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    生石花植株離體再生及組培快繁研究

    2016-12-22 06:22:56牟豪杰呂永平汪一婷李海營
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年33期
    關(guān)鍵詞:石花增殖率離體

    牟豪杰, 王 燕, 呂永平, 汪一婷, 李海營

    (浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所,浙江杭州 310021)

    Note:Different lowercases in the same column stand for significant difference among different culture medium(P<0.05).

    Note: Different lowercases in the same column stand for significant difference among different culture medium(P<0.05).

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    生石花植株離體再生及組培快繁研究

    牟豪杰, 王 燕, 呂永平, 汪一婷*, 李海營

    (浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所,浙江杭州 310021)

    [目的]建立生石花植株離體再生及組培快繁體系。[方法]以生石花成熟種子為外植體,研究生石花組培快繁技術(shù)。[結(jié)果]萌發(fā)后的幼苗在MS+0.50 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA培養(yǎng)基上被成功誘導(dǎo)出愈傷組織;不添加6-BA的MS培養(yǎng)基有利于愈傷組織的分化,不定芽誘導(dǎo)率為4.65;在MS +0.05 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA培養(yǎng)基上不定芽增殖率較高,可達(dá)5.60。[結(jié)論]建立了生石花植株離體再生及快繁體系,有利于生石花種質(zhì)資源保護(hù)和工廠化生產(chǎn)。

    生石花;愈傷組織;離體再生;增殖;生根

    生石花(Lithopssp.)為番杏科生石花屬植物,原產(chǎn)于非洲南部、南非納米比亞等極度干旱少雨的沙漠礫石地帶。生石花變態(tài)葉肥厚,形如彩石,嬌小玲瓏,新穎奇特,享有“有生命的石頭”的美稱,成為眾多愛好者收集蒔養(yǎng)的觀賞多肉植物[1-3]。生石花繁殖主要采用播種和分株方式,但其種子細(xì)小,生長速度緩慢,從萌發(fā)到開花至少需要3年;而分株方式繁殖率較低,實際生產(chǎn)栽培中使用較少[4-5]。此外,人類過度采掘和對其原產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境的破壞導(dǎo)致生石花野生資源減少,這使其推廣和應(yīng)用受到很大限制。植物組織培養(yǎng)方法可以在短期內(nèi)使植物快速繁殖,并縮短植物生長發(fā)育周期。目前對于生石花組織培養(yǎng)研究仍處于探索階段,對其植株離體再生及組培快繁的研究鮮見報道[6-7]。筆者對生石花組培快繁技術(shù)進(jìn)行研究,對于保存生石花種質(zhì)資源和實現(xiàn)其規(guī)模化生產(chǎn)具有重要意義。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料 細(xì)紋生石花(Lithopsgracilidelineata)的自交種子由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院組培中心溫室提供。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 外植體的消毒及接種。以生石花種子為外植體,將其置于2 mL PE離心管中進(jìn)行消毒處理,先用洗潔精浸泡0.5 h后再用自來水清洗,然后在70%乙醇和有效氯濃度為1% 的次氯酸鈉溶液中分別浸泡30 s和6 min,最后用無菌水沖洗3~5遍,每遍2 min (移液槍操作)。

    將消毒處理后的種子在超凈工作臺中接種至MS基本培養(yǎng)基(MS+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂,pH 5.8)上培養(yǎng),待種子萌發(fā)后形成幼苗。

    1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)。將生石花幼苗轉(zhuǎn)接至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo),誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂+6-BA 0.50 mg/L +NAA 0.05 mg/L,pH 5.8。

    1.2.3 愈傷組織的分化。將誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的增殖,將愈傷組織接種至分化培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽的分化。分化培養(yǎng)基: MS+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂,添加不同濃度的6-BA(0、0.01、0.05、0.10 mg/L),pH 5.8。每瓶接種4塊愈傷組織,每組5瓶,35 d后觀察愈傷組織的分化情況并統(tǒng)計不定芽的誘導(dǎo)率。培養(yǎng)條件:溫度(23±2) ℃,光照強(qiáng)度40 μmol/(m2·s),光照時間10 h/d。

