潛流式人工濕地消納城市污水廠尾水微生物特性及機制

胡林潮，周新程，鄧文，陳萍，陳晶，張文藝

(1.常州大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇 常州，213164； 2.常州市環(huán)境科學(xué)研究院，江蘇 常州，213022)

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潛流式人工濕地消納城市污水廠尾水微生物特性及機制

胡林潮1，2，周新程1，鄧文1，陳萍1，陳晶1，張文藝1

(1.常州大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇 常州，213164； 2.常州市環(huán)境科學(xué)研究院，江蘇 常州，213022)

為揭示潛流式人工濕地消納城市污水廠尾水微生物特性及機制，以位于常州市城北污水處理廠內(nèi)的潛流式人工濕地消納城市污水廠尾水旁路試驗系統(tǒng)中的植物根系、濕地填料及濕地土壤中微生物為研究對象，通過鏡檢、脲酶、磷脂脂肪酸(PLFA)等分析手段對其進行相關(guān)研究。結(jié)果表明，植物根系、填料中含有團藻等菌膠團和輪蟲、變形蟲等原生動物，團藻等菌膠團通過自身新陳代謝及光合作用，利用尾水中N、P進行生物代謝，去除低碳源條件下尾水中的N、P等。濕地脲酶平均含量(N)約為22.43 mg/g，其活性與TN的去除呈線性相關(guān)，活性越高，TN去除率越高。消納城市污水廠尾水濕地填料中飽和脂肪酸(PLFA)含量為99.30%，不飽和脂肪酸含量僅為0.70%，這與潛流式人工濕地處理城市污水中的PLFA含量有很大差別(分別為76.97%、23.03%)。以脂肪酸生物標記量為指標，顯示濕地填料中形成了以好養(yǎng)細菌為優(yōu)勢種群的微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)。團藻、好氧微生物是低碳源尾水中TN等污染物去除的主要載體微生物。

尾水; 磷脂脂肪酸; 脲酶; 人工濕地

潛流式人工濕地生態(tài)消納城市污水廠尾水技術(shù)近年來在中國南方地區(qū)一些污水處理廠提標改造中得到應(yīng)用，該技術(shù)主要通過濕地基質(zhì)、濕地植物、微生物的協(xié)同作用對污水廠尾水進行消納[1-4]。由于城市污水廠尾水碳含量低，總氮及硝酸鹽氮含量較高，C、N、P營養(yǎng)比約為54∶17∶1，難以達到傳統(tǒng)生物法處理城市污水微生物所需C、N、P營養(yǎng)比100∶5∶1。這種基于濕地填料多因素協(xié)同作用下的尾水生態(tài)消納，其微生物特性與傳統(tǒng)潛流式人工濕地處理城市污水可能存在差異。有關(guān)濕地土壤層微生物特性的研究已有報道，崔偉等[5]通過對濕地脲酶活性的測定有可能建立衡量濕地去除效果的模式體系，且得出濕地脲酶活性與TN去除率呈正相關(guān)性；Sanz-Cobena等[6]研究表明土壤有機氮轉(zhuǎn)化為無機氮的強度可用脲酶活性來反映，脲酶活性是評價氮素轉(zhuǎn)化機制的指標之一；王震宇等[7]通過DAPI染色法、FDA染色法和稀釋平板法發(fā)現(xiàn)黃河三角洲退化濕地微生物數(shù)量、活性及多樣性與土壤鹽度呈顯著負相關(guān)；Richard等[8]通過PLFA譜圖研究發(fā)現(xiàn)真菌在低肥力的土壤生化過程中發(fā)揮重要作用。

潛流式人工濕地主要通過濕地微生物消納城市污水廠尾水，對尾水有一定的脫氮除磷效果，在中國已有應(yīng)用[9]，但在低碳源條件下對濕地微生物的研究報道相對較少。本研究以潛流式人工濕地消納城市污水廠尾水為試驗研究對象，通過鏡檢濕地介質(zhì)(填料、底泥土壤、植物根系等)中的生物膜，檢測濕地土壤脲酶活性和磷脂脂肪酸(PLFA)指標，揭示低碳源、高總氮、高硝酸鹽氮條件下潛流式人工濕地微生物功能、活性、多樣性和群落結(jié)構(gòu)等方面特性。

1 材料與方法

1.1 尾水消納旁路試驗系統(tǒng)及其運行效果

試驗地點為江蘇省常州市城北污水處理廠內(nèi)，如圖1所示。

圖1 濕地旁路試驗建造點Fig.

