早勝牛GH基因多態(tài)性與其生長(zhǎng)發(fā)育性狀的相關(guān)性分析

張艷麗，容維中，徐建峰，任茂源，郭彬彬

(1.平?jīng)鍪修r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)檢驗(yàn)中心,甘肅 平?jīng)?74400;2.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?744000;3.華池縣草畜產(chǎn)業(yè)示范園區(qū)管理辦公室，甘肅 華池 745600)

?

早勝牛GH基因多態(tài)性與其生長(zhǎng)發(fā)育性狀的相關(guān)性分析

張艷麗1，容維中2*，徐建峰2，任茂源3，郭彬彬3

(1.平?jīng)鍪修r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)檢驗(yàn)中心,甘肅 平?jīng)?74400;2.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?744000;3.華池縣草畜產(chǎn)業(yè)示范園區(qū)管理辦公室，甘肅 華池 745600)

[目的]為研究GH基因多態(tài)性對(duì)早勝牛生長(zhǎng)發(fā)育性狀的影響，確定可用于肉牛新品種選育的優(yōu)勢(shì)基因型。[方法]采用PCR-SSCP方法和DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了GH基因第2外顯子及第5外顯子的遺傳多態(tài)性，應(yīng)用最小二乘線性模型分析了不同基因型與不同生長(zhǎng)階段體重、體尺及肉用指數(shù)的相關(guān)性。[結(jié)果]GH基因第2外顯子存在2處SNPs，產(chǎn)生了2個(gè)等位基因和3種基因型，多態(tài)信息含量為0.21，屬于低度多態(tài)；第5外顯子存在3處SNPs，產(chǎn)生2個(gè)等位基因了和2種基因型，多態(tài)信息含量為0.32，屬于中度多態(tài)。相關(guān)性分析表明，第2外顯子，初生重和6月齡重，BB型與AB顯著高于AA型(\%P\%<0.05)；周歲重，BB型顯著高于AA型與AB型(\%P\%<0.05)；第5外顯子，初生重、6月齡重、周歲重及肉用指數(shù)，CD型都顯著高于CC型(\%P\%<0.05)。[結(jié)論]GH基因第5外顯子多態(tài)性更為豐富，選擇潛力較大，可以作為早勝牛肉用方向選育的有效分子標(biāo)記。

早勝牛；GH基因；PCR-SSCP；生長(zhǎng)發(fā)育性狀；選育

畜禽遺傳資源對(duì)促進(jìn)畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展和豐富生物多樣性具有重要的科學(xué)意義與應(yīng)用價(jià)值。早勝牛是甘肅省隴東地區(qū)經(jīng)過(guò)30多年的實(shí)踐選育而成的優(yōu)良地方類群，具有較高的秦川牛血統(tǒng)，在生產(chǎn)性能和體型外貌上更加接近秦川牛，是甘肅省黃牛改良的當(dāng)家品種，于2009年列入甘肅省25個(gè)畜禽遺傳資源保護(hù)品種之一[1]。

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)研究影響畜禽經(jīng)濟(jì)性狀表達(dá)的功能基因及其多態(tài)性，并以此挖掘和利用地方品種的優(yōu)良特性，已成為動(dòng)物遺傳育種研究的熱點(diǎn)之一。生長(zhǎng)激素(GH)是由腦垂體分泌的一種具有廣泛生理功能的多肽類激素，對(duì)脊椎動(dòng)物的骨骼生長(zhǎng)及分化，糖類、蛋白質(zhì)及脂肪代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用[2-3]，研究表明[4-6]，GH基因多態(tài)性對(duì)畜禽生長(zhǎng)發(fā)育性狀及肉用性狀具有顯著影響。

本研究以挖掘早勝牛品質(zhì)內(nèi)涵和豐富遺傳多樣性為宗旨，采用PCR—SSCP檢測(cè)技術(shù)和DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)早勝牛GH基因第2外顯子及第5外顯子多態(tài)性進(jìn)行研究，并運(yùn)用最小二乘線性模型對(duì)不同基因型與生長(zhǎng)發(fā)育性狀的相關(guān)性進(jìn)行分析，以期確定可用于早期肉用性狀選育的優(yōu)勢(shì)基因型，并結(jié)合體型外貌選留優(yōu)秀個(gè)體組建核心群，加快甘肅肉牛新品種選育進(jìn)程，促進(jìn)優(yōu)良種質(zhì)資源的保護(hù)和集成創(chuàng)新。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及血樣采集

