阿托伐他汀鈣抑制Ang Ⅱ上調(diào)HUVCs誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)并增加NO的生成

摘要：目的 觀察阿托伐他汀鈣對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）及一氧化氮（nitric oxide，NO）生成的影響，討論二者之間的關(guān)系和可能機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)HUVECs，用102030 阿托伐他汀鈣預(yù)處理HUVECs 24 h， 再與10-7 mol/L AngⅡ共同孵育12 h；通過(guò) RT-PCR 和 Western Blot 分別檢測(cè)iNOS mRNA 和蛋白表達(dá)水平；通過(guò)Griees 反應(yīng)測(cè)定上清NO 釋放量。結(jié)果 與無(wú)刺激組比較，10-7 mol/L AngⅡ刺激HUVECs 12 h后明顯上調(diào)iNOS mRNA 及蛋白表達(dá)，P<0.001； 基礎(chǔ)狀態(tài)下HUVECs 不表達(dá)iNOS（無(wú)論mRNA 還是蛋白），10-7 mol/L AngⅡ刺激8 h后明顯增加iNOS mRNA 和蛋白表達(dá)（與對(duì)照組相比，P<0.001）；不同濃度（10、20、30 μmol/L）阿托伐他汀鈣預(yù)處理24 h 明顯抑制AngⅡ?qū)UVECs iNOS mRNA及其蛋白表達(dá)的上調(diào)作用（與 AngⅡ組相比，P<0.001，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但阿托伐他汀鈣不同濃度組間比較P>0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。與無(wú)刺激組比較10-7 mol/L AngⅡ明顯減少NO 的釋放，P<0.001，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與 AngⅡ組比較，阿托伐他汀鈣干預(yù)24 h 后呈濃度趨勢(shì)增加NO 的釋放，P<0.001，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 阿托伐他汀鈣呈濃度效應(yīng)抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HUVECs 表達(dá)iNOS， 并呈濃度趨勢(shì)增加內(nèi)皮NO的釋放。

關(guān)鍵詞：阿托伐他汀鈣；AngⅡ；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）；一氧化氮合酶（iNOS）；一氧化氮（NO）

Atorvastatin Calcium Inhibits Ang II to up Regulate the Expression of HUVCs Inducible Nitric Oxide Synthase and Increase the Production of NO

DING Yue-xia，ZHANG Ming-hua，WANG Chong-chong，DAI Shu-jing，LIN Li-rong

（Internal Medicine-Cardiovascular Department，The Fifth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510700，Guangdong，China）

Abstract：Objective 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme a （HMG-CoA） reductase inhibitors（atorvastatin） reduce lesion formation in animal models of atherosclerosis by mechanisms that have not been defined completely. We hypothesized that atorvastatin inhabit the expression of inducible nitric oxide release（iNOS） stimulated by AngⅡ to protect the vascular wall which may be related to the enhancement on expression of endothelial nitric oxide synthase（eNOS）.Methods Human umbilical vein was isolated and culcured passage 3～5 of cultured HUVECs were preincubated for 24 h with Cig（0.1 mol/L，1 mol/L，10 mol/L，100 mol/L），then incubated with10-7mol/L AngⅡfor 12 h. Total RNA was extracted， and eNOS expression both mRNA and protein was assessed by RT- PCR and Western Blot. NO production was measured via griess reaction. Results Atorvastatin markedly enhanced the expression of AngⅡ- induced iNOS （P<0.01， P<0.001） ， both mRNA and protein level， and stimulated NO release from human umbilical vein endothelial cells activated by AngiotensinⅡ （0.1M ， atorvastatin 10M ， 20M ， 30M P<0.001） . Conclusion Taken together， these findings demonstrate that atorvastatin could decreased the expression of iNOS induced by AngⅡ， and stimulated NO release from HUVECs， which maybe correlate to a transcriptional mechanism of eNOS expression.

Key words：Atorvastatin calcium； Ang II； Human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）； Nitric oxide synthase （iNOS）；Nitric oxide （NO）

阿托伐他鈣（Atorvastatin，Ato）屬于屬3-羥基3-甲基戊二酰赴美A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，是一種新型強(qiáng)化降脂藥，已經(jīng)廣泛用于動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病以及高脂血癥等臨床治療。但有關(guān)靜脈內(nèi)皮受損、動(dòng)靜脈造瘺、靜脈血栓形成等病理生理改變中，他汀類藥物是否具有同樣的保護(hù)作用，目前研究甚少。我們?cè)谇捌谘芯康幕A(chǔ)上，使用不同濃度的阿托伐他汀鈣預(yù)處理體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），以觀察該藥對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的HUVCs iNOS表達(dá)及NO生成的影響，從而為靜脈血栓性疾病提供新的藥物保護(hù)作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 健康產(chǎn)婦正常分娩新生兒臍帶，標(biāo)本取自廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院婦產(chǎn)科。內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶等細(xì)胞培養(yǎng)以及AngⅡ、Western Blot所需的化學(xué)試劑均購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；特級(jí)胎牛血清為美國(guó) Hyclon 公司產(chǎn)品；Trizol 試劑、RT- PCR 兩步法試劑盒購(gòu)自 Invitrogen 公司；鼠抗人 iNOS 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó) Bio Lab 公司；NO 測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程公司；Western Blot 試劑盒（ 含堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗）自 Promega 公司；PVDF 膜、預(yù)染SDS-PAGE 低分子量 Marker 及發(fā)光 Marker、感光片購(gòu)自美國(guó)Biorad 公司。BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó) Pierce公司；脫脂奶粉購(gòu)自紐西蘭安怡；阿托伐他汀鈣由輝瑞公司惠贈(zèng)。

