肝細胞癌微觀結(jié)構(gòu)的X線相襯CT成像研究

簡建波

楊 浩YANG Hao

秦莉莉QIN Lili

胡春紅HU Chunhong

作者單位

天津醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院天津 300070

肝細胞癌微觀結(jié)構(gòu)的X線相襯CT成像研究

簡建波JIAN Jianbo

楊 浩YANG Hao

秦莉莉QIN Lili

胡春紅HU Chunhong

作者單位

天津醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院天津 300070

中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志

2016年 第24卷 第11期：869-872

Chinese Journal of Medical Imaging 2016 Volume 24 (11): 869-872

目的肝細胞癌（HCC）是最常見的惡性腫瘤之一，本文探討X線相襯CT（PCCT）在HCC微觀結(jié)構(gòu)成像中的應(yīng)用價值，有助于進一步了解該疾病的發(fā)展機制。資料與方法采集HCC組織8例，按病理表現(xiàn)分為中分化組（4例）和低分化組（4例）。在上海同步輻射裝置的BL13W1線站進行相襯成像。重建HCC組織中的微觀結(jié)構(gòu)，與病理切片對比分析，并應(yīng)用三維紋理分析方法評估兩組中肝細胞排列結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果相襯CT成像清晰地顯示了HCC組織中的纖維膠原、腫瘤邊緣微血管、竇樣毛細血管等特征結(jié)構(gòu)的二維和三維特征，與病理切片表現(xiàn)一致。三維紋理分析結(jié)果顯示低分化組肝細胞的排列結(jié)構(gòu)較中分化組發(fā)生了顯著變化（P<0.05）。結(jié)論相襯CT成像可清晰地顯示HCC微觀結(jié)構(gòu)的二維和三維圖像特征，并為其結(jié)構(gòu)的定量分析提供了參考，在HCC的研究中具有潛在的應(yīng)用和推廣價值。

癌，肝細胞；X射線相位襯度成像；病理學(xué)，外科；微觀結(jié)構(gòu)；體外研究

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的惡性腫瘤之一，其5年生存率僅為20%～40%[1-2]HCC發(fā)展的過程中伴隨著腫瘤血管新生、肝竇毛細血管化等微觀結(jié)構(gòu)的改變，研究這些改變有助于了解該疾病的發(fā)展機制。病理切片是觀察HCC中微觀結(jié)構(gòu)最常用的方法，但存在有創(chuàng)性、可重復(fù)性差及僅限于二維分析等缺點[3-4]。而常用的影像技術(shù)（如傳統(tǒng)的X線超聲、MRI等）受其成像原理的限制，在襯度分辨率和空間分辨率等多個指標(biāo)方面無法滿足HCC微觀結(jié)構(gòu)成像的技術(shù)要求。X線相位襯度CT（phase contrast computed tomography，PCCT）是基于X線穿過樣品后攜帶的相位信息對樣品內(nèi)部的微觀結(jié)構(gòu)進行成像，以一種全新的成像機制，解決了生物軟組織微觀成像的問題[5]。目前，關(guān)于HCC組織的相襯成像研究較少，本研究旨在利用PCCT高襯度和高分辨率的優(yōu)勢揭示HCC組織的微觀結(jié)構(gòu)，分析HCC在相襯成像中的影像學(xué)特點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及處理 選取2012年12月－2013年2月天津市腫瘤醫(yī)院切除的人體HCC組織8例。其中，病理結(jié)果顯示中分化4例，低分化4例。術(shù)前未注射任何造影劑，術(shù)后離體HCC組織立即使用磷酸緩沖溶液進行沖洗，隨后放入10%的福爾馬林溶液中固定。成像前將組織切成塊狀，大小約6 mm×4 mm，厚度2～4 mm，然后充分干燥，行PCCT成像。所有樣品取材均經(jīng)患者及其家屬同意，并經(jīng)道德倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 實驗裝置與方法 于上海同步輻射裝置的BL13W1線站進行。實驗裝置示意圖見圖1。實驗采用類同軸相位成像方法，成像能量為20 keV，探測器分辨率為3.7 μm，樣品與探測器之間的距離為1 m。CT掃描時，HCC組織置于錐形管內(nèi)固定在旋轉(zhuǎn)臺上，以0.15°/s的速度旋轉(zhuǎn)180°，總投影數(shù)1200張，每幅投影圖像曝光時間為2 s。每隔60張投影采集1張背景圖像，總共采集20張背景圖像，完成之后，關(guān)閉光源采集10張暗電流圖像。HCC組織再次放入福爾馬林溶液中。