人工濕地剖面如圖2所示。濕地呈長方體結(jié)構(gòu)，寬(B)2.0 m，總長(L)8.0 m，深(H)1.5 m。其中進水池長(L1)0.5 m，調(diào)節(jié)池長(L2)0.5 m，人工濕地主體長(L3)6.0 m，沉淀池長(L4)0.5 m，集水池長(L5)0.5 m，孔隙率40%，有效容積9.6 m3，日處理水量為5～8 m3，水力負荷0.31～0.50 m3/(m2·d)。尾水依次流過濕地進水池、調(diào)節(jié)池、濕地主體，最后進入收集池，通過管道輸送至尾水排放口。通過流量計和調(diào)節(jié)閥門控制進水流量.濕地內(nèi)部采用石灰石、鋼渣、陶粒、紅磚作為濕地填料，充填高度1.2 m，填料上部鋪設(shè)無紡布，再在無紡布上層鋪0.25 m厚土壤，種植黃花鳶尾、菖蒲、美人蕉、梭魚草等挺水植物，無紡布可以阻斷土壤下滲到濕地填料中堵塞濕地，同時,無紡布具有透水性，不會阻斷水流，植物的根系也可以穿透無紡布向下伸展。

圖2 濕地旁路試驗設(shè)施工藝剖面圖Fig.2 The sectional view of wetland

試驗土建工程于2013年12月開工，2014年1月進行管道安裝，2月正式運行。經(jīng)18個月連續(xù)運行，除TN外，可使消納尾水的COD、NH3-N、TP等指標由《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標準》(GB 18918—2002)一級B排放標準，降解達到《地表水環(huán)境質(zhì)量標準》(GB 3838-2002)V類水質(zhì)要求(表1所示)。

表1 濕地旁路試驗運行效果

Table 1 The running effect of wetland bypass test

水質(zhì)理化指標進水濃度/(mg·L-1)出水濃度/(mg·L-1)平均去除率/%COD29．08～42．4022．53～32．8622．52NH3-N0．88～1．040．67～0．8023．86TN9．58～12．366．95～8．9727．45TP0．52～0．610．38～0．4030．67SS16～2014～1616．25DO2．0～4．02．0～3．0

1.2 樣品采集

1)微生物鏡檢樣品的采集，使用滅菌后的玻璃采樣儀器，用鑷子和小刀刮取濕地介質(zhì)填料和植物根系表面的生物膜，制作載玻片，并立即分析。

2)中試濕地土壤的采集：1)中試脲酶活性土壤的樣品采集，從2014年7—11月之間每月采集一次，土壤采集深度20 cm，分別采集濕地前端、中部、后端的土壤樣品，樣品前端、中部、后端分別平行設(shè)置3個點，分析土壤為3個采集點的混合土壤，土壤采集后，自然風干；2)中試濕地磷脂脂肪酸土壤的樣品采集，于2014年11月份采集，采集深度為20 cm，濕地中均勻設(shè)置前中后3個采集點，分析樣品為3個采集點的混合樣品。土壤采集后冷凍于-20 ℃冰箱，分析測定時取用。

1.3 檢測方法

1.3.1 微生物鏡檢 生物相鏡檢采用XDS200PH倒置生物顯微鏡觀測，生物相識別參考《環(huán)境微生物圖譜》[10]。

我的這篇文章將要提到的十六首鋼琴曲，以及李樹化的其他許多音樂作品，都是他在杭州“國立”藝術(shù)院工作期間完成的，這些作品都是藝術(shù)院的重要學(xué)術(shù)成果，也是藝術(shù)院的驕傲，是杭州音樂史上的光榮。

1.3.2 土壤脲酶活性檢測 濕地土壤的脲酶活性采用奈氏比色法測定[11-12]，具體方法為：稱取5 g風干后的土壤樣品，放置于100 L錐形瓶中。加入10 mL pH 6.7的磷酸緩沖液和0.5 mL甲苯，搖勻，混合處理15 min.再加入10 mL 10%尿素溶液(對照以水代替)，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，加入20 mL的 1 mol/L KCl，震蕩搖勻10 min。將混合液通過濾紙過濾，吸取0.1 mL濾液置于25 mL比色管中，用蒸餾水稀釋至10 mL，搖勻，加入4 mL 的1 mol/L NaOH，顯色，稀釋至25 mL刻度處。靜置10 min，以空白樣品作對照，在波長460 nm處測定其吸光度。