186頭體質(zhì)健康、發(fā)育良好的早勝牛(公牛63頭、母牛123頭)均來(lái)自慶陽(yáng)市寧縣興旺牧業(yè)有限責(zé)任公司，采用靜脈采血法每頭牛采集血樣6 mL，加入檸檬酸葡萄糖抗凝后低溫條件下帶回實(shí)驗(yàn)室，于-20 ℃保存待用。

1.2 DNA提取及檢測(cè)

采用Omegabiotek公司生產(chǎn)的D3471型血液DNA提取試劑盒對(duì)基因組DNA進(jìn)行提取，經(jīng)濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度，檢測(cè)合格的DNA樣品，用于PCR反應(yīng)。

1.3 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

采用Prime 5.0 軟件在GH基因第2外顯子及第5外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物，由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行合成。其中，第2外顯子引物序列(命名為GH-1)：上游5′-TTGGGCTTTAGGGCTTCCGAA-3′，下游5′- TGAACTCCTCAGTTTCCTCCC-3′；第5外顯子引物序列(命名為GH-2)：上游5′-TCTCCAAGCCTGTAG-3′，下游5′-GCTGGCAACTAGAAG-3′。

參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)[7]，優(yōu)化確定PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件(表1、表2)，PCR 產(chǎn)物經(jīng)濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

表1 PCR反應(yīng)體系

表2 PCR反應(yīng)程序

1.4 SSCP檢測(cè)及基因測(cè)序

取2 μL PCR產(chǎn)物與6 μL變性緩沖液(φ=98 %的甲酰胺、10 mmol/L EDTA、0.25 g/L的溴酚藍(lán)、0.25 g/L的二甲苯青)混勻，98 ℃變性10 min，冰浴5 min，然后上樣于φ=12 %和交聯(lián)度=29:1的非變性聚丙烯酰胺凝膠)，220 v 電壓4 ℃恒溫恒壓電泳16 h。根據(jù)銀染結(jié)果進(jìn)行判型，將不同基因型送至北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及數(shù)據(jù)處理

采用BioEdit軟件分析堿基突變情況，采用PopGen 32、PIC CALC V0.6軟件計(jì)算等位基因頻率、基因型頻率、群體純合度(Ho)、雜合度(He)和多態(tài)性信息含量(PIC)。

根據(jù)不同生長(zhǎng)階段，測(cè)定試驗(yàn)牛初生、1月齡、6月齡、周歲體重及周歲體高、體長(zhǎng)、胸圍、肉用指數(shù)等指標(biāo)，建立最小二乘線性模型，采用SPSS 13.0 軟件對(duì)GH基因不同基因型與生長(zhǎng)發(fā)育性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

最小二乘線性模型：

\%yijkmn=\%μ+\%Farmi+Breedj+Agek+Sexm+Markern+eijkmn\%

其中：yijkm 為個(gè)體表型記錄；μ為群體均值；Farmi為場(chǎng)別效應(yīng)；Breedj為品種效應(yīng)；Agek 為年齡效應(yīng)；Sexm為性別效應(yīng)；Markern為標(biāo)記基因型效應(yīng)；eijkm為隨機(jī)誤差。

2 結(jié)果

2.1 PCR-SSCP檢測(cè)

GH基因第2外顯子及第5外顯子擴(kuò)增結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰，無(wú)非特異性片段，且片段長(zhǎng)度與目的條帶大小基本一致(圖1、圖2)，可以進(jìn)行SSCP檢測(cè)。

