基于TGF-β/Smads信號(hào)通路探討桃核承氣湯治療慢性腎衰竭的機(jī)制

張喜奎，危美紅，蘇美玲，莊秀輝

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)研究院，福建 福州 350003)

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·實(shí)驗(yàn)研究·

基于TGF-β/Smads信號(hào)通路探討桃核承氣湯治療慢性腎衰竭的機(jī)制

張喜奎1，危美紅2，蘇美玲2，莊秀輝2

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)研究院，福建 福州 350003)

目的 觀察桃核承氣湯對(duì)慢性腎衰竭(chronic renal failure，CRF)大鼠腎臟功能、腎臟病理形態(tài)及對(duì)TGF-β/Smads信號(hào)通路的影響，探討本方治療CRF的機(jī)制。方法 將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組、尿毒清組、桃核承氣湯組。模型組、尿毒清組與桃核承氣湯組行5/6腎切除手術(shù)，假手術(shù)組僅行雙腎被膜剝離術(shù)，空白組不進(jìn)行手術(shù)，術(shù)后4周予不同的藥物治療，空白組、模型組、假手術(shù)組大鼠給予蒸餾水灌胃，尿毒清組予尿毒清灌胃，桃核承氣湯組予桃核承氣湯灌胃；治療后觀察腎組織病理變化、免疫功能指標(biāo)及腎功能指標(biāo)。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠SCr、BUN、血β2-MG、尿β2-MG、尿RBP及24 h尿蛋白含量，腎組織TGF-β1、Smad2、Smad3表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；模型組大鼠Smad4和Smad7表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，尿毒清組、桃核承氣湯組大鼠SCr、BUN、血β2-MG、尿β2-MG、尿RBP及24 h尿蛋白含量，腎組織TGF-β1、Smad2、Smad3表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；Smad4和Smad7表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與尿毒清組比較，桃核承氣湯組大鼠SCr、BUN、血β2-MG、尿β2-MG、尿RBP及24 h尿蛋白含量，腎組織TGF-β1、Smad2、Smad3表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；Smad4和Smad7表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。結(jié)論 桃核承氣湯可以明顯改善CRF大鼠的腎功能，降低血清SCr、BUN、β2-MG及24 h尿蛋白、尿β2-MG、RBP的含量；桃核承氣湯可以通過影響TGF-β/Smads信號(hào)通路抑制TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白和促進(jìn)Smad4、Smad7蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化。

慢性腎衰竭；桃核承氣湯；尿毒清；TGF-β/Smads

慢性腎衰竭(chronic renal failure，CRF)是各種病因引起的腎臟損害和進(jìn)行性惡化的結(jié)果，是緩慢出現(xiàn)的腎功能減退并不可逆轉(zhuǎn)的腎臟衰竭綜合征[1]。桃核承氣湯是《傷寒雜病論》中辨治瘀熱證的代表方，該方在CRF的臨床應(yīng)用已經(jīng)有大量報(bào)道，但是其作用機(jī)制尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)研究擬通過建立CRF大鼠的模型，觀察桃核承氣湯是否通過轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β，TGF-β)/Smads信號(hào)通路的傳導(dǎo)抑制CRF大鼠腎纖維化而延緩慢性腎衰竭的進(jìn)展，從而為本方的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，雄性，60只，7周齡，體質(zhì)量180～200 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥 桃核承氣湯：由桃仁、大黃各12 g，桂枝、炙甘草、芒硝各6 g組成。以上藥物均購自福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂，藥物經(jīng)常規(guī)煎煮過濾，并濃縮為390 g/L的溶液，置于4 ℃冰箱備用。尿毒清顆粒：主要由大黃、黃芪、桑白皮、苦參、白術(shù)、茯苓、白芍、制何首烏、丹參、車前草等組成，每袋5 g，由康臣藥業(yè)生產(chǎn)，批號(hào)為國藥準(zhǔn)字Z20073256。

1.3 主要試劑 ZLI-9032 DAB顯色試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；β2微球蛋白(beta 2-microglobulin，β2-MG)放射免疫分析試劑盒：山東省濰坊三維生物工程集團(tuán)有限公司；TGF-β1(BS-0086R)、Smad 2(BS-0718R)、Smad 3(BS-3484R)、Smad 4(BS-0585R)、Smad 7(BS-0566R)一抗試劑盒：北京博奧森。

