已經(jīng)成為繼凋亡之后生物醫(yī)學(xué)最熱門(mén)的研究領(lǐng)域之一，越來(lái)越多的研究表明自噬可能與心血管疾病、腫瘤以及神經(jīng)退行性變等多種病理生理過(guò)程密切相關(guān)[1]。隨著研究的深入對(duì)自噬的檢測(cè)也提出了更高的要求，許多學(xué)者，尤其是剛剛進(jìn)入這一領(lǐng)域的研究者們迫切想要掌握研究自噬的關(guān)鍵是什么，遺憾的是在自噬的研究過(guò)程當(dāng)中，并沒(méi)有一個(gè)絕對(duì)的研究準(zhǔn)則適于所有的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容供學(xué)者遵循，因?yàn)橛行┏Ｓ米允蓹z測(cè)方法在某些細(xì)胞、組織或器官中并不合適，甚至是存在問(wèn)題的[2-5]。這就需要我們重新認(rèn)識(shí)自噬，找到客觀的方法評(píng)價(jià)自噬。

自噬是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)、多步驟的生物過(guò)程，在許多環(huán)節(jié)可以被調(diào)控，大致可以分為四個(gè)部分：自噬膜（sequestering phagophore）、自噬體（autophagosome）、自噬內(nèi)涵體（amphisome）以及自噬溶酶體（autolysosome），其中自噬體與內(nèi)涵體結(jié)合形成自噬內(nèi)涵體，自噬內(nèi)涵體或自噬體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體[6-8]?，F(xiàn)有的大部分文獻(xiàn)都是通過(guò)檢測(cè)自噬體的數(shù)量來(lái)評(píng)價(jià)自噬水平，基于上述流程我們可以發(fā)現(xiàn)通過(guò)電鏡等手段檢測(cè)到的自噬體的積累，既可以反映自噬的誘導(dǎo)，也可以反映自噬體的消耗減少，例如，內(nèi)涵體或溶酶體低效率的融合，影響到整個(gè)底物運(yùn)輸過(guò)程，會(huì)抑制自噬體向自噬內(nèi)涵體或自噬溶酶體的成熟轉(zhuǎn)化，當(dāng)然自噬底物降解速率的減慢也會(huì)導(dǎo)致整個(gè)自噬流程的減弱，從而出現(xiàn)自噬體的蓄積。如何正確評(píng)價(jià)自噬情況就需要我們區(qū)分通常情況下自噬體短暫的蓄積是因?yàn)檎T導(dǎo)導(dǎo)致的，還是自噬完成的效率低下導(dǎo)致的。既要靜態(tài)檢測(cè)自噬體水平，也需要我們動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)自噬底物來(lái)證實(shí)底物到達(dá)了溶酶體，并且在合適的時(shí)間被降解，以及自噬對(duì)細(xì)胞成分降解率的變化。這就提出了一個(gè)新的概念—自噬流，自噬流的含義包含了整個(gè)自噬過(guò)程，包括了自噬結(jié)構(gòu)的形成，底物向溶酶體的運(yùn)送（通過(guò)溶酶體與自噬體或者自噬內(nèi)涵體的融合），以及底物的降解和大分子物質(zhì)釋放回細(xì)胞質(zhì)的整個(gè)流程。本文就有關(guān)自噬流的檢測(cè)做一簡(jiǎn)單介紹，并對(duì)各種檢測(cè)方法作出評(píng)價(jià)。

1 透射電子顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察

透射電子顯微鏡是從形態(tài)學(xué)上觀察自噬現(xiàn)象最直接，最經(jīng)典的方法，可以用于監(jiān)測(cè)選擇性和非選擇性自噬，能夠定性定量檢測(cè)自噬過(guò)程中各種結(jié)構(gòu)，包括吞噬泡、自噬體、自噬內(nèi)涵體，自噬溶酶體等，細(xì)胞質(zhì)的降解區(qū)域被吞噬泡隔離開(kāi)，吞噬泡進(jìn)而轉(zhuǎn)化成自噬體，自噬體是自噬的形態(tài)學(xué)特征，具有雙層膜結(jié)構(gòu)，包含著形態(tài)完整的細(xì)胞器。雖然電鏡是檢測(cè)自噬應(yīng)用最廣泛的方法，但同時(shí)也是最容易出問(wèn)題的，主要是方法的問(wèn)題：①選擇被檢測(cè)的標(biāo)本是電鏡檢測(cè)自噬成功的關(guān)鍵。固定體外組織相對(duì)直接一些，但是要注意固定標(biāo)本時(shí)去掉沒(méi)有意義沒(méi)有價(jià)值的部分；②雙層膜并不是自噬體的超微結(jié)構(gòu)標(biāo)志，線粒體也是含雙層界膜的細(xì)胞器，破壞的線粒體形態(tài)學(xué)與自噬體相似，但線粒體內(nèi)膜有折瘠，而自噬體內(nèi)膜不會(huì)折瘠；③有些情況下需要對(duì)電鏡圖像進(jìn)行斷層重建，進(jìn)一步確定自噬結(jié)構(gòu)是球形的，以免和其他在薄層外觀上相類(lèi)似的結(jié)構(gòu)混淆，比如含有沉淀物的線粒體；④分析一個(gè)細(xì)胞單個(gè)層面的時(shí)候容易被誤導(dǎo)或者難以分析自噬結(jié)構(gòu)，如果有足夠的結(jié)構(gòu)分辨率便能夠解決上述問(wèn)題，而聚焦離子束/掃描雙束電子顯微鏡能夠更加簡(jiǎn)易的進(jìn)行三維分析。另外被證明能夠有效分析自噬中復(fù)雜膜結(jié)構(gòu)的技術(shù)方法還包括三維電子斷層掃描、冷凍電子顯微鏡、關(guān)聯(lián)光電顯微鏡等（CLEM）對(duì)于確認(rèn)自噬體很有幫助。

