針刺水溝、風(fēng)府穴對腦缺血模型大鼠血一氧化氮及內(nèi)皮素含量的影響

黃乃好，吳生兵，楊 帆，李 曌，史曉麗，汪 洋

(1.北京市豐臺中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，北京 100072；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，安徽 合肥 230038)

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針刺水溝、風(fēng)府穴對腦缺血模型大鼠血一氧化氮及內(nèi)皮素含量的影響

黃乃好1，吳生兵2，楊 帆1，李 曌1，史曉麗1，汪 洋1

(1.北京市豐臺中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，北京 100072；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，安徽 合肥 230038)

目的 探討針刺水溝-風(fēng)府穴組治療缺血性腦卒中的作用機制。方法 將40只大鼠分為正常組、模型組、水溝-風(fēng)府組(針刺大鼠水溝、風(fēng)府穴)、非經(jīng)非穴組(針刺大鼠臀部兩處非經(jīng)非穴點)，每組10只。采用阻閉大鼠大腦中動脈制備永久性腦缺血模型。72 h后觀察各組大鼠神經(jīng)功能評分，血清一氧化氮及血漿內(nèi)皮素含量的變化。結(jié)果 與模型組比較，水溝-風(fēng)府組腦缺血大鼠神經(jīng)功能評分明顯降低(P<0.05)，而非經(jīng)非穴組無明顯變化(P>0.05)。與模型組比較，非經(jīng)非穴組大鼠血清一氧化氮及血漿內(nèi)皮素含量無明顯變化(P>0.05)，水溝-風(fēng)府組大鼠血清一氧化氮及血漿內(nèi)皮素含量明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 針刺水溝-風(fēng)府穴組對缺血性腦卒中具有明顯的改善作用，其機制可能與降低血液中一氧化氮、內(nèi)皮素的含量有關(guān)。

針刺；水溝；風(fēng)府；腦缺血；一氧化氮；內(nèi)皮素

目前，腦卒中已成為世界各國致殘和致死的主要疾病之一[1]。中國每年有150萬 ～200萬新發(fā)腦卒中的病例，目前缺血性腦卒中占現(xiàn)存腦血管病患者的70%以上[2]。因此，尋求預(yù)防治療該病的有效方法成為當(dāng)今熱門的課題，其中針灸在預(yù)防治療該病方面起到非常重要的作用。本研究通過電針?biāo)疁虾惋L(fēng)府兩穴對腦缺血模型大鼠血一氧化氮(nitric oxide，NO)及內(nèi)皮素(endothelin，ET)含量的影響，并初步探討針刺防治腦缺血的作用機制，并驗證以上兩穴在臨床治療中的作用。

1 材料

1.1 實驗動物與分組 選用健康清潔級SD大鼠40只，雌雄各半，8周齡，體質(zhì)量為(180±20)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2011-002。將40只大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、水溝-風(fēng)府組及非經(jīng)非穴組。每組10只。

1.2 主要試劑及儀器 722型分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；原子吸收分光光度計：美國熱電；智能型γ計數(shù)儀：上海原子核研究所；TGL-16型高速離心機：江蘇榮華；PCE-A 型程控電針治療儀：安徽天恒；NO測定試劑盒：南京建成生物工程研究所提供；ET放免試劑盒：解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所提供。

2 方法

2.1 模型復(fù)制方法 采用阻閉大鼠大腦中動脈制備永久性腦缺血模型[3]。術(shù)前禁食12 h，自由飲水。用10%水合氯醛腹腔注射(3.5 mL/kg)麻醉，術(shù)中動物保持自主呼吸，將大鼠放置在恒溫加熱板上，保持大鼠體溫恒定為37.0 ℃左右。頸部常規(guī)無菌操作，從頸部正中縱向切口，暴露頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸總動脈及頸外動脈，在頸總動脈分叉部的下方剪一小切口，將尼龍單纖絲線一末端插入頸內(nèi)動脈17～18 mm，扎緊動脈殘端，完全阻斷大腦中動脈的血流，縫合皮膚。

2.2 神經(jīng)功能評分標(biāo)準(zhǔn) 按照改進的Zea Longa評分法[4]，分別于術(shù)后24、48、72 h進行神經(jīng)行為學(xué)評定。評分標(biāo)準(zhǔn)：無明顯神經(jīng)行為學(xué)癥狀，0分；不能完全伸展左側(cè)前爪，1分；向左側(cè)旋轉(zhuǎn)，2分；行走時向左側(cè)傾倒，3分；只在刺激時行走，4分。將0分、不能自行行走及昏迷不醒者剔除。3次神經(jīng)行為學(xué)評分分別取平均數(shù)進行統(tǒng)計。