1.4 主要儀器 GC-911型放射免疫計(jì)數(shù)器：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；BX51T-PHD-J11顯微鏡：日本奧林巴斯；RM2015石蠟切片機(jī)：德國萊卡；DNM-9602酶標(biāo)儀：北京普朗新技術(shù)有限公司；Image Pro Plus多功能彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)：美國Media Cybernetics公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型復(fù)制、分組及給藥 雄性清潔級(jí)SD大鼠60只，7周齡，體質(zhì)量180～200 g，購回后在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為5組，分別是空白組、假手術(shù)組、模型組、尿毒清組、桃核承氣湯組，每組各12只。參照文獻(xiàn)[2]方法，模型組、尿毒清組與桃核承氣湯組大鼠均行5/6腎切除手術(shù)：用10%無菌水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉后將大鼠俯臥位固定于鼠臺(tái)上，手術(shù)者戴無菌手套，鋪無菌洞巾。第1次手術(shù)在左側(cè)腎臟部位備皮后用強(qiáng)力碘無菌操作皮膚，在肋脊角部位做一個(gè)1.5～2.0 cm的斜切口，先用手術(shù)剪刀剪開皮膚，再剪開肌肉，用左食指往切口方向托出左腎于體表，剝離腎包膜，用七號(hào)線結(jié)扎左腎上、下極，結(jié)扎皮質(zhì)約2/3的腎組織，立即以明膠海綿壓迫止血結(jié)扎部位，無明顯出血后方可復(fù)位腎臟，縫合肌肉皮膚，縫合后用強(qiáng)力碘無菌操作切口，術(shù)后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素(7.2萬U/kg)以預(yù)防感染。7 d后進(jìn)行第2次手術(shù)，在背包脊柱右側(cè)做斜切口，剝離肌層，結(jié)扎腎門部位，切除右側(cè)腎臟?？p合各層組織，術(shù)后切口強(qiáng)力碘無菌操作。腹腔注射青霉素3 d(劑量同前)。假手術(shù)組制備：手術(shù)過程同腎衰竭模型制備，僅做雙腎被膜剝離。手術(shù)后每天仔細(xì)觀察各組大鼠一般情況，主要包括進(jìn)食、飲水量、毛色、活動(dòng)情況、大小便情況等，28 d后每7 d記錄1次大鼠體質(zhì)量。服藥量按體質(zhì)量的變化進(jìn)行調(diào)整，每天上午約9：00給藥：桃核承氣湯組予桃核承氣湯灌胃；尿毒清組用尿毒清灌胃；空白組、假手術(shù)組和模型組均用同容積的生理鹽水灌胃。給藥劑量用臨床成人每千克體質(zhì)量的6倍計(jì)算[3]，給藥56 d。

2.2 取材 尿液標(biāo)本：在給藥后的第56天早上7:00左右，將各組大鼠分別放入代謝籠中收集24 h尿液(加入5 mL甲苯防腐)至于-40 ℃的冰箱中保存；血液標(biāo)本：給藥后第57天上午將大鼠在腹腔麻醉下，腹主動(dòng)脈采血5 mL，置于不加任何抗凝劑的試管中靜置，然后在4 ℃、3 000 r/min的離心機(jī)中離心15 min，吸取上層血清，置于-20 ℃冰箱中保存；腎臟組織：采血后迅速取殘余腎組織，用蒸餾水清洗后，放入4%多聚甲醛溶液中固定。

2.3 檢測(cè)方法

2.3.1 生化指標(biāo)檢測(cè) ①尿β2-MG檢測(cè)：用放射免疫分析法；②尿視黃醇結(jié)合蛋白(retinol binding protein，RBP)檢測(cè)：用酶聯(lián)免疫吸附分析法；③24 h尿蛋白定量檢測(cè)：用雙縮脲法；④血清肌酐(serum creatinine，SCr)檢測(cè)：用除蛋白苦味酸比色法；⑤血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)檢測(cè)：用脲酶法；⑥血清β2-MG檢測(cè)：用免疫比濁法。

