1個(gè)廣譜抗真菌天然產(chǎn)物的快速鑒定及活性評價(jià)

萬中義,張亞妮,張志剛,黃大野,王開梅,楊自文

(湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心/湖北農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心生物農(nóng)藥分中心，湖北武漢 430064)

Note:9.Complete inhibition; 7.Most inhibition.

Note:9.Complete inhibition; 7.Most inhibition; 3.Part inhibition; 0.No inhibition.

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1個(gè)廣譜抗真菌天然產(chǎn)物的快速鑒定及活性評價(jià)

萬中義,張亞妮,張志剛,黃大野,王開梅*,楊自文

(湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心/湖北農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心生物農(nóng)藥分中心，湖北武漢 430064)

[目的]對湖北咸寧地區(qū)山坡土樣中分離得到的1株放線菌HBERC-31270的發(fā)酵提取物進(jìn)行快速鑒定及活性評價(jià)。[方法]對HBERC-31270進(jìn)行發(fā)酵與提取，并對發(fā)酵提取物進(jìn)行生物活性測定、高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)、紫外吸收光譜(UV)分析及活性評價(jià)。[結(jié)果]提取物高效液相色譜(HPLC)制備組分活性測定結(jié)果表明，其活性部位在14～21 min。根據(jù)HPLC-MS及UV確定其主要成分為一個(gè)小分子化合物。通過對其質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析確定了分子離子峰，經(jīng)天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫比對及文獻(xiàn)調(diào)研，確定其主要活性成分為9-甲基鏈米酮。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌對多種作物真菌性病害具有較好的防治效果。[結(jié)論]試驗(yàn)結(jié)果為放線菌HBERC-31270的進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)。

天然產(chǎn)物；農(nóng)藥活性；放線菌；9-甲基鏈米酮

在生物農(nóng)藥的研究開發(fā)工作中，放線菌產(chǎn)生的天然產(chǎn)物是其重要的來源[1-2]。一方面，放線菌可直接通過發(fā)酵及后處理制成生物農(nóng)藥，如阿維菌素[3-5]、多殺菌素[6]、井岡霉素[7-8]等；另一方面，以天然產(chǎn)物為模板，對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化改造，是研發(fā)高效低毒綠色農(nóng)藥的另一途徑，如甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑[9]就是以擔(dān)子菌產(chǎn)生的strobilurin[10]為先導(dǎo)化合物經(jīng)人工改造而獲得。隨著人們對環(huán)境中微生物資源的不斷挖掘，重復(fù)發(fā)現(xiàn)已知化合物的概率越來越高，獲得新活性化合物的難度越來越大。因此，從大量樣品中對活性化合物進(jìn)行快速鑒定成為發(fā)現(xiàn)新化合物的關(guān)鍵。

HBERC-31270是湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心在天然產(chǎn)物篩選過程中，從湖北咸寧地區(qū)采集的土樣中分離出的1株放線菌，經(jīng)生物活性測定，其發(fā)酵提取物對多種農(nóng)業(yè)真菌病原具有強(qiáng)烈的抑制活性。筆者對其發(fā)酵提取物進(jìn)行制備及收集，獲得了不同時(shí)間流出的樣品共36份，通過生物測定確定其活性成分部位，通過高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)分析、天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫比對及文獻(xiàn)調(diào)研對活性產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了快速鑒定，并通過盆栽試驗(yàn)對其進(jìn)行了生物活性評價(jià)，以期為該菌的進(jìn)一步研究與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種。放線菌HBERC-31270分離自湖北咸寧采集的山坡樹林根際土，土樣編號為S-1699，由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心分離保藏。農(nóng)藥活性測定用指示真菌包括番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea，BOTCIN)、水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani，RHISOL)、黃色鐮刀菌(Fusariumculmorum，F(xiàn)USCUL)、小麥穎枯病菌(Septorianodorum，SEPNOD)、番茄早疫病菌(Alternariasolani，ALTSOL)、蠶豆銹病菌(Uromycesfabae，UROFAB)。