電鏡雖然是檢測(cè)自噬的金標(biāo)準(zhǔn)，但是應(yīng)用電鏡時(shí)必須非常嚴(yán)格操作避免偏倚，同時(shí)我們推薦靜態(tài)的電鏡圖像配合串聯(lián)mRFP-GFP-LC3有助于分析自噬流以及降解物的結(jié)構(gòu)。采用動(dòng)態(tài)觀察的方法，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集數(shù)據(jù)更能反映自噬流的真實(shí)情況。

2 熒光顯微鏡下采用融合蛋白示蹤自噬

由于電鏡耗時(shí)長(zhǎng)，不利于監(jiān)測(cè)自噬流，新近利用LC3在自噬形成過(guò)程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開(kāi)發(fā)出了GFP-LC3指示技術(shù)：無(wú)自噬時(shí)，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時(shí)，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體，可以通過(guò)計(jì)數(shù)評(píng)價(jià)自噬活性的高低，但無(wú)法反映自噬體呈遞至溶酶體的過(guò)程來(lái)從形態(tài)學(xué)上觀察自噬流。而mRFP-GFP-LC3串聯(lián)熒光蛋白腺病毒通過(guò)瞬時(shí)高效感染細(xì)胞，配合活細(xì)胞工作站能夠做到實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)自噬流，GFP和mRFP用于標(biāo)記及追蹤LC3，GFP的減弱可指示溶酶體與自噬體的融合形成自噬溶酶體。由于腺病毒載體感染效率高，很多細(xì)胞都能達(dá)到近99%，純化后的腺病毒可以直接進(jìn)行動(dòng)物活體注射。另外LC3持續(xù)表達(dá)可能會(huì)影響細(xì)胞正常功能，因此腺病毒這種不整合基因組的載體更適合作為一種工具型病毒載體。這種串聯(lián)的熒光蛋白表達(dá)載體系統(tǒng)直觀清晰的指示了細(xì)胞自噬流水平，是自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利器。

3 Western-blotting檢測(cè)自噬底物的降解

通過(guò)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)部長(zhǎng)壽蛋白的降解，或者通過(guò)Western-blotting確定降解底物含量的減少，均可用于佐證自噬的完成。起初自噬所降解的底物被認(rèn)為是隨機(jī)的，但是后來(lái)的研究表明有些蛋白是選擇性降解的，在這些蛋白之中研究最為透徹的是蛋白P62，最近已經(jīng)認(rèn)為可以通過(guò)自噬特異性被降解，主要通過(guò)Western blotting方法檢測(cè)P62蛋白水平的表達(dá)，一般情況下，P62蛋白水平的高低與自噬的活性成反比，P62的增加提示自噬/溶酶體降解途徑被抑制，因此其表達(dá)量的變化也可用于監(jiān)測(cè)自噬流。但是單純依靠自噬底物蛋白的降解很難斷定自噬的發(fā)生，因?yàn)樽允傻孜锏牡鞍淄鶇⑴c細(xì)胞內(nèi)部其他的信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，此種蛋白可能通過(guò)其他的信號(hào)通路降解。更為準(zhǔn)確的方法是，通過(guò)電鏡或檢測(cè)LC3-Ⅱ/Ⅰ，判斷自噬的發(fā)生，并配合自噬調(diào)節(jié)劑如3-甲基腺嘌呤，如果能夠抑制自噬底物降解，則說(shuō)明整個(gè)自噬流的發(fā)生。

4 自噬流的人為干預(yù)

通過(guò)人為干預(yù)來(lái)促進(jìn)或者抑制自噬功能后觀察細(xì)胞行為或效應(yīng)分子的變化能夠使研究結(jié)論更具有說(shuō)服力。目前認(rèn)為促進(jìn)或者抑制自噬的方法有藥物處理、自噬基因敲除或過(guò)表達(dá)等。