2.3 治療方法 參照《實驗針灸學(xué)》[5]對水溝、風(fēng)府進行定位。水溝，唇裂鼻尖下1 mm正中處；風(fēng)府，枕骨頂嵴后枕寰關(guān)節(jié)背凹陷處。非經(jīng)非穴：選取大鼠臀部非經(jīng)非穴點兩處(臀大肌外上象限內(nèi)，按文獻[5]無經(jīng)絡(luò)和穴位處)。除正常組和模型組外，其余兩組于模型復(fù)制成功24 h后分別針刺，連續(xù)3 d。大鼠清醒后將其放入固定器中，無菌操作所取穴位，13 mm長毫針刺入3～5 mm，接通電針儀。用2～100 Hz混頻疏密波，強度為1～3 mA，以四肢顫抖為度，每次20 min，每日1次，共3次。

2.4 觀察指標(biāo)及檢測方法 末次電針治療結(jié)束后，禁食12 h，自由飲水，進行末次神經(jīng)行為學(xué)評定，腹主動脈采血3～5 mL，置于10 mL試管中，立即抽取1.5 mL，注入帶有抗凝劑塑料子彈頭管，混勻，3 000 r/min低溫離心，取血清，低溫(<20 ℃)保存，待測NO。立即抽取等量血液以3 000 r/min低溫離心，取血漿，低溫(<20 ℃)保存，待測ET。采用硝酸還原酶法測定血清NO含量，放射免疫法測定血漿ET含量。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較 與模型組比較，水溝-風(fēng)府組腦缺血大鼠神經(jīng)功能評分明顯降低(P<0.05)，而非經(jīng)非穴組無明顯變化(P>0.05)。說明針刺水溝-風(fēng)府穴組可明顯降低腦缺血大鼠神經(jīng)功能評分，改善腦缺血大鼠神經(jīng)功能。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較±s)

注：與模型組比較，#P<0.05；與非經(jīng)非穴組比較，△P<0.05。

3.2 各組大鼠血清NO及血漿ET含量比較 與正常組比較，模型組大鼠血清NO及血漿ET含量明顯升高(P<0.05)，表明模型復(fù)制成功；與模型組比較，非經(jīng)非穴組大鼠血清NO及血漿ET含量無明顯變化(P>0.05)，水溝-風(fēng)府組大鼠血清NO及血漿ET含量明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清NO及血漿ET含量比較±s)

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與非經(jīng)非穴組比較，△P<0.05。

4 討論

缺血性腦卒中又名“中風(fēng)”，因本病起病急驟，證見多端，變化迅速，與風(fēng)性善行數(shù)變的特性相似，故以“中風(fēng)”命名之。其病理因素可歸納為火、風(fēng)、痰、氣、瘀，以肝腎陰虛為本，同時受自然環(huán)境、氣候變化、五運六氣、飲食勞倦、情緒因素、性別、年齡等影響。因其對人類的健康危害極大，尋求治療該病方法已成為臨床和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的重要課題。目前臨床上治療該病藥物療法仍是有效手段之一，但是藥物在干預(yù)相應(yīng)靶器官、靶細胞的同時，往往給患者造成不可避免的毒性及不良反應(yīng)。而應(yīng)用針刺治療缺血性腦損傷療效肯定[6]，不僅廣泛運用于恢復(fù)期治療，而且已被越來越普遍地應(yīng)用于急性期的輔助治療，其療效也被廣泛肯定[7-8]。督脈起于下極之輸，并于脊里，上至風(fēng)府，入腦，上巔，臨床督脈穴位常用于治療腦病，水溝、風(fēng)府同為督脈的穴位。有些學(xué)者采用針刺水溝或風(fēng)府為主治療腦缺血疾病，取得較好的臨床療效[9-11]。本課題組前期研究也證實針刺水溝-風(fēng)府穴組能干預(yù)腦出血模型大鼠腦組織形態(tài)學(xué)、血清心肌酶等指標(biāo)而發(fā)揮作用[12]。

缺血性腦卒中病理機制非常復(fù)雜，包括能量代謝障礙與梗死灶周圍缺氧去極化和興奮性氨基酸毒性、氧化應(yīng)激損傷、炎性反應(yīng)、神經(jīng)細胞凋亡等，它們均由缺血引發(fā)，發(fā)生在不同時間點，彼此重疊并相互聯(lián)系。而NO和ET是體內(nèi)重要的血管活性因子，并參與了腦缺血損傷的病理生理過程，本研究觀察在腦缺血過程中血清NO及血漿ET含量的變化及針刺的影響。