1.1.2 培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基：ISP-2培養(yǎng)基。采用18 mm×180 mm 玻璃試管，每管裝瓊脂培養(yǎng)基8～10 mL。種子培養(yǎng)基：同ISP-2，不加瓊脂。采用500 mL帶擋板三角瓶，每瓶裝培養(yǎng)基100 mL,121 ℃滅菌30 min。發(fā)酵培養(yǎng)基：主要成分為葡萄糖、棉籽蛋白、酵母浸粉等。采用500 mL帶擋板三角瓶，每瓶裝培養(yǎng)基100 mL，121 ℃滅菌30 min。

1.1.3 主要儀器與數(shù)據(jù)庫。Ly-0.8型冰凍干燥機(jī)，上海東富龍科技有限公司生產(chǎn)；Waters高效制備液相色譜儀(Waters 2525泵，帶2767自動收集系統(tǒng)，2996二極管陣列式檢測器)；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，采用Waters 2695高效液相色譜儀(Waters 2996 二極管陣列式檢測器)、Micromass Quattro micro?質(zhì)譜儀(電噴霧離子源ESI)以及Masslynx V4.1液質(zhì)聯(lián)用分析軟件；查普曼天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫2003版。

1.2 方法

1.2.1 菌株搖瓶發(fā)酵。從斜面取8～10 mm的1塊菌苔轉(zhuǎn)移至種子搖瓶中，置于28 ℃、150 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床上振蕩培養(yǎng)72～96 h，按10%(V/V)的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于28 ℃、150 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床上振蕩培養(yǎng)100～120 h，即完成發(fā)酵。

1.2.2 發(fā)酵液凍干與提取。將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至不銹鋼凍干盒中，置于凍干機(jī)中冰凍干燥，凍干條件為：-40 ℃預(yù)凍2 h，將冷阱預(yù)冷至-45 ℃以下，然后開啟真空泵升華。真空度為50～90 Pa，升溫速率為2～3 ℃/h，極限溫升為37 ℃。凍干完成后，轉(zhuǎn)移至三角瓶中，先用少量50%甲醇-水濕潤，再加入100 mL乙酸乙酯，于搖床上180 r/min振蕩萃取1 h，分離出乙酸乙酯相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去溶劑，以少量甲醇溶解，12 000 r/min離心3 min，取上清液送HPLC-MS分析。

1.2.3 提取物生物活性測定。取一定量發(fā)酵提取物，加入乙醇溶解，以純水稀釋至一定濃度后，用96孔板進(jìn)行生物活性測試。組分活性測試采用相同的靶標(biāo)及方法。

1.2.4 提取物液質(zhì)聯(lián)用分析。色譜柱為美國Sunfire C18柱，150.0 mm×2.1 mm(i.d)，粒徑為3.5 μm，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為2 μL，流動相為超純水和色譜純乙腈，梯度洗脫。質(zhì)譜檢測條件：電噴霧電離(ESI)，毛細(xì)管電壓為3.5 kV，錐孔電壓為70 V，離子源溫度為100 ℃，干燥氣溫度為300 ℃,脫溶劑氣體流速為500 L/h，錐孔氣體流速為50 L/h。

1.2.5 提取物鑒定。根據(jù)組分活性測定結(jié)果，確定活性成分的保留時(shí)間，從高效液相色譜(HPLC)中精確提取活性物質(zhì)的紫外吸收光譜，確定吸收峰的波長。從正、負(fù)離子流圖譜中可判定目標(biāo)產(chǎn)物的分子離子峰。將吸收峰波長及分子量輸入Chapman天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫，查詢同該物質(zhì)性質(zhì)相同或相近的化合物名稱及其結(jié)構(gòu)式，通過理化及生物學(xué)性質(zhì)，確定活性化合物的種類及結(jié)構(gòu)式。