圖1 GH第2外顯子PCR擴(kuò)增

經(jīng)SSCP檢測(cè)和DNA測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，與Genebank公布的GH基因核苷酸序列相比(登錄號(hào)：M57764)，第2外顯子及第5外顯子均存在多態(tài)性。其中：在第2外顯子發(fā)現(xiàn)了2處SNPs，產(chǎn)生了2個(gè)等位基因(A、B)和3種基因型(AA、BB、AB)；第5外顯子發(fā)現(xiàn)了3處SNPs，產(chǎn)生2個(gè)等位基因了(C、D)和2種基因型(CC、CD)。堿基突變情況見(jiàn)圖3、圖4，確定的基因型見(jiàn)圖5、圖6。

2.2 分子遺傳特性分析

從表3可以看出，GH基因第2外顯子，早勝牛群體中等位基因A和基因型AA的基因頻率和基因型頻率最高，分別為優(yōu)勢(shì)等位基因和優(yōu)勢(shì)等位基因型。群體純合度較高，多態(tài)信息含量為0.21，屬于低度多態(tài)。

圖3 GH基因第2外顯子不同基因型測(cè)序

圖4 GH基因第5外顯子不同基因型測(cè)序

圖5 GH基因第2外顯子SSCP檢測(cè)

圖6 GH基因第5外顯子SSCP檢測(cè)

表3 GH基因第2外顯子遺傳多態(tài)分析

由表4可見(jiàn)，GH基因第5外顯子，早勝牛群體中優(yōu)勢(shì)等位基因和優(yōu)勢(shì)等位基因型分別為C和CD，多態(tài)信息含量為0.32，屬于中度多態(tài)。

表4 GH基因第5外顯子遺傳多態(tài)分析

2.3 不同基因型與生長(zhǎng)發(fā)育性狀的相關(guān)性

從表5可以看出，GH基因第2外顯子，不同基因型與不同生長(zhǎng)階段體重、體尺及肉用指數(shù)呈相關(guān)性。其中：1月齡重、周歲體高、周歲體長(zhǎng)、肉用指數(shù)，3個(gè)基因型間差異不顯著(\%P\%>0.05)，但從平均數(shù)來(lái)看，以BB型最高；初生重和6月齡重，BB型與AB型間無(wú)顯著性差異(\%P\%>0.05)，但都顯著高于AA型(\%P\%<0.05)；周歲重，BB型顯著高于AA型與AB型(\%P\%<0.05)，且后者間差異不顯著(\%P\%>0.05)。

表5 GH基因第2外顯子不同基因型與生長(zhǎng)發(fā)育性狀關(guān)聯(lián)分析

由表6可見(jiàn)，GH基因第5外顯子，初生重、6月齡重、周歲重、肉用指數(shù)，CD型都顯著高于CC型(\%P\%<0.05)；1月齡重、周歲體高、周歲體長(zhǎng)、周歲胸圍，兩者間無(wú)顯著性差異(\%P\%>0.05)，但以CD型較高。

表6 GH基因第5外顯子不同基因型與生長(zhǎng)發(fā)育性狀關(guān)聯(lián)分析

3 分析與討論

畜禽遺傳資源是保護(hù)生物多樣性和培育新品種的重要生物資源。根據(jù)農(nóng)業(yè)部2004～2008年全國(guó)畜禽遺傳資源調(diào)查結(jié)果，我國(guó)現(xiàn)有牛種120個(gè)，其中地方品種94個(gè)，有38個(gè)品種的種群數(shù)量開(kāi)始下降，10個(gè)品種處于瀕危狀態(tài)和瀕臨滅絕，保種形勢(shì)不容樂(lè)觀。早勝牛作為甘肅省特有的地方類群，通過(guò)多年選育提高，形成了適應(yīng)隴東黃土高原自然環(huán)境的典型地域性，繼承了秦川牛的外貌特征和脂肪沉積好的優(yōu)良特性，具有培育現(xiàn)代肉牛的基礎(chǔ)和潛力。因此，在基因組水平上開(kāi)展早勝牛的肉用性能研究，充分挖掘其品質(zhì)內(nèi)涵，對(duì)地方牛種的遺傳改良和種質(zhì)資源創(chuàng)新是非常必要的。

本研究采用生子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)了早勝牛GH基因不同位點(diǎn)的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)第2外顯子存在2處SNPs和3種基因型，第5外顯子存在3處SNPs和2種基因型，這與耿榮慶[8]、李永紅[9]、高雪[10]等在其他牛種中的檢測(cè)結(jié)果類似，此外，也有GH基因在其它位點(diǎn)存在多態(tài)性的報(bào)道[11～12]，上述研究都表明GH基因具有豐富的多態(tài)性，可以作為研究畜禽遺傳多樣性的候選基因。