1.3.3 磷脂脂肪酸的測定 磷脂脂肪酸(PLFA)測定，參照Bligh法[13-14]以及本課題組論文[15]，主要測試步驟為：①脂肪酸的提??；②PLFA的分離；③PLFA的甲酯化；④PLFA樣品的提取和測定。待測樣品用GSMS-QP2010氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，色譜柱為DB-5-MS(30 m × 250 μm × 0.25 μm)毛細管柱，氦氣作為載氣，不分流進樣，掃描方式：SIM。

2 結(jié)果與討論

2.1 濕地微生物鏡檢

采用倒置生物顯微鏡對濕地植物根系和濕地填料進行鏡檢，結(jié)果如圖3所示。其中，(a)是濕地植物根系在倒置顯微鏡下拍攝出的圖片，可以看出植物根系有生物膜菌膠團等少量微生物附著在其表面。(b)為濕地出水口處土壤中鏡檢出的團藻。(c)、(d)是濕地填料上鏡檢出的微生物，分別為輪蟲和變形蟲等原生動物。人工濕地植物根系具有泌氧作用，有較多好氧微生物附著在植物根系上，同時，填料表面也是微生物附著的地方，由于填料比表面積較大，填料和植物根系能夠截留尾水中的污染物，微生物以這些污染物為食，并同化為自身的一部分，從而降解尾水中的污染物。同時，濕地出水口處發(fā)現(xiàn)有團藻，說明在低碳源條件下，團藻通過光合作用，利用尾水中的N、P等污染物進行生物代謝，從而實現(xiàn)低碳源條件下對尾水中N、P的去除。

圖3 濕地微生物鏡檢Fig.

2.2 濕地土壤脲酶活性

脲酶是濕地土壤中氮轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵酶，其作為一種生物催化劑，能促進尾水中含氮有機物的分解，同時，脲酶活性可作為濕地對含氮有機污染物凈化能力的衡量指標[16]。表2為2014年7—11月濕地前、中、后端土壤脲酶活性變化情況。從月變化看，濕地脲酶含量從7—10月一直處于增長狀態(tài)，到10月達到最大，平均脲酶含量(N)為37.01 mg/g，11月有所下降。其中，濕地前端、中部、后端的脲酶含量(N)平均值分別是22.15、24.79 和20.35 mg/g。由于尾水碳含量低，總氮及硝酸鹽氮含量較高，C、N、P營養(yǎng)比難以達到傳統(tǒng)生物法處理城市污水微生物所需營養(yǎng)比條件，導(dǎo)致濕地脲酶活性平均含量(N)為22.43 mg/g，與吳振斌等[17]研究人工濕地植物根區(qū)土壤酶活性與污水凈化效果及其相關(guān)分析所測得的脲酶活性(N)平均值260 mg/g存在較大差異。

濕地前端和中部的平均脲酶含量高于濕地后端的平均脲酶含量，即濕地前端和中部的脲酶活性高于濕地后端的脲酶活性，脲酶活性大體上沿程下降。濕地系統(tǒng)中氮素和有機質(zhì)污染物在沿程中被降解，沿著水流方向慢慢減少，從而導(dǎo)致微生物的數(shù)量、活性、多樣性等降低，脲酶活性也隨之降低。這與黃娟等[18]關(guān)于潛流式人工濕地土壤中、上層脲酶活性高于土壤下層脲酶活性的研究結(jié)果有一定不同。

表2 濕地植物根區(qū)土壤前、中、后端脲酶(N)活性/(mg·g-1)

Table 2 The urease index of wetland

月份濕地前端濕地中部濕地后端均值2014年7月11．559．0113．0011．192014年8月10．0815．8919．0815．022014年9月22．2323．4714．8820．192014年10月41．0736．9833．0037．012014年11月25．8238．5921．7828．73均值22．1524．7920．3522．43

圖4 濕地脲酶活性與TN去除率關(guān)系Fig.4 Relationship between urease activity and

從圖4中可以看出，人工濕地在生態(tài)消納城市污水廠尾水過程中，濕地土壤脲酶活性與TN去除率之間呈正相關(guān)性。脲酶能夠作為濕地消納尾水效能的一個重要指標，濕地土壤脲酶活性越高，越有利于濕地微生物的代謝、繁殖，濕地對TN的去除效果越好。其擬合動力學(xué)方程式為

y=3.344 9x-69.337

R2=0.756 5，n=5，P=0.055 3

式中：y為濕地土壤脲酶(N)活性，mg/g；x為TN去除率，%；R2為決定系數(shù)，無量綱，其值越接近1，表明擬合效果越好；P為顯著性差異，無量綱；當P<0.05，表明相關(guān)性顯著，P<0.01，表明相關(guān)性極顯著；n為樣本數(shù)。