2.3.2 腎組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用免疫組化法。(1)取材：取各組動(dòng)物盡可能新鮮的組織，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗，取小于0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm組織塊。(2)固定和包埋：用4%多聚甲醛(0.1 mol/L PBS，pH 7.0～7.6，含0.1% DEPC)進(jìn)行固定，經(jīng)70%乙醇30 min、80%乙醇30 min、90%乙醇30 min 2次、95%乙醇30 min 2次、100%乙醇30 min 2次、二甲苯透明30 min 2次、55 ℃石蠟中30 min 2次、用銅制模具包埋組織塊。(3)切片：將厚度3～5 μm的組織切片附于經(jīng)多聚賴氨酸覆膜的載玻片上，60 ℃烘烤過夜。(4)脫蠟、入水：將切片浸于二甲苯中5 min 2次、100%乙醇5 min 2次、95%乙醇5 min 2次、90%乙醇5 min 2次、85%乙醇5 min 2次、75%乙醇5 min 2次、自來水沖洗、PBS洗2次。(5)1%甲醇雙氧水，室溫10 min，蒸餾水洗1次，0.1 mol/L PBS洗3次，每次5 min。(6)將切片放入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，在微波爐內(nèi)微波輻射10 min；待修復(fù)液降至室溫后，0.1 mol/L PBS洗3次,每次5 min。(7)切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min。甩去多余液體，不洗。(8)切片上滴加第一抗體，4 ℃過夜，0.1 mol/L PBS洗3次，每次5 min。(9)切片上滴加生物素化第二抗體(IgG)，37 ℃ 20 min，0.1 mol/L PBS洗3次，每次5 min。(10)切片上滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37 ℃ 20 min，0.1 mol/L PBS洗3次，每次5 min。(11)DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒1 mL蒸餾水加顯色劑A、B、C各1滴，混勻，加至標(biāo)本上，顯色6 min，充分水洗。(12)蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1 min，充分水洗、1%鹽酸乙醇分化、1%胺水反藍(lán)、充分水洗、經(jīng)70%乙醇5 min、80%乙醇5 min、90%乙醇5 min 2次、95%乙醇5 min 2次、100%乙醇5 min 2次脫水、二甲苯透明5 min 2次、中性樹脂封片。(13)顯微鏡觀察：10×40倍顯微照相。(14)圖像分析：選擇有意義的組織相，經(jīng)登錄、編號(hào)、采集、分析、讀取數(shù)據(jù)、最后存盤。

2.3.3 腎組織病理學(xué)觀察 將腎組織切成1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm大小后，先用4%多聚甲醛固定，再用乙醇梯度脫水和二甲苯透明，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片5 μm、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，光鏡下觀察腎組織形態(tài)變化。

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察 空白組與假手術(shù)組大鼠狀態(tài)良好，體質(zhì)量增長(zhǎng)較快，動(dòng)作敏捷，毛色亮白，進(jìn)食、飲水量及大、小便均正常，模型組狀態(tài)最差，死亡最多，主要表現(xiàn)為體質(zhì)量上升緩慢，精神不振，活動(dòng)較少，毛色不齊、污濁泛黃且沒有光澤，耳朵末梢蒼白，進(jìn)食量較少，甚則有出現(xiàn)血尿；桃核承氣湯組和尿毒清組大鼠相對(duì)于模型組體質(zhì)量增加較多，反應(yīng)靈敏，活動(dòng)比較多，毛色整齊光亮，進(jìn)食量較正常組稍有減少，大、小便均正常。

3.2 實(shí)驗(yàn)過程中大鼠死亡情況 ①第1次模型復(fù)制時(shí)死亡情況：模型組2只、尿毒清組1只、假手術(shù)組2只，原因?yàn)槁樽磉^量及術(shù)中大出血；②第1次術(shù)后1周內(nèi)死亡情況：模型組1只、尿毒清組2只、桃核承氣湯組1只，原因考慮術(shù)后感染；③第2次術(shù)后1周內(nèi)死亡：模型組1只、尿毒清組1只、桃核承氣湯組2只，原因考慮術(shù)后感染；⑤第5周后死亡：尿毒清組1只、桃核承氣湯組1只、假手術(shù)組1只、空白組3只，原因考慮灌胃方法不當(dāng)。

