探討MSCs作為攜帶PEDF基因載體的可行性研究

摘要：目的 本研究采用重組色素上皮源性因子腺病毒（Ad-PEDF）轉(zhuǎn)染小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）后，評估MSCs作為攜帶PEDF基因載體的可行性。方法 Ad-PEDF在HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增，并純化后。將其轉(zhuǎn)染入MSCs（MSCs-PEDF），用Western Blot和ELISA檢測培養(yǎng)上清液中PEDF的表達(dá)。結(jié)果 用Western Blot檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的PEDF為陽性表達(dá)。ELISA檢測培養(yǎng)上清中PEDF濃度為78.8±4.8 ng/ml。結(jié)論 MSCs可以作為使用PEDF基因治療腫瘤的載體。

關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；色素上皮衍生因子；基因治療；抗血管生成

血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的必要條件[1]，因此，抗血管生成治療是腫瘤治療的一個重要部分。色素上皮衍生因子（PEDF）是已知最強(qiáng)的內(nèi)源性血管生成抑制因子，可通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及誘導(dǎo)其凋亡來發(fā)揮其抗血管生成作用[2]。重組PEDF蛋白以及病毒載體介導(dǎo)的PEDF基因治療已應(yīng)用于多個實(shí)驗研究，并顯示出治療前景[4]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）作為一種新穎、有效的靶向腫瘤細(xì)胞的載體可能為提高PEDF的治療效果提供一種新的策略[3]。本研究擬通過重組色素上皮源性因子腺病毒（Ad-PEDF）轉(zhuǎn)染小鼠MSCs后，從而評估MSCs作為腫瘤基因治療的載體的可行性。

1 資料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

1.1.1 293細(xì)胞的培養(yǎng) 將293細(xì)胞置于含有10%FBS及100U/ml阿米卡星的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2， 95%濕度條件下的孵箱中培養(yǎng)，以 0.25% 的胰蛋白酶消化，一般2～3d傳代一次。

1.1.2人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的分離及培養(yǎng) 取產(chǎn)后新鮮臍帶15～20cm，用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端注入0.1%的膠原酶消化。將收集的消化液體離心（1500轉(zhuǎn)/min）3min。接種于培養(yǎng)瓶中，置于孵箱中培養(yǎng)。

1.1.3小鼠MSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定取。6～8周齡C57BL/6雌性小鼠，處死后在無菌條件下取股骨和脛骨，離心后用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種于方瓶中，置于孵箱中培養(yǎng)。

1.2 PEDF重組腺病毒載體（Ad-PEDF）的擴(kuò)增與純化

1.2.1 Ad-PEDF的擴(kuò)增 將293細(xì)胞傳代培養(yǎng)，當(dāng)其密度達(dá)到90%時，加入適量病毒上清感染細(xì)胞。約2～3d后出現(xiàn)細(xì)胞病變，待細(xì)胞幾乎變圓，且有一半細(xì)胞漂浮時，收集細(xì)胞上清液至離心管中，3000轉(zhuǎn)/min，4℃，離心10min，將上清液用0.45μm濾器過濾，保存于-80℃。

1.2.2病毒純化 使用Vira TrapTM Adenovirus Purification Maxiprep Kit 純化病毒（具體步驟見說明書）。

1.2.3病毒滴度測定（TCID50法） 將293細(xì)胞以1×104個/孔接種于96孔板中，將病毒液按對數(shù)級稀釋（10-5～10-10），每個濃度設(shè)置10個復(fù)孔，連續(xù)觀察10d后記錄每個稀釋度出現(xiàn)CPE（致細(xì)胞病變效應(yīng)）的孔數(shù)，計算細(xì)胞病變率。如果某一濃度各孔細(xì)胞全部病變，比率為1，如無細(xì)胞病變，則比率為0。

1.3重組腺病毒體外感染MSCs 加入含有適量 Ad-PEDF 重組腺病毒低糖DMEM，感染復(fù)數(shù)（MOI）=1500，搖勻，置于孵育箱中培養(yǎng)4h后換液，48h后收集感染后MSCs。

1.4檢測 MSCs-PEDF 中 PEDF蛋白的體外表達(dá)

1.4.1樣品制備 加入Ad-PEDF的MSCs作為對照。收集各組的培養(yǎng)液上清，采用Western blot 體外表達(dá)的PEDF蛋白進(jìn)行鑒定分析，采用ELISA測定培養(yǎng)上清中PEDF濃度，分別測定三組培養(yǎng)上清中的PEDF濃度。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實(shí)驗所得數(shù)據(jù)采用（x±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA）；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的分離培養(yǎng)和鑒定 MSCs的原代培養(yǎng)：原代細(xì)胞生長較慢，2w左右可長滿瓶底，傳代后細(xì)胞生長速度則明顯加快，可得到較高純度的MSCs。傳代3次后，細(xì)胞形態(tài)較為一致，呈長梭形，多為平行排列生長或漩渦狀生長。

2.2重組腺病毒驗證及滴度測定 DNA電泳顯示Ad-PEDF泳道在1200～1500bp之間出現(xiàn)一單一條帶。說明擴(kuò)增的腺病毒含有PEDF基因。

2.3 Ad-PEDF轉(zhuǎn)染MSCs后重組PEDF的體外表達(dá)檢測 轉(zhuǎn)染了Ad-PEDF的MSCs（MSCs-PEDF）細(xì)胞裂解液及培養(yǎng)液上清在50KD處均出現(xiàn)一明顯條帶，說明MSCs-PEDF可表達(dá)重組PEDF并分泌至細(xì)胞外。ELISA檢測結(jié)果表明，MSCs-PEDF培養(yǎng)上清中的PEDF濃度可78.8ng/ml，而MSCs-LacZ及MSCs則僅微量表達(dá)。

3 討論

在本研究中，我們通過體外實(shí)驗證明了攜帶有PEDF基因的MSCs在細(xì)胞裂解液及培養(yǎng)液中陽性表達(dá)PEDF。腫瘤進(jìn)展依賴于新的血管網(wǎng)的生成以供給其營養(yǎng)[7]。血管生成在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中都發(fā)揮著重要作用。如果能有效地阻止腫瘤的血管生成，就有望控制手術(shù)或放、化療治療后腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

PEDF最初是從胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中分離得到，而近年來，人們發(fā)現(xiàn)它有著強(qiáng)有力的抗血管生成活性[4]。PEDF可通過以下機(jī)制來實(shí)現(xiàn)其對血管生成的抑制作用：①抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移以及形成小管；②通過Fas/FasL通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；③下調(diào)促血管生成因子特別是VEGF的表達(dá)，從而打破促血管生成因子和抗血管生成因子之間的平衡[5]。以上的生理特性，奠定了PEDF應(yīng)用于腫瘤治療的基礎(chǔ)。目前，已有大量的實(shí)驗研究顯示，PEDF可顯著抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。純化的重組蛋白在體內(nèi)易于降解，純化困難，價格較昂貴。而以病毒或非病毒為載體的基因治療難以在腫瘤組織內(nèi)達(dá)到較高的治療濃度。這些缺點(diǎn)大大降低了它們潛在的治療效果和應(yīng)用價值。因此，如何將PEDF基因有效地運(yùn)送到腫瘤部位，并使其在局部持續(xù)表達(dá)是本實(shí)驗今后的研究重點(diǎn)。

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編輯/蔡睿琳