NO是在一氧化氮合酶(nitricoxide synthase，NOS)的催化下，由L-精氨酸氧化產(chǎn)生的一種氣體活性因子，在腦缺血過程中具有復(fù)雜的作用機制[13]，腦缺血早期結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶(constitutive nitric oxide synthase，cNOS)活化并產(chǎn)生的NO舒張血管，維持腦血流、抗血小板聚集和黏附，對腦缺血具有保護作用；但隨缺血時間的延長，缺血區(qū)域炎性細胞浸潤使誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase，iNOS)活性及表達升高，產(chǎn)生大量的NO，具有細胞毒性作用。NO發(fā)揮著保護和損傷的雙重作用，在腦缺血損傷中可能與釋放的時間、量及來源有密切的關(guān)系。ET是由內(nèi)皮細胞釋放的，由氨基酸殘基組成的活性多肽，分布于血管內(nèi)皮細胞及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在腦缺血損傷中，在來源、體循環(huán)中，還是腦缺血區(qū)的ET，均具有收縮腦血管、調(diào)節(jié)腦血流的作用[14]。同時ET在腦缺血損傷過程中促進自由基的產(chǎn)生，加大腦損傷程度。此外，在預(yù)實驗中，檢測NO在血清中含量變化明顯，ET在血漿中含量變化明顯，更有利于本研究實施，故選取血清中NO及血漿中ET作為觀察指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，針刺水溝-風(fēng)府穴組能夠降低大鼠的血清NO及血漿ET含量，腦缺血大鼠神經(jīng)功能評分明顯降低，而非經(jīng)非穴組均無明顯變化。說明在腦缺血損傷機制中，過多產(chǎn)生的NO可與超氧自由基反應(yīng)，引起細胞損傷，同時介入谷氨酸能神經(jīng)細胞的毒性作用，介導(dǎo)細胞死亡。因此，針刺水溝-風(fēng)府穴組能夠有效地抑制NO、ET的過度升高，最大程度地保護腦缺血后神經(jīng)功能損傷，這可能是針刺治療腦缺血損傷的機制之一。

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Effect of Acupuncture at Shuigou and Fengfu Points on Levels of Nitric Oxide and Endothelin in Rats with Cerebral Ischemia

HUANG Nai-hao1, WU Sheng-bing2, YANG Fan1, LI Zhao1, SHI Xiao-li1, WANG Yang1

(1. Department of Rehabilitation Medicine, Integrated Traditional Chinese and Western Medical Hospital of Fengtai District, Beijing 100072, China; 2. Key Laboratory of Xin’an Medicine, Ministry of Education, Anhui University of Chinese Medicine, Anhui Hefei 230038, China)

Objective To investigate the mechanism of action of acupuncture at Shuigou-Fengfu points in the treatment of ischemic stroke. Methods A total of 40 rats were divided into normal group, model group, Shuigou-Fengfu group (acupuncture at Shuigou-Fengfu points), and non-acupoint group (acupuncture at two non-acupoints in the hip), with 10 rats in each group. A rat model of permanent cerebral ischemia was established by occlusion of the middle cerebral artery. The neurological score and changes in serum levels of nitric oxide (NO) and endothelin (ET) were observed at 72 hours after treatment. Results Compared with the model group, the Shuigou-Fengfu group had a significant reduction in the neurological score of rats with cerebral ischemia (P<0.05); there was no difference in such score between the model group and the non-acupoint group (P>0.05). Compared with the model group, the non-acupoint group had no significant changes in the levels of serum NO and plasma ET (P>0.05), while the Shuigou-Fengfu group had significant reductions in the levels of serum NO and plasma ET (P<0.05). Conclusion Acupuncture at Shuigou-Fengfu points can significantly improve ischemic stroke, and its mechanism may be related to the reduction in the levels of NO and ET in blood.

Acupuncture; Shuigou; Fengfu; Cerebral ischemia; Nitric oxide; Endothelin

安徽高校省級自然科學(xué)研究項目(KJ2016A857)；高校優(yōu)秀中青年骨干人才國內(nèi)外訪學(xué)研修重點項目(gxfxZD2016115)

黃乃好(1976-)，男，碩士，副主任醫(yī)師

吳生兵，wsb922@126.com

R255.2；R743.3

10.3969/j.issn.2095-7246.2016.06.019

2016-10-26；編輯：曹健)