1.2方法

1.2.1原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)、傳代、鑒定及分組[1] 細(xì)胞分組：①無(wú)刺激組，除培養(yǎng)液（含10%FBS）外不加任何處理；②AngⅡ組：AngⅡ（0.1 μM）與 HUVECs共孵育12 h。③阿托伐他汀鈣+AngⅡ組：先用阿托伐他汀鈣（10 μM、20 μM、30 μM）處理細(xì)胞 24 h，再與0.1 μM AngⅡ一起孵育 12 h。各組細(xì)胞以（2～3）×105個(gè)/ml接種至6孔板（每組6孔），待細(xì)胞長(zhǎng)至 90%以上的融合狀態(tài)時(shí)棄舊培養(yǎng)液，換為含10% FBS 的RPMI 164（0.2 ml/孔），次日按上述方法分別處理細(xì)胞，到時(shí)間后收集并提取總RNA：采用Trizol試劑一步法抽提。

1.2.2 RT- PCR[1-3] 嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)，不再累贅。RT-PCR結(jié)果紫外線透射儀觀察，用凝膠成像分析系統(tǒng)處理，進(jìn)行灰度掃描，以條代吸光度值 A 表示對(duì)應(yīng)目的片段的表達(dá)量，以內(nèi)參 GADPH片段的量校正，將二者的吸光度值A(chǔ)進(jìn)行分析。

1.2.3 Western Blot 詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[1-3]，具體不詳述。以每條泳道上10 μg蛋白，以空白組電泳條代灰度值設(shè)為1，其余與之進(jìn)行灰度比值。每次實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立進(jìn)行4次。

1.2.4 NO的測(cè)定 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作[2]：用 721 型可見(jiàn)光分光光度儀測(cè)定 550 nm的A值。根據(jù)所得的A 值，計(jì)算NO的濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件。結(jié)果均以（x±s）表示，數(shù)據(jù)處理采用單因素方差分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1阿托伐他汀鈣下調(diào)iNOS mRNA的表達(dá) HUVECs未刺激狀態(tài)下無(wú) iNOS mRNA 表達(dá)，0.1 μmol/L AngⅡ刺激12 h后明顯上調(diào)iNOS mRNA表達(dá)，10 μM、20 μM、30 μM阿托伐他汀鈣均明顯抑制iNOS mRNA（下調(diào)18.5%、17.9%、56.2 %，P<0.01），見(jiàn)表1和圖1。

2.2阿托伐他汀鈣抑制iNOS蛋白表達(dá) HUVECs基礎(chǔ)狀態(tài)iNOS表達(dá)極低（9.93±2.09），0.1 μM AngⅡ與HUVECs共同孵育12 h后明顯上調(diào)iNOS蛋白表達(dá)（62.9±5.41，與無(wú)刺激組相比P<0.001）；10 μM、20 μM、30 μM Ato也明顯抑制iNOS蛋白表達(dá)，分別下調(diào)5（P<0.01）、25.5、51.8（%， 與AngⅡ組相比P<0.001） ，這與對(duì)iNOS mRNA的影響類似，見(jiàn)表1。

2.3阿托伐他汀鈣增加HUVECs NO釋放HUVECs基礎(chǔ)狀態(tài)下，NO釋放量為（50.21±4.39） μM，0.1 μM AngⅡ刺激12 h使NO釋放量減少57.5%[（21.33±4.81） μM，P<0.001]。經(jīng)過(guò)不同濃度Ato預(yù)處理24 h后，NO釋放增加（P<0.001），見(jiàn)表2。

3 討論

我們以往的研究證實(shí)AngⅡ損傷血管內(nèi)皮，抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS），卻上調(diào)iNOS，總體上明顯減少內(nèi)皮型NO的生成[1-3]。而血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)皮源性NO對(duì)維持正常的血管生理功能非常關(guān)鍵，它參與調(diào)節(jié)血管張力、血小板黏附和聚集、黏附分子表達(dá)以及血管平滑肌細(xì)胞的增殖遷移等多種病理生理過(guò)程[8]。本研究觀察到阿托伐他汀鈣可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的 HUVECs iNOS 的表達(dá)，卻增加內(nèi)皮NO的釋放，是否與其參與調(diào)控eNOS的表達(dá)有關(guān)，不得而知。學(xué)者的關(guān)注熱點(diǎn)在于eNOS和血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO的關(guān)系上，較少關(guān)注iNOS在阿托伐他汀的心血管保護(hù)作用的意義，而iNOS也是炎癥反映指標(biāo)之一，血管內(nèi)皮細(xì)胞正常時(shí)無(wú)表達(dá)，一旦發(fā)生炎癥或應(yīng)激狀態(tài)、內(nèi)皮損傷即被激活，從而發(fā)揮其促炎、激活血小板、增強(qiáng)白細(xì)胞的黏附作用，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。如前所述，阿托伐他汀屬于強(qiáng)效降脂藥物，廣泛用于臨床，尤其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化和動(dòng)脈血栓性疾病有積極的預(yù)防和治療作用。但有關(guān)該類藥物在靜脈血栓、靜脈動(dòng)脈化（如動(dòng)靜脈造瘺或冠脈搭橋術(shù)后血管硬化、血栓形成、再狹窄和閉塞）中的應(yīng)用依據(jù)還缺乏相關(guān)證據(jù)，尤其是基礎(chǔ)研究較為滯后。

總之，我們的研究證明阿托伐他汀可以抑制AngⅡ誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞iNOS表達(dá)上調(diào)，卻增加內(nèi)皮型NO的釋放，是否通過(guò)其他途徑增加NO釋放，還需進(jìn)一步的研究，這為阿托伐他汀用于靜脈型血栓疾病的治療提供了新的思路。

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編輯/肖慧