雜合度 (He)、多態(tài)信息含量(PIC) 的大小可以用來(lái)反映群體遺傳變異水平的高低，其數(shù)值越大，表明群體遺傳多樣性越豐富，選擇潛力更大。本研究表明， GH基因第2外顯子，早勝牛群體雜合度和多態(tài)信息含量分別為0.18和0.21，屬于低度多態(tài)；第5外顯子，群體雜合度和多態(tài)信息含量分別為0.13和0.32，屬于中度多態(tài)。這表明第5外顯子，早勝牛群體遺傳變異程度更高，多態(tài)性更為豐富，更適合作為經(jīng)濟(jì)性狀與基因型間連鎖分析的候選標(biāo)記。

關(guān)于GH基因多態(tài)性與生長(zhǎng)發(fā)育性狀的相關(guān)性報(bào)道較多，高雪等研究發(fā)現(xiàn)[5]，GH基因5′端，BB基因型對(duì)南陽(yáng)牛6～18月齡的體長(zhǎng)及體高呈顯著的正效應(yīng)。胡怡菲等[13]發(fā)現(xiàn)GH基因第5外顯子存在2處SNPs和3種基因型，且不同基因型個(gè)體在秦川牛體高、胸圍、體斜長(zhǎng)和尻長(zhǎng)上差異顯著(\%P\%<0.05)。谷朝勇報(bào)道[14]，魯西黃牛GH基因3′末端存在多態(tài)位點(diǎn)，且產(chǎn)生了3種基因型，AB基因型個(gè)體的體重、體高、體長(zhǎng)、胸圍和肉用指數(shù)顯著高于AA型和BB型(\%P\%<0.05)。本研究再次證實(shí)了上述觀點(diǎn)，相關(guān)性分析結(jié)果表明，GH基因第2外顯子和第5外顯子均存在多態(tài)性，且不同基因型與不同生長(zhǎng)階段體重、體尺及肉用指數(shù)具有相關(guān)性(\%P\%<0.05)，從早期選種的角度考慮，6月齡斷奶重和肉用指數(shù)，以BB型和CD型最高，在生產(chǎn)實(shí)踐中具有一定的參考價(jià)值。因此，在早勝牛肉用方向選育過(guò)程中，建議進(jìn)一步加大人工選擇強(qiáng)度，結(jié)合體型外貌線性評(píng)分，堅(jiān)決選留含有BB型和CD型的優(yōu)秀個(gè)體，淘汰其它基因型個(gè)體，通過(guò)導(dǎo)入外血、橫交固定、閉鎖繁育等手段，以穩(wěn)定遺傳其優(yōu)勢(shì)基因和優(yōu)良特性，提高群體同質(zhì)性和生產(chǎn)水平，加快培育具有甘肅地方特色的肉牛新品種，促進(jìn)當(dāng)?shù)厝馀．a(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效。

[1] 徐建峰,容維中,茍想珍,等.早勝牛種質(zhì)資源現(xiàn)狀調(diào)查與分析[J].中國(guó)牛業(yè)科學(xué),2015,41(6):69-72.

[2] Malveiro E,Pereira M,Marques P X,et al.Polymorphisms at the five exons of the growth hormone gene in the Algarvia goat:possible association with milk traits[J].Small Ruminant Research,2001,41(2):163-170.

[3] Marques P X,Pereira M,Marques M R,et al.Association of milk traits with SSCP polymorphisms at the growth hormone gene in the Serrana goat[J].Small Ruminant Research,2003(5):177-185.

[4] 王靖,劉穎,董文華,等.長(zhǎng)白豬和大白豬生長(zhǎng)激素基因多態(tài)性及其對(duì)部分經(jīng)濟(jì)性狀的影響[J].中國(guó)畜牧雜志,2014,50(11): 1-4.