1.2.6 發(fā)酵液室內(nèi)活性評價(jià)。采用對峙法。

抑菌率=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對照組菌落直徑-菌餅直徑)×100%

1.2.7 發(fā)酵液盆栽活性評價(jià)。采用小麥、蠶豆、番茄幼苗，進(jìn)行HBERC-31270發(fā)酵液的盆栽活性評價(jià)。供試幼苗均在室內(nèi)培養(yǎng)14 d左右。將發(fā)酵液加入0.1%吐溫-80后噴于幼苗葉面，24 h后接入病原菌孢子。以清水加0.1%吐溫-80為空白對照，7 d后進(jìn)行調(diào)查。

分級方法：0級，葉片無病斑；1級，病斑面積占葉片面積的5%以下；3級，病斑面積占葉片面積的6%～10%；5級，病斑面積占葉片面積的11%～20%；7級，病斑面積占葉片面積的21%～50%；9級，病斑面積占葉片面積的50%以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 HBERC-31270發(fā)酵提取物的農(nóng)藥活性 從表1、2可知，具有抗真菌活性的組分出現(xiàn)在14～21 min，其余組分無活性。

表1 HBERC-31270粗提物農(nóng)藥活性

注：9表示完全抑制；7表示大部分抑制。

Note:9.Complete inhibition; 7.Most inhibition.

表2 HBERC-31270制備組分活性

注：9表示完全抑制；7表示大部分抑制；3表示部分抑制；0表示無活性。

Note:9.Complete inhibition; 7.Most inhibition; 3.Part inhibition; 0.No inhibition.

2.2 HBERC-31270提取物的HPLC及紫外吸收光譜(UV) 由圖1、2可知，保留時(shí)間為16.60 min的化合物紫外吸收峰為237、292 nm，該吸收光譜特征明顯，最強(qiáng)吸收峰(237 nm)的吸光強(qiáng)度為1.0，比弱峰(292 nm，吸光強(qiáng)度為0.1)高出約10倍，該特征為紫外吸收光譜的重要特征(相當(dāng)于摩爾吸光系數(shù)ε)。

2.3 HBERC-31270活性產(chǎn)物的質(zhì)譜(MS) 由圖3可知，在正離子流中m/z616.4處有1個(gè)強(qiáng)峰，m/z633.2處有1個(gè)次強(qiáng)峰，一般情況下，可能會將這2個(gè)峰之一作為分子離子峰。不過，由于MS的特征，常會出現(xiàn)2個(gè)分子結(jié)合在一起形成質(zhì)譜峰，即產(chǎn)物的分子量約為該值的50%。在負(fù)離子流中，最高豐度為m/z307.1，正離子流中對應(yīng)峰為m/z308.9。根據(jù)MS特征，判定該峰為產(chǎn)物分子離子峰，即該產(chǎn)物的分子量為308.00 Da。

2.4 活性化合物的快速鑒定 將化合物分子量及紫外吸收峰波長輸入Chapman化合物數(shù)據(jù)庫查詢，條件為分子量在307～309，紫外吸收峰值波長23*和 29*(*號代表任意值，考慮到不同儀器間的誤差)。查詢得到3個(gè)化合物，1個(gè)來自放線菌，另外2個(gè)來自其他植物，據(jù)此初步判斷活性產(chǎn)物為源于放線菌的9-甲基鏈米酮，其分子量為307.38 Da。

圖1 HBERC-31270提取物HPLC-MS圖譜Fig.1 HPLC-MS spectrum analysis of HBERC-31270 extract

圖2 活性化合物的UV圖譜Fig.2 The ultraviolet absorption spectrum of active compounds

查詢文獻(xiàn)[11-12]可知，9-甲基鏈米酮的摩爾吸光系數(shù)ε(λ230 nm)為23 100，ε(λ291 nm)為790，與該菌株活性產(chǎn)物紫外光譜相似。

確定該化合物分子式為C17H25NO4，其結(jié)構(gòu)式如圖4所示。2.5 HBERC-31270室內(nèi)及田間活性評價(jià) 由圖5、6可知，HBERC-31270不僅對常見農(nóng)作物真菌病害如番茄灰霉病、水稻紋枯病等具有較好的抑制效果，對小麥白粉病、蠶豆銹病等也具有較好的防治效果。