這與鄧風等[19]研究發(fā)現(xiàn)潛流濕地土壤脲酶活性與TN的去除率之間存在顯著正相關(guān)這一結(jié)果存在差異?？赡苡捎诔鞘形鬯畯S尾水中TN含量遠遠低于城市污水中TN含量，導(dǎo)致消納尾水濕地土壤脲酶活性與TN去除率之間相關(guān)性不顯著。

2.3 濕地土壤PLFA

對濕地土壤中提取的PLFA的GC-MS圖譜進行分析如下(見表3)，表3列出了濕地土壤中的脂肪酸所標記的微生物及其生物標記量等。共檢測出3種磷脂脂肪酸，且濕地土壤中微生物均為細菌，且好氧細菌占絕大部分并有部分放線菌。其中不飽和脂肪酸9Me19：0在濕地土壤中含量為0.054 nmol/g，含量最少；其次是飽和脂肪酸i18：0，其含量為0.271 nmol/g；最多是飽和脂肪酸17：0，其含量為0.508 nmol/g。根據(jù)White等[20-26]研究得出PLFA量和生物量之間存在的轉(zhuǎn)換系數(shù)，取4×104cell·pmol-1推算出飽和脂肪酸17：0的生物標記量為20.32×106cell/g，指示微生物為好氧細菌；飽和脂肪酸i18：0和不飽和脂肪酸9Me19:0的生物標記量分別為0.22×106cell/g和10.84×106cell/g，指示微生物都為放線菌。由此可知，運用人工濕地生態(tài)消納城市污水廠尾水，使得濕地土壤中形成了以好氧細菌為優(yōu)勢種群的微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)。

運用PLFA法檢測尾水消納濕地填料底泥，檢測出的脂肪酸種類相對較少、不飽和脂肪酸含量占極少部分以及未檢測出真菌、假單胞桿菌、嗜熱解氫桿菌等存在，這與尹勇等[15]運用PLFA法研究生態(tài)強化法原位凈化村鎮(zhèn)污水微生物特性的結(jié)果存在明顯差異。這可能是由于城市污水廠尾水中碳含量低，總氮及硝酸鹽氮含量較高，C、N、P營養(yǎng)比難以達到傳統(tǒng)生物法處理城市污水微生物所需營養(yǎng)比條件，導(dǎo)致微生物特性與傳統(tǒng)潛流式人工濕地處理城市污水存在以上差異。

表3 濕地土壤中提取的磷脂脂肪酸

Table 3 Phospholipid fatty acids extracted from wetland soil

序號脂肪酸種類脂肪酸濃度/(nmol·g-1)微生物指示類型磷脂脂肪酸生物標記量(106)/(cell·g-1)含量百分比/%12飽和脂肪酸17：00．508細菌(好氧細菌)[15]20．3264．75i18：00．271細菌(放線菌)[15，21]10．8434．553不飽和脂肪酸9Me19：00．054細菌(放線菌)[15，21] 0．22 0．70

2.4 低碳源條件下的尾水人工濕地消納微生物作用機制

低碳源條件下，人工濕地對尾水中的污染物降解主要基于以下3種途徑：

1)由于嗜磷菌在溶解氧小于2 mg/L的情況下將會釋放，所以污水處理廠尾水的DO大多為2.0～4.0 mg/L。當?shù)吞荚吹奈菜M入潛流濕地時(HRT=20～24 h)，除本身含有一定濃度氧外，濕地植物根區(qū)根系具有泌氧作用，因此，潛流濕地是一個以好氧環(huán)境為主的微生態(tài)系統(tǒng)。濕地填料表面及濕地植物根系表面及周圍形成了以好氧微生物為主的氧化區(qū)域，尾水中有機污染物被好氧微生物利用、降解和分解。

2)具有一定比表面積的石灰石、鋼渣、陶粒、紅磚構(gòu)成的濕地填料及其表面生長的微生物膜，通過截留、過濾、吸附等過程消減尾水中的污染物和SS，表現(xiàn)出水COD、TN、TP、氨氮及SS的同步降低。尾水中COD含量低、總氮及硝酸鹽氮含量較高，氮主要通過濕地填料表面的微生物膜硝化和反硝化作用以及氨的揮發(fā)等過程被去除，濕地填料間隙和植物根系之間能夠形成多個好氧—厭氧微區(qū)域，濕地微生物能夠利用這些微區(qū)域?qū)ξ菜械牡M行硝化和反硝化作用，從而降解、轉(zhuǎn)化尾水中的氮素。尾水中磷的去除途徑是通過微生物對磷的同化吸收以及自然沉降、填料吸附等，由于濕地植物的光合作用和呼吸作用的進行，交替出現(xiàn)了好氧和厭氧環(huán)境，使得微生物對磷的同化作用更易進行。