圖1 實驗裝置示意圖

1.3 數(shù)據(jù)處理 所獲得的PCCT圖像包含相位和吸收，因此，在對不同角度的投影圖像進行背景圖像、暗電流圖像校正后，還需運用相位恢復(fù)的方法提取投影圖中的相位信息[6]。相位恢復(fù)后，采用濾波反投影算法進行CT重建，然后將所有斷層圖像按順序?qū)肴S可視化軟件Amira 5.2（美國，Visage Imaging Inc），獲得HCC組織的三維結(jié)構(gòu)。

1.4 病理學(xué)分析 將成像后的組織從福爾馬林溶液中取出，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、4 μm厚度連續(xù)切片，行HE染色。

1.5 圖像分析 本研究基于高分辨率的PCCT圖像，采用灰度共生矩陣法，探討中低分化HCC中肝細胞排列的三維紋理特征，提取兩組間具有顯著性差異的紋理參數(shù)，進而對肝細胞排列結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度進行科學(xué)量化[7]。具體的紋理分析方法為：在某一斷層中隨機選取100 pixel×100 pixel正方形，然后連續(xù)采樣100層，最終獲取一個100 pixel×100 pixel×100 pixel的三維灰度矩陣，如圖2所示，并以此作為紋理分析區(qū)域。每例組織隨機選取10組上述的三維灰度矩陣，并通過灰度共生矩陣對其紋理進行分析。隨后分別提取0°、45°、90°、135°和z軸方向的三維紋理參數(shù)，計算每個樣品在5個方向上的平均紋理參數(shù)值。在對紋理分析的過程中，為了避免血管及膠原纖維對分析結(jié)果造成影響，排除斷層中存在血管及膠原纖維的地方。

圖2 三維紋理分析采樣示意圖。A為某樣品的連續(xù)斷層。B為在A中（方框）選取的三維灰度矩陣

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SAS 9.1.3軟件，符合正態(tài)分布的計量資料組間比較行t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCCT圖像和病理切片的對照 PCCT圖像（圖3A）與相應(yīng)的病理切片（圖3B）非常相似。血管、纖維組織等特征結(jié)構(gòu)基本吻合，這證明了PCCT對HCC組織中微觀結(jié)構(gòu)的顯示具有較高的敏感度和準(zhǔn)確度。

圖3 HCC組織的PCCT斷層圖像（A）和相應(yīng)的病理切片（B）。箭示纖維組織，箭頭示內(nèi)充血細胞的微血管

2.2 HCC組織微觀結(jié)構(gòu)的三維可視化 PCCT顯示腫瘤邊緣及邊緣微血管和竇樣毛細血管等微觀結(jié)構(gòu)（圖4）。結(jié)合三維可視化技術(shù)，其微觀結(jié)構(gòu)可顯示為三維形式，可清楚地觀察到微血管的三維結(jié)構(gòu)及其分支情況，最小血管直徑約為20 μm。HCC組織的血管樹狀結(jié)構(gòu)破壞，主要沿腫瘤邊緣分布，深入腫瘤組織的分支較少，分支級數(shù)一般不超過3級。血竇腔不規(guī)則、空間結(jié)構(gòu)紊亂（圖4）。

圖4 HCC中微觀結(jié)構(gòu)的PCCT圖像及三維可視化。A和C為斷層圖像，箭示腫瘤邊緣（A）和竇樣毛細血管（C），箭頭示腫瘤邊緣的微血管（A）；B、D：微血管和竇樣毛細血管的三維結(jié)構(gòu)

2.3 微觀結(jié)構(gòu)改變的定量分析 本研究利用能量、慣量、和的均值以及和的熵4個不同的紋理參數(shù)來量化HCC發(fā)展過程中微小的改變。選取的紋理參數(shù)在兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 HCC三維紋理分析結(jié)果

3 討論

HCC是典型的多血管腫瘤，腫瘤新生血管形成是該疾病和發(fā)展過程中的一個標(biāo)志性事件，這些新生血管是腫瘤細胞無節(jié)制性地生長和遠處轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)[8]。因此，微血管改變的早期顯示對HCC的早期診斷和治療有重要的臨床意義。本研究中，PCCT可以清晰地顯示腫瘤組織的邊緣和分布在邊緣的微血管。利用三維可視化技術(shù)，微血管的三維形態(tài)得以顯現(xiàn)。本研究測得最小血管直徑約為20 μm，且血管沿腫瘤邊緣雜亂分布。HCC微血管的可視化為該疾病的早期檢測提供了可能。此外，增生的纖維組織和竇樣毛細血管都是HCC的特征結(jié)構(gòu)[9]。本研究清晰地顯示了其結(jié)構(gòu)，并從三維角度分析其形態(tài)，這為研究HCC的發(fā)展機制提供了新的思路。肝細胞形態(tài)和排列方式在HCC發(fā)展的過程中也發(fā)生了很大的變化，但這些改變引起的密度變化不如纖維或者血管明顯，所以其在PCCT圖像上的灰度變化并不是非常顯著。本研究采用三維紋理分析的方法來捕捉這種輕微的改變，結(jié)果顯示肝細胞形態(tài)和排列方式在HCC發(fā)展過程中有明顯的改變，進一步驗證了PCCT成像對微觀結(jié)構(gòu)變化的敏感性。