    1.2.4 不定芽的增殖。將愈傷組織分化產(chǎn)生的不定芽接種至3種增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng),增殖培養(yǎng)基:MS+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂,添加不同濃度的6-BA和NAA,pH 5.8。每瓶接種4個,每組5瓶,35 d后觀察不定芽的誘導(dǎo)情況并統(tǒng)計增殖率。培養(yǎng)條件:溫度(23±2)℃,光照強(qiáng)度60 μmol/(m2·s),光照時間12 h/d。

    1.2.5 壯苗生根及移栽。將增殖不定芽叢分割成單株后轉(zhuǎn)接至壯苗生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基:MS+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂+0.10 mg/L NAA,pH 5.8。培養(yǎng)條件:溫度(23±2)℃,光照強(qiáng)度60 μmol/(m2·s),光照時間12 h/d。

    將生根植株從培養(yǎng)基中取出并清洗后,置于陰涼通風(fēng)處晾干2~5 d至表皮微皺,然后移栽至基質(zhì)中。

    1.3 數(shù)據(jù)處理及分析 不定芽誘導(dǎo)率=愈傷組織分化產(chǎn)生的不定芽總數(shù)/接種的愈傷組織總塊數(shù)×100%。不定芽增殖率=增殖出的不定芽總數(shù)/接種的芽數(shù)×100%。

    使用SPSS統(tǒng)計分析軟件包(SPSS Inc, Chicago, USA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析(LSD)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 6-BA濃度對愈傷組織分化的影響 接種14~28 d生石花種子陸續(xù)萌發(fā),培養(yǎng)35~49 d成為幼苗(圖1 A)。幼苗轉(zhuǎn)接至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)14~21 d形成黃綠色的愈傷組織(圖1 B),培養(yǎng)28~35 d更換新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行繼代增殖,然后挑取生長狀態(tài)較好的愈傷組織置于分化培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)(圖1 C)。培養(yǎng)35 d后,愈傷組織的分化情況見表1。由表1可知,愈傷組織在基本培養(yǎng)基A上培養(yǎng)時,不定芽的誘導(dǎo)率為4.65;在6-BA濃度為0.01 mg/L的培養(yǎng)基B上培養(yǎng)時不定芽的誘導(dǎo)率為2.80;隨著培養(yǎng)基 C、D中6-BA濃度的升高,愈傷組織的分化率逐漸降低,生石花不定芽的誘導(dǎo)率降低。因此,6-BA的添加不利于生石花不定芽的誘導(dǎo)。

    注:A. 生石花幼苗;B.愈傷組織的誘導(dǎo);C.不定芽的分化;D.壯苗生根。Note: A. Young seedling; B. Callus induction; C. Differentiation of adventitious bud; D. Rooting culture.圖1 生石花組培再生體系的建立Fig.1 Plantlet regeneration in vitro of L. gracilidelineata

    Table 1 The effects of 6-BA concentration on the callus differentiation ofL.gracilidelineata

    培養(yǎng)基Culturemedium6-BA濃度6-BAconcen?trationmg/L愈傷接種數(shù)Inoculationnumber∥個分化芽數(shù)Differentiationbuds∥個誘導(dǎo)率InductionrateA020934.65±1.03aB0.0120562.80±0.54bC0.0520341.70±0.37cD0.1020110.55±0.41d

    注:同列不同小寫字母表示不同培養(yǎng)基間差異顯著(P<0.05)。

    Note:Different lowercases in the same column stand for significant difference among different culture medium(P<0.05).

    2.2 不同培養(yǎng)基對不定芽增殖的影響 將在培養(yǎng)基A中分化出的不定芽叢分割成單株后轉(zhuǎn)接至3種增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng),35 d后生石花不定芽的誘導(dǎo)情況見表2。由表2可知,不定芽在培養(yǎng)基E上的增殖率為3.85,在培養(yǎng)基F上的增殖率為5.60,且芽體生長健壯,而在培養(yǎng)基G中的增殖率僅為2.65,且部分增殖不定芽出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。由此可知,培養(yǎng)基F是適合生石花增殖的培養(yǎng)基。

    2.3 移栽成活率 將生石花的增殖不定芽叢分割成單株后轉(zhuǎn)接至壯苗生根培養(yǎng)基上培養(yǎng),35~56 d可獲得健壯的生石花有根種苗,將生根植株從培養(yǎng)基中取出并清洗后,置于陰涼通風(fēng)處晾干2~5 d至表面微皺,然后移栽至基質(zhì)中進(jìn)行栽培,移栽成活率可達(dá)90%以上(圖1D)。

    表2 不同培養(yǎng)基對生石花不定芽增殖的影響

    注:同列不同小寫字母表示不同培養(yǎng)基間差異顯著(P<0.05)。

    Note: Different lowercases in the same column stand for significant difference among different culture medium(P<0.05).