3)由于濕地系統(tǒng)是一個有氧生態(tài)系統(tǒng)，其中生長有一定數(shù)量的藻類微生物，其對濕地系統(tǒng)的脫氮、除磷也有一定的貢獻。藻類微生物(如團藻)可能通過光合作用或自身新陳代謝作用，利用尾水中的N、P等污染物進行生物代謝，從而實現(xiàn)低碳源條件下對尾水中N、P的去除。

3 結(jié)論

潛流式人工濕地消納城市污水廠尾水的濕地系統(tǒng)是好氧生態(tài)系統(tǒng)，PLFA揭示該系統(tǒng)中形成了以好氧細菌為優(yōu)勢種群的微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)。濕地填料和植物根系表面生物膜及懸浮團藻，能同化植物根系和濕地填料截留下的污染物質(zhì)，降解尾水中的污染物；低碳源條件下，團藻、好氧微生物是低碳源尾水中TN等污染物去除的主要載體微生物；濕地脲酶活性與TN的去除呈線性相關(guān)，活性越高，TN去除率越高；一定的溶解氧濃度水平和脲酶活性是濕地消納尾水調(diào)試及運行重要控制指標。本研究對潛流式人工濕地消納城市污水廠尾水微生物特性及機制的研究有著重要的意義。

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(編輯 郭飛)

Characteristics and mechanism of micro-organisms with subsurface flow wetland consumptive municipal sewage treatment effluents

HuLinchao1，2,ZhouXincheng1,DenWen1,ChenPing1,ChenJing1,ZhangWenyi1

(1．School of Environment & Safety Engineering，Changzhou University，Changzhou 213164， Jiangsu, P. R. China；2．Changzhou Academy of Environmental Science， Changzhou 213022，Jiangsu, P. R. China)

The micro-organisms of plant roots, wetland filler and wetland soil of subsurface flow wetland consumptive municipal sewage treatment plant effluents bypass test systems, in Changzhou City, north of the city sewage treatment plant, were studied through microscopic examination, urease, phospholipid fatty acid (PLFA) and other analytical tools for related seudies to reveal the characteristics and mechanism of micro-organisms with Subsurface Flow Wetland consumptive municipal sewage treatment plant effluents. The results showed that plant roots, filler contained rotifers, amoeba and other protozoa and Volvox, Volvox used the N, P and other pollutant of tail waters through photosynthesis biological metabolism, removal of N、P, etc, under conditions of low-carbon. The average content of wetland urease(N) was about 22.43 mg/g, the activity of urease was linearly related to the removal of TN, the higher the activity, the higher the removal rate of TN. Saturated fatty acid (PLFA) content was 99.30%, unsaturated fatty acid content was only 0.70% in Wetland fillers, which with subsurface flow wetland treatment PLFA contents of municipal sewage is very different (76.97% and 23.03%, respectively). The amount of fatty acid biomarker as an indicator, reveal wetlands matrix formed with aerobic bacteria was dominant structure of microbial ecology. Volvox, aerobic microorganisms was the main carriers of microbial removal of TN and other pollutants in low carbon source tail water.

sewage effluents； phospholipid fatty acid； urease； constructed wetland.

2016-03-09

“十二五”國家水體污染控制與治理科技重大專項(2012zx07301-001)；國家自然科學(xué)基金(41571471)；常州市和武進區(qū)科技支撐項目(CE20155061、WS201521)

胡林潮(1983-)，男，博士，主要從事土壤污染治理及水污染治理研究，(E-mail)172542255@qq.com。 張文藝(通信作者)，男，博士，教授，(E-mail)zwy@cczu.edu.cn。

Foundation item：National Major Science & Technology Program for Water Pollution Control and Management (No.2012zx07301-001);National Natural Science Foundation of China(No.41571471); Science and Technology Project of Changzhou City and Wujin District (No.CE20155061,WS201521)

10.11835/j.issn.1674-4764.2016.06.018

X701

A

1674-4764(2016)06-0135-07

Received:2016-03-09

Author brief：Hu Linchao(1983-)，PhD，main research interests：remediation studies of contaminated soil and wastwater,(E-mail)172542255@qq.com. Zhang Wenyi(corresponding author)，PhD, professor，(E-mail)zwy@cczu.edu.cn.