目前臨床上常用的影像學(xué)技術(shù)還不能觀察小于200 μm的微觀結(jié)構(gòu)[10-11]，限制了這些技術(shù)在HCC微觀結(jié)構(gòu)成像上的應(yīng)用。PCCT作為一種全新的X線成像技術(shù)，可以分辨密度變化為0.0003～0.002 g/cm3的不同組織邊界，空間分辨率可以達到1 μm，在軟組織成像領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[12-13]。李蓓蕾等[14]利用PCCT成像對HCC中的新生血管投影圖像進行了研究，顯示了腫瘤邊緣及內(nèi)部分布雜亂無章、形態(tài)無規(guī)則的微小血管，測量得到的血管最小直徑約為25 μm。但該研究基于投影圖像進行研究，未與病理切片進行對比分析，所以研究中顯示的樹枝狀結(jié)構(gòu)及細小的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)未能確定是否為血管結(jié)構(gòu)。本研究采用PCCT技術(shù)對投影圖像進行了斷層重建，可觀察HCC組織內(nèi)部的結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合三維可視化技術(shù)，可以從三維角度觀察HCC的微觀結(jié)構(gòu)，因此除了微血管，本研究還觀察到纖維組織、竇樣毛細血管等結(jié)構(gòu)。此外，本研究還引入了“金標(biāo)準(zhǔn)”病理切片和斷層圖像進行對比分析，證實PCCT成像的準(zhǔn)確性。

本研究初步探討了PCCT技術(shù)在HCC組織微觀結(jié)構(gòu)成像上的應(yīng)用，但由于樣本量較少，對于微血管和竇樣毛細血管等微觀結(jié)構(gòu)的定量分析還需加大樣本量研究加以證實。此外，由于同步輻射光源光斑視野的限制，本研究的成像視野較小，使得該技術(shù)目前還不能應(yīng)用于臨床成像，但是基于傳統(tǒng)X線的大視野相襯成像研究已經(jīng)在開展中[15-16]。同時，基于相襯成像的活體實驗研究也在進行中[17]，隨著技術(shù)的發(fā)展，相襯成像將給醫(yī)學(xué)影像學(xué)帶來深刻變革，并推動臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

總之，本研究基于相襯CT清晰地展示了HCC組織中纖維組織、腫瘤邊緣微血管和竇樣毛細血管等微觀結(jié)構(gòu)的二維和三維特征，并定量地分析了肝細胞排列結(jié)構(gòu)在HCC發(fā)展過程的微小改變。后期將引入更多樣本評估微血管和竇樣毛細血管等結(jié)構(gòu)在HCC發(fā)展過程中的變化。PCCT具有高襯度和高分辨率的特性，在HCC的研究中具有很高的應(yīng)用價值及前景。

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（本文編輯 張曉舟）

Microstructural Imaging of Hepatocellular Carcinoma Based on X-ray Phase-contrast Computed Tomography

College of Biomedical Engineering, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
Address Correspondence to:HU ChunhongE-mail: chunhong_hu@hotmail.com

PurposeHepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common malignant tumors. This study aimed to explore the application value of X-ray phasecontrast computed tomography (PCCT) in microstructure imaging of HCC tissues, which might allow for an improved understanding of the development of HCC.Materials and MethodsEight human resected HCC tissues (moderately-differentiated, four cases; poorly-differentiated, four cases) were imaged at beamline BL13W1 at the Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF). The microstructures in HCC were revealed via PCCT and the reconstructed CT images were confirmed by pathological sections. Threedimensional (3D) texture analysis was applied to assess distortion of hepatic cell arrangement in different differentiated HCC.ResultsThe microstructures such as fibrosis tissues, microvasculature, capillarized sinusoids were clearly revealed in two-dimensional (2D) and 3D images by PCCT. Moreover, the results of the 3D texture analysis showed that the hepatic cell arrangement had a significant change (P<0.05) between the moderatelydifferentiated and poorly-differentiated HCC.ConclusionThe results of this study indicate that PCCT has the potential to be used for microstructure imaging of HCC tissues and quantitative evaluation of those fine structures in the development of HCC. Thus, PCCT has good value of application and popularity in the study of HCC.

Carcinoma, hepatocellular; X-ray phase-contrast computed tomography; Pathology, surgical; Microstructure; In vitro

10.3969/j.issn.1005-5185.2016.11.018

胡春紅

國家自然科學(xué)基金（81371549，30900333）天津市自然科學(xué)基金（16JCYBJC28600）中國肝炎防治基金會-王寶恩肝纖維化研究基金資助課題（CFHPC20131033）。

2016-07-15

2016-10-25

R735.7；R445.3