    3 結(jié)論與討論

    該研究通過愈傷組織間接再生途徑獲得了生石花的再生植株,并建立了生石花的快繁體系。結(jié)果顯示,6-BA的添加不利于生石花愈傷組織的分化,而MS+0.05 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA是適合生石花增殖的最佳培養(yǎng)基,不定芽增殖率可達(dá)5.60,且植株生長健壯。將生石花的增殖不定芽叢分割成單株后轉(zhuǎn)接至壯苗生根培養(yǎng)基上培養(yǎng),35~56 d可獲得健壯的生石花有根種苗,將生根植株從培養(yǎng)基中取出并清洗后,置于陰涼通風(fēng)處晾干2~5 d至表皮微皺,然后移栽至基質(zhì)中進(jìn)行栽培,移栽成活率可達(dá)90%以上。

    目前,研究者對生石花屬植物的組織培養(yǎng)研究僅停留在獲得無菌材料的水平,尚無建立生石花組培快繁體系的成功報道[6-7]。該研究建立了生石花植株的離體再生及快繁體系,對促進(jìn)生石花種質(zhì)資源保護(hù)和工廠化生產(chǎn)具有重要意義。參考文獻(xiàn)

    [1] HAMMER S.Lithops flowering stones[J]. Cactus & succulent journal,2005,77(4):194-195.

    [2] 姚鴻年, 陸琰.生石花(續(xù)一)三、生石花的培植要點[J]. 中國花卉盆景,2008(1):22-23.

    [3] 孫寧.播種生石花[J].中國花卉盆景,2012(6):24-25.

    [4] 兌寶峰.生石花的栽培繁殖[J].中國花卉園藝,2006(24):14-16.

    [5] 嚴(yán)霖, 羅清, 梁春,等.生石花屬植物栽培繁殖[J].農(nóng)業(yè)研究與應(yīng)用,2016(2):78-80.

    [6] 徐慶華, 范冬春. 多肉類植物試管微型花卉研究初報[J].農(nóng)業(yè)工程技術(shù)(溫室園藝),2009(9):62.

    [7] 范麗楠, 張宗申, 劉平武.生石花種子萌發(fā)及幼苗生長最優(yōu)條件的篩選[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,44(18):123-126.

    Plantlet Regenerationinvitroand Rapid Propagation ofLithopssp.

    MOU Hao-jie, WANG Yan, LU Yong-ping, WANG Yi-ting*et al

    (Institute of Virology and Biotechnology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou, Zhejiang 310021)

    [Objective] The aim was to establish plantlet regenerationinvitroand rapid propagation ofLithopssp. [Method] With mature seeds as explant, rapid propagation technique ofLithopssp. was studied. [Result] Calli were induced from the young seedling on MS medium+0.50 mg/L 6-BA+ 0.05 mg/L NAA in this study. The results showed that the basic MS medium without 6-BA benefited the callus differentiation ofLithopssp., and the induction ratio of adventitious bud was 4.65; MS+0.05 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA was the optimal medium for the multiplication of adventitious bud, and the multiplication ratio was 5.60. [Conclusion] The plantlet regeneration and rapid propagation system ofLithopssp. were established, which has important guiding significance for the germplasm protection and industrial production ofLithopssp..

    Lithopssp.;Callus; Regenerationinvitro; Proliferation; Rooting

    引進(jìn)國際先進(jìn)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)計劃(948)項目(2011-G31);浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年人才培養(yǎng)項目(2015R21R08E08)。

    牟豪杰(1977- ),男,浙江杭州人,助理研究員,從事植物組培產(chǎn)業(yè)化研究。*通訊作者,副研究員,碩士,從事生物技術(shù)方面的研究。

    2016-10-12

    S 604

    A

    0517-6611(2016)33-0143-02

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