3.3 各組大鼠SCr、BUN水平比較 空白組與假手術(shù)組大鼠SCr和BUN比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠SCr、BUN含量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，尿毒清組、桃核承氣湯組大鼠SCr、BUN含量顯著降低(P<0.05)；與尿毒清組比較，桃核承氣湯組大鼠SCr、BUN含量顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠SCr、BUN水平比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與尿毒清組比較，△P<0.05。

3.4 各組大鼠血β2-MG、尿β2-MG水平比較 空白組、假手術(shù)組血β2-MG、尿β2-MG水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血β2-MG、尿β2-MG水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，尿毒清組、桃核承氣湯組大鼠血β2-MG、尿β2-MG水平顯著降低(P<0.05)；桃核承氣湯組大鼠血β2-MG、尿β2-MG水平顯著低于尿毒清組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血β2-MG、尿β2-MG水平比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與尿毒清組比較，△P<0.05。

3.5 各組大鼠尿RBP及24 h尿蛋白水平比較 空白組尿RBP和24 h尿蛋白水平與假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠尿RBP及24 h尿蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，尿毒清組、桃核承氣湯組大鼠尿RBP及24 h尿蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與尿毒清組比較，桃核承氣湯組大鼠尿RBP及24 h尿蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

3.6 各組大鼠腎組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7表達(dá)水平比較 空白組和假手術(shù)組腎組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4和Smad7表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β1、Smad2、Smad3表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Smad4和Smad7表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；尿毒清組、桃核承氣湯組與模型組比較，腎組織TGF-β1、Smad2、Smad3表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，Smad4和Smad7表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與尿毒清組比較，桃核承氣湯組腎組織TGF-β1、Smad2、Smad3表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，Smad4和Smad7表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表4和圖1。

表3 各組大鼠尿RBP及24 h尿蛋白水平比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與尿毒清組比較，△P<0.05。

表4 各組大鼠腎組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4和Smad7蛋白表達(dá)水平比較±s)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與尿毒清組比較，△P<0.05。

圖1 各組大鼠腎組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7表達(dá)水平(免疫組化法，10×40倍)

3.7 各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)觀察 正常組與假手術(shù)組大鼠腎小球和腎小管均正常，幾乎無病理改變，假手術(shù)組偶可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)排列紊亂，間質(zhì)增生，毛細(xì)血管內(nèi)瘀血，血管內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞足突融合，可見部分腎小管壞死，腎小管上皮細(xì)胞水腫明顯。尿毒清組大鼠腎小球毛細(xì)血管內(nèi)有少量瘀血，內(nèi)有少許壞死的炎性細(xì)胞，上皮細(xì)胞輕度水腫，部分腎小管擴(kuò)張。桃核承氣湯組大鼠腎小球毛細(xì)血管輕度充血，血管內(nèi)少許炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，足細(xì)胞輕度水腫，腎小管基本正常。見圖2。

注：A．空白組；B．假手術(shù)組；C．模型組；D．尿毒清組；E．桃核承氣湯組。圖2 各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色，10×40倍)

4 討論

桃核承氣湯是《傷寒雜病論》中辨治瘀熱證的代表方，該方用于CRF的治療已有很多臨床報(bào)道。CRF的發(fā)病過程中，因代謝產(chǎn)物同時(shí)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用及尿素從腸道內(nèi)排出過多，部分患者尤其是合并泌尿系感染者，多有腰、少腹疼痛、小便灼熱、少腹拒按等“少腹急結(jié)”之證，基本符合桃核承氣湯證之少腹急結(jié)、大便色黑、狂躁不寧、舌質(zhì)紫暗等癥。此病之因雖與《傷寒論》中桃核承氣湯證之太陽表證不解，邪熱與瘀血結(jié)于下焦的“太陽蓄血”有異，但主證一致。腎臟日久受損，決瀆無權(quán)，下焦開合失度，濁毒蘊(yùn)結(jié)于下，血脈凝泣，化為瘀血，外邪侵襲，與下焦原有之邪相合，清濁相干，下焦瘀阻。久病脾腎陽虛，濁陰內(nèi)盛，陽虛寒凝，血脈澀滯，日久生瘀。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也證實(shí)，在CRF的病程中，始終存在著高凝狀態(tài)，尤其是纖維蛋白在腎小球毛細(xì)血管內(nèi)沉積，形成血栓，引起腎血流量減少，腎小球?yàn)V過率下降，從而導(dǎo)致腎功能衰竭。由此可知，桃核承氣湯乃張仲景專為瘀血、邪熱結(jié)于下焦而設(shè)，全方專清下焦瘀熱，開關(guān)利竅，頗合病機(jī)?，F(xiàn)代研究表明，桃核承氣湯組成藥物多有延緩CRF的藥理作用，桃核承氣湯在腎血瘀證的臨床應(yīng)用中也取得了較好的療效，所以該方可以作為CRF臨床治療和研究的方劑[4-5]。