[5] 高雪,徐秀容,任紅艷,等.不同基因型對(duì)南陽(yáng)牛生長(zhǎng)發(fā)育性狀的影響[J].遺傳, 2006,28(8):927-932.

[6] 張恩宇,羅玉柱,李少斌,等.甘肅高山細(xì)毛羊及其雜種羊GH基因第3內(nèi)含子多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2015,30(5):71-76.

[7] J.薩姆布魯克,D.W.拉塞爾.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)(上冊(cè))[M].黃培堂譯,3版,北京:科學(xué)出版社,2002:611-618.

[8] 耿榮慶,王蘭萍,常洪,等.牛生長(zhǎng)激素基因外顯子5序列變異及其分子進(jìn)化特征[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009,18(2):6-9.

[9] 李永紅,常洪, 耿榮慶, 等.雷瓊牛GH基因第五外顯子遺傳多樣性及其分化[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2007,27(12):5325-5329.

[10] 高雪,徐秀容,許尚忠,等.中國(guó)地方黃牛GH基因遺傳多態(tài)性研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2005,36(10)：991-995.

[11] 張春香,羅海玲,陳喻,等.南江黃羊GH基因外顯子3多態(tài)性及其對(duì)生長(zhǎng)性狀的影響[J].草食家畜,2007,(3):13-16.

[12] 郝靈慧.草原紅牛GH和GHR基因遺傳多態(tài)性研究及其與胴體性狀的相關(guān)分析[D].沈陽(yáng):吉林大學(xué),2008:45-73.

[13] 胡怡菲,昝林森,王洪寶,等.秦川牛GH基因第5外顯子的多態(tài)性及其與體尺性狀的關(guān)聯(lián)性[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2010,38(6): 46-55.

[14] 谷朝勇. 魯西黃牛GH基因3′末端序列多態(tài)性及其與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2010,37(10):144-147.

Association Analysis Between Polymorphism of GH Gene and Growth and Development Traits in Zaosheng cattle

ZHANG Yan-li1,RONG Wei-zhong2*,XU Jian-feng2,REN Mao-yuan3,GUO bin-bin3

(1.ExamingandInspectionCenterforAgriculturalProductsSafetyandQualityinPingLiangCity,PingLiang,Gansu, 744000;2.AnimalHusbandryandVeterinaryResearchInstituteinGansuProvince,PingLiang,Gansu, 744000;3.ManagementofficewithForagelivestockindustrydemonstrationzoneinHuachicounty,Huachi,Gansu, 745600 )

[Objective] In order to study the polymorphism of GH gene and its influence with growth and development traits of Zaosheng cattle. [Method] PCR-SSCP and DNA sequencing technologies were conducted to detect heredity polymorphism of GH gene in exon 2 and exon 5 with Zaosheng cattle, and analyzed the correlation of different genotypes with growth and development traits by Least squares linear model. [Result] There were two base mutations of exon 2 which lead to two alleles and three genotypes with achieving low polymorphism, and three base mutations of exon 5 which lead to two alleles and two genotypes with achieving intermediate plymorphism. Birth weight and body weight of six months old with BB genotype and AB genotype were significantly higher than that of AA genotype(\%P\%<0.05), and yearling weight with BB genotype was significantly higher than that of AA genotype and AB genotype(\%P\%<0.05)in exon 2, and Birth weight, body weight of six months old, yearling weight and Beef production index with CD genotype was significantly higher than that of CC genotype(\%P\%<0.05)in exon 5.[Conclusion] Polymorphism of GH gene within exon 5 was more abundant than that of exon 2, and it could be considered as maker to beef performance breeding with Zaosheng cattle.

Zaosheng cattle; GH gene; RCP-SSCP; growth and development traits; Breeding

2016-03-20

2016-03-25

甘肅省技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)專項(xiàng)計(jì)劃(項(xiàng)目編號(hào)：1207TCYL016)。

張艷麗(1983-)，女，漢，甘肅靜寧人，農(nóng)藝師，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)。

*通訊作者：容維中(1965-)，男，漢，甘肅平?jīng)鋈?，副研究員，研究方向?yàn)閯?dòng)物營(yíng)養(yǎng)及牛羊繁殖技術(shù)。

S823

A

1001-9111(2016)04-0013-05