在自噬過(guò)程中，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt/mTOR信號(hào)通路發(fā)揮主要作用，而PI3K是該通路的關(guān)鍵分子。根據(jù)底物特異性，PI3K又可以分為3類(lèi)，Ⅰ類(lèi)PI3K作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)自噬發(fā)生的不同階段起抑制自噬的作用，Ⅲ類(lèi)PI3K在自噬發(fā)生過(guò)程中起主要作用，通過(guò)磷酸化磷脂酰肌醇形成3-磷酸磷脂酰肌醇，從而促進(jìn)自噬的發(fā)生，而Ⅱ類(lèi)PI3K與自噬的關(guān)系至今知之甚少。根據(jù)調(diào)控通路，可以將自噬調(diào)控劑分為：①PI3K抑制劑包括3-甲基腺嘌呤（3-MA）、渥曼青霉素和LY294002。其中應(yīng)用最多的3-MA主要是通過(guò)抑制Ⅲ類(lèi)PI3K活性，阻斷3-磷酸磷脂酰肌醇的產(chǎn)生，影響自噬體的起始和成熟，從而抑制自噬的發(fā)生；②雷帕霉素靶蛋白抑制劑，mTOR作為自噬啟動(dòng)階段的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，活化后可抑制自噬的發(fā)生，其抑制劑包括雷帕霉素，雷帕霉素衍生物，AZD805，Torin1，PP242，WAY600等；③肌醇單磷酸酶抑制劑，包括氯化鋰、卡馬西平等；④氯喹與羥氯喹作為一類(lèi)常用的自噬抑制劑，其抑制自噬的機(jī)制主要是通過(guò)改變?nèi)苊阁w的pH值，影響溶酶體對(duì)底物的降解，同時(shí)阻斷自噬體與溶酶體的融合從而影響自噬流。另外通過(guò)RNAi干擾自噬相關(guān)基因的表達(dá)后，細(xì)胞表現(xiàn)為自噬功能缺失。我們提倡人為干預(yù)自噬與多種自噬檢測(cè)方法結(jié)合使用以獲取可靠數(shù)據(jù)，將動(dòng)態(tài)和靜態(tài)檢測(cè)方法結(jié)合，更能有效說(shuō)明細(xì)胞自噬的發(fā)生以及自噬流的變化。

5 討論

自20世紀(jì)50年代，細(xì)胞自噬研究的先行者ChristiandeDuve運(yùn)用電子顯微鏡技術(shù)觀察到自噬泡的存在，到Science認(rèn)為細(xì)胞自噬為科技領(lǐng)域六大研究方向之一，自噬已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)最熱門(mén)的研究領(lǐng)域之一，特別是過(guò)去的10年見(jiàn)證了自噬研究的飛速發(fā)展。越來(lái)越多的研究表明自噬可能在多種疾病過(guò)程發(fā)揮重要作用，但既往的諸多研究卻發(fā)現(xiàn)自噬在某些生物學(xué)過(guò)程中的利弊一直沒(méi)有定論，我們分析其關(guān)鍵原因之一是自噬的評(píng)價(jià)方法不當(dāng)。既往研究多以自噬體的多少評(píng)價(jià)自噬水平的強(qiáng)弱，然而Atg8/LC3水平的增加，或者甚至是自噬體的出現(xiàn)，這些并不能從本質(zhì)上反映自噬的強(qiáng)弱，僅僅能夠反映自噬的誘導(dǎo)，或者是自噬體、自噬內(nèi)涵體清除的抑制。因?yàn)閺淖允闪鞯慕嵌葋?lái)看，自噬體的數(shù)量受形成和清除兩方面影響。既往多認(rèn)為自噬體增多是自噬過(guò)度導(dǎo)致生成過(guò)多所造成，而新近研究表明自噬體的蓄積多是自噬清除功能障礙所致，如何干預(yù)自噬體的清除及底物的降解可能成為今后的研究熱點(diǎn)和新藥開(kāi)發(fā)方向。

另外，從自噬特點(diǎn)中可以看出，自噬一旦啟動(dòng)，必須在度過(guò)危機(jī)后適時(shí)停止，否則，其非特異性捕獲胞漿成分的特性將導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆的損傷。這也提醒我們?cè)谘芯孔允蓵r(shí)一定要?jiǎng)討B(tài)觀察，任何橫斷面的研究結(jié)果都不足以評(píng)價(jià)自噬的活性。目前，已經(jīng)報(bào)道了很多因素能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，如饑餓、生長(zhǎng)因子缺乏、微生物感染、細(xì)胞器損傷、蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤或聚集、DNA損傷、放療、化療等等，這些刺激信號(hào)如何傳遞、哪些自噬蛋白接受信號(hào)、又有哪些自噬蛋白去執(zhí)行等很多問(wèn)題還有待進(jìn)一步解答。

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編輯/蔡睿琳