3 討論

進(jìn)行天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的鑒定通常需要四大光譜，即紅外光譜、紫外光譜、質(zhì)譜和核磁共振譜。紅外光譜提供了化合物分子振動的信息，紫外光譜則是分子內(nèi)部電子能級躍遷的

圖3 活性產(chǎn)物的MS圖譜(保留時(shí)間=16.60 min)Fig.3 MS of active compounds (16.60 min)

圖4 9-甲基鏈米酮的結(jié)構(gòu)式Fig.4 The chemical formula of 9-methylstreptimidone

圖5 HBERC-31270室內(nèi)活性評價(jià)結(jié)果Fig.5 Evaluation results of indoor activity of HBERC-31270

圖6 HBERC-31270盆栽活性評價(jià)結(jié)果Fig.6 Evaluation results of pot test of HBERC-31270

結(jié)果，質(zhì)譜提供了分子離子及其碎片的信息，核磁共振譜則體現(xiàn)了化合物中化學(xué)鍵的關(guān)系。紅外及核磁共振譜的獲得

需要有一定量的純化合物(純度95%以上，質(zhì)量2 mg以上)，并進(jìn)行高分辨質(zhì)譜、氫譜、碳譜分析及結(jié)構(gòu)解析，這些化合物的獲得需要進(jìn)行發(fā)酵、提取、精制等程序，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，所以采用四大光譜進(jìn)行化合物的鑒定非常耗時(shí)。一般鑒定1個(gè)未知化合物需要1至數(shù)月甚至更長時(shí)間。

在微生物源天然產(chǎn)物的篩選過程中，由于篩選到的絕大多數(shù)活性化合物均已知，如對每一活性化合物進(jìn)行四大光譜分析，則費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此，在篩選過程中，進(jìn)行化合物的快速早期鑒別，對天然產(chǎn)物的研究開發(fā)具有重要意義。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，9-甲基鏈米酮屬亞胺類天然產(chǎn)物，具有廣譜抗真菌活性，并有抗病毒活性，且毒性明顯低于同類天然產(chǎn)物放線菌酮(環(huán)己酰亞胺)。同后者相比，國內(nèi)極少見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。由于其良好的抗真菌活性和較低的毒副作用，推測該產(chǎn)物具有良好的應(yīng)用開發(fā)前景。參考文獻(xiàn)

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Rapid Identification and Activity Evaluation of a Broad Spectrum Antifungal Natural Products

WAN Zhong-yi,ZHANG Ya-ni,ZHANG Zhi-gang,WANG Kai-mei*et al

(Hubei Biopesticide Engineering Research Center/The Branch Center of Biopesticide,Hubei Agricultural Sciences and Technology Innovation Center,Wuhan,Hubei 430064)

[Objective] Rapid identification and activity evaluation were carried out for the fermentation extracts of a strain HBERC-31270 which was isolated from a soil sample collected in Xianning,Hubei province.[Method] The strain HBERC-31270 was fermented and extracted,and bio-activity determination,HPLC-MS,UV spectrum analysis and activity evaluation were carried out for the fermentation extracts.[Result] It was determined by components bioassay that the active compounds were in between 14-21 min in HPLC profile,and the compounds were identified as 9-methylstreptimidone on the basis of MS,UV absorption spectrum and natural product dictionary.It was found by pot test that the fermentation broth was very effective against a variety of fungal diseases.[Conclusion] The results provide theoretical basis for the further study of actinomycetes HBERC-31270.

Natural products; Pesticide activity; Actinomycetes; 9-methylstreptimidone

湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心項(xiàng)目(2016-620-000-001-039)。

萬中義(1964- )，男，湖北天門人，研究員，博士,從事微生物天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。*通訊作者，研究員，碩士，從事天然產(chǎn)物研究。

2016-09-21

S 482.2+92

A

0517-6611(2016)33-0009-03