導(dǎo)致CRF進(jìn)行性發(fā)展的原因很多，機(jī)制復(fù)雜，與原發(fā)病也有密切的關(guān)系，病理基礎(chǔ)主要表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，其中腎間質(zhì)纖維化是各種原因造成的腎臟病進(jìn)行性發(fā)展至終末期的共同途徑。腎間質(zhì)纖維化是一種多因素、多細(xì)胞、多因子共同參與的生理病理過程，其本質(zhì)特征為細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的異常增加以及過多聚積，形成機(jī)制十分復(fù)雜，腎功能損害程度與腎間質(zhì)纖維呈正相關(guān)，且腎間質(zhì)纖維化是不可逆的[6-7]。因此，阻斷或抑制腎間質(zhì)纖維化就有可能延緩CRF的進(jìn)展，這是近年來治療CRF的一大進(jìn)展。

TGF-β是一類多功能、雙向調(diào)節(jié)的細(xì)胞間信號(hào)蛋白，能夠調(diào)控細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、移行和最終的凋亡都有重要的影響。它在胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育、器官形成、ECM形成等多種生理過程中發(fā)揮重要作用。TGF-β/Smads信號(hào)通路的形成，主要是通過與細(xì)胞表面的某些特異性的抗體結(jié)合，最后將信號(hào)傳給細(xì)胞內(nèi)Smads分組蛋白，在整個(gè)通路中某一部分及相關(guān)調(diào)節(jié)因子發(fā)生改變都會(huì)影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而影響TGF-β發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。最早在大鼠腎纖維化的培養(yǎng)皿中發(fā)現(xiàn)TGF-β，它主要有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3這3種亞型，它們的作用相似，但是各自作用的靶點(diǎn)卻不一樣。TGF-β1的產(chǎn)生主要在淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，當(dāng)組織發(fā)生慢性炎癥或纖維化改變時(shí)，細(xì)胞間質(zhì)中TGF-β1的含量會(huì)顯著上升。現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究表明，TGF-β1在腎間質(zhì)纖維化過程中是最重要的作用因子之一，所以阻斷它是防治腎間質(zhì)纖維化的有效方法。Smads蛋白是TGF-β/Smads信號(hào)傳導(dǎo)中最關(guān)鍵的下游調(diào)節(jié)因子，迄今為止，發(fā)現(xiàn)的Smads蛋白一共有9種。Smads蛋白按結(jié)構(gòu)和功能可分為3類，第1類是受體激活型Smad蛋白(R-Smads)，包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8和Smad9這6種，其中Smad2/3這兩種蛋白是TGF-β1受體激活酶與蛋白連接的直接結(jié)合部位；第2類是通用型Smad蛋白(Co-Smads)，即Smad4，它可與活化的R-Smad形成異聚復(fù)合體，在信號(hào)的傳導(dǎo)中起瓶頸作用；第3類是抑制型Smad蛋白(Ⅰ-Smads)，包括Smad6和Smad7蛋白，其不能直接結(jié)合DNA，可以與受體激活型Smad蛋白結(jié)合，但產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)是沒有活性的，因此可以阻遏信號(hào)的傳遞。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，Smads蛋白是唯一的TGF-β受體胞內(nèi)激酶底物，當(dāng)被激活后可以將TGF-β信號(hào)從細(xì)胞表面受體傳至細(xì)胞核中。Smads蛋白作為TGF-β調(diào)節(jié)中介，在腎纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。所以，抑制TGF-β的產(chǎn)生和活性，拮抗或阻斷TGF-β/Smads信號(hào)傳導(dǎo)途徑可延緩腎纖維化的進(jìn)展，干預(yù)TGF-β/Smads通路，對(duì)防止腎間質(zhì)纖維化具有重要意義。這一信號(hào)傳導(dǎo)通路中，Smad2/3蛋白是促進(jìn)因子而Smad4/7蛋白是抑制因子[8-10]。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，桃核承氣湯可以降低CRF大鼠24 h尿蛋白、尿β2-MG、尿RBP、BUN、SCr、血β2-MG；可保護(hù)大鼠腎小球及腎小管功能，延緩腎間質(zhì)纖維化；桃核承氣湯可以影響TGF-β/Smads的傳導(dǎo)，通過抑制TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Smad4、Smad7蛋白的表達(dá)而減緩腎間質(zhì)纖維化的過程，從而達(dá)到治療和延緩CRF的發(fā)展。桃核承氣湯治療CRF療效優(yōu)于尿毒清顆粒。但該方用于延緩CRF的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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Mechanisms of Taohe Chengqi Decoction in Treatment of Chronic Renal Failure Based on the TGF-β/Smads Signaling Pathway

ZHANG Xi-kui1, WEI Mei-hong2, SU Mei-ling2, ZHUANG Xiu-hui2

(1. The Second People’s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fujian Fuzhou 350003, China; 2. Research Institute of Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fujian Fuzhou 350003, China)

Objective To investigate the effect of Taohe Chengqi Decoction on renal function, renal pathological morphology, and the TGF-β/Smads signaling pathway in rats with chronic renal failure (CRF), as well as the mechanisms of action of this prescription in the treatment of CRF. Methods A total of 60 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into blank group, sham-operation group, model group, uremic clearance granule group, and Taohe Chengqi Decoction group. The rats in the model group, uremic clearance granule group, and Taohe Chengqi Decoction group were given 5/6 nephrectomy, those in the sham-operation group were given kidney capsule peeling, and those in the blank group did not undergo surgery. All the rats were given medication during 4 weeks after surgery; the rats in the blank group, model group, and sham-operation group were given distilled water by gavage, those in the uremic clearance granule group were given uremic clearance granules by gavage, and those in the Taohe Chengqi Decoction group were given Taohe Chengqi Decoction by gavage. The renal histopathological changes, immune function parameters, and renal function markers were observed after treatment. Results Compared with the sham-operation group, the model group had significant increases in serum creatinine (SCr), blood urea nitrogen (BUN), blood β2-microglobulin (β2-MG), urine retinol-binding protein (RBP), 24-h urinary protein, and the expression of transforming growth factor-β1(TGF-β1), Smad2, and Smad3 in renal tissue (P<0.05), as well as significant reductions in the expression of Smad4 and Smad7 (P<0.05). Compared with the model group, the uremic clearance granule group and Taohe Chengqi Decoction group had significant reductions in SCr, BUN, blood β2-MG, urine β2-MG, urine RBP, 24-hour urinary protein, and the expression of TGF-β1, Smad2, and Smad3 in renal tissue (P<0.05), as well as significant increases in the expression of Smad4 and Smad7 (P<0.05). Compared with the uremic clearance granule group, the Taohe Chengqi Decoction group had significant reductions in SCr, BUN, blood β2-MG, urine β2-MG, urine RBP, 24-hour urinary protein, and the expression of TGF-β1, Smad2, and Smad3 in renal tissue (P<0.05), as well as significant increases in the expression of Smad4 and Smad7 (P<0.05). Conclusion Taohe Chengqi Decoction can significantly improve renal function and reduce SCr, BUN, blood β2-MG, 24-hour urinary protein, urine β2-MG, and urine RBP in CRF rats. Taohe Chengqi Decoction can inhibit the protein expression of TGF-β1, Smad2, and Smad3 and promote the protein expression of Smad4 and Smad7 via its effects on the TGF-β/Smads signaling pathway and thus realize renal interstitial fibrosis.

Chronic renal failure; Taohe Chengqi Decoction; Uremic clearance granule; TGF-β/Smads

2013年度福建省中醫(yī)藥科技項(xiàng)目(wzsb201302)

張喜奎(1963-)，男，博士，教授

R692.5

10.3969/j.issn.2095-7246.2016.06.021

2016-04-07；編輯：曹健)