壯藥痔瘡熏洗液的止血、鎮(zhèn)痛、抗炎和抗菌作用研究Δ

黃一摯，黃明政，陳 朝，孫平良，黃權芳，伍小燕（1.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術學院藥學系，南寧 53001；.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部，南寧 53003）

·民族醫(yī)藥·

壯藥痔瘡熏洗液的止血、鎮(zhèn)痛、抗炎和抗菌作用研究Δ

黃一摯1＊，黃明政2，陳 朝2，孫平良2，黃權芳2，伍小燕2（#1.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術學院藥學系，南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部，南寧 530023）

目的：考察壯藥痔瘡熏洗液的止血、鎮(zhèn)痛、抗炎和抗菌作用。方法：將KM小鼠（或SD大鼠）按體質(zhì)量隨機分為模型對照組、復方荊芥熏洗劑組[陽性藥物，0.56 g（生藥）/kg]和痔瘡熏洗液低、中、高劑量組[2.40、4.80、9.60 g（生藥）/kg]，每組10只，外用給藥。分別通過測定小鼠斷尾出血時間、0.6%冰醋酸致小鼠扭體次數(shù)、二甲苯致小鼠耳腫脹度和角叉菜膠致大鼠足跖腫脹度考察其止血、鎮(zhèn)痛和抗炎作用。以肉湯二倍稀釋法測定其對綠膿假單胞菌（PA）、表皮葡萄球菌（SE）、大腸埃希菌（EC）、白色念珠菌（MA）、金黃色葡萄球菌（SA）、乙型副傷寒沙門菌（SPB）、枯草芽孢桿菌（BS）、肺炎克雷伯菌（KP）的最低抑菌濃度（MIC）及最低殺菌濃度（MBC）。結(jié)果：與模型對照組比較，各給藥組小鼠的斷尾出血時間縮短、扭體次數(shù)減少、耳腫脹度降低，各給藥組大鼠足跖腫脹度降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；痔瘡熏洗液對PA、SE、EC、MA、SA、SPB、BS、KP的MIC分別為0.045、0.091、0.091、0.181、0.091、0.091、0.091、0.181 g/ml，MBC分別為0.091、0.181、0.181、0.363、0.091、0.181、0.181、0.181 g/ml。結(jié)論：痔瘡熏洗液具有明顯的止血、鎮(zhèn)痛、抗炎和抗菌作用。

痔瘡熏洗液；止血；鎮(zhèn)痛；抗炎；抗菌；大鼠；小鼠

痔瘡是臨床常見病之一。目前，痔的治療應以非手術治療為主，以消除或減輕痔病發(fā)作時的癥狀如炎癥、出血、疼痛等為治療目的[1-3]。痔瘡熏洗液是廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院根據(jù)痔病中醫(yī)辨證“濕熱蘊結(jié)、氣血瘀滯”研制的外用制劑，由功勞木、苦參、黃柏、石榴皮、芒硝、冰片等9味中藥組成，具有清熱利濕解毒、活血化瘀、行氣通絡、消腫止痛、祛腐生肌的功效，臨床用于治療炎性外痔、血栓性外痔、內(nèi)痔嵌頓、痔瘡術后等，療效確切，不良反應少[4-5]。為了考察其主要藥效作用，本研究根據(jù)其適應證設計了相關模型，擬對該制劑的止血、鎮(zhèn)痛、抗菌和抗炎作用進行研究。

1 材料

1.1 儀器

AR-2140電子分析天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；BSC-1600生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）；SPX-250B生化培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 藥品與試劑

痔瘡熏洗液（廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑室自制，批號：20140825，規(guī)格：每1 ml含生藥0.96 g）；復方荊芥熏洗液（榮昌制藥有限公司，批號：140205，規(guī)格：每10 g相當于原生藥28 g）；角叉菜膠（美國Sigma公司，批號：20140117）；二甲苯、冰醋酸等均為分析純。

1.3 動物與菌株

KM小鼠150只，♀♂各半，體質(zhì)量18～22 g；SD大鼠50只，♂，體質(zhì)量200～240 g，均購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心[合格證號：SCXK（桂）2009-0002]。

肺炎克雷伯菌（編號：46117-5）、綠膿假單胞菌（編號：10104-2a11）、表皮葡萄球菌（編號：26069-7a）、白色念珠菌（編號：98001-2a6）、金黃色葡萄球菌（編號：26003-5a17）、枯草芽孢桿菌（編號：63501-2a13）、大腸埃希菌（編號：44102-3a16）、乙型副傷寒沙門菌（編號：50094-2a1）均購于中國食品藥品檢定研究院。

2 方法

2.1 痔瘡熏洗液的止血作用考察

采用小鼠斷尾出血時間測定法[6-7]。取KM小鼠50只，♀♂各半，按體質(zhì)量隨機分為模型對照組（等體積純化水）、復方荊芥熏洗劑組（陽性藥物，0.56 g/kg）[3]和痔瘡熏洗液低、中、高劑量組[2.40、4.80、9.60 g（生藥）/kg，劑量依據(jù)前期預實驗設定]，每組10只。將藥物對應涂于小鼠尾部，給藥體積均為10 ml/kg。0.5 h后用0.1%水合氯醛麻醉小鼠，以利剪在其尾尖1.5 cm處剪斷，待血液自然流出時計時，每隔15 s用濾紙吸去血滴1次，直至血液自然停止。以斷尾開始計時，至出血停止所經(jīng)歷的時間計為出血時間，計算出血時間縮短率[出血時間縮短率（%）＝（模型對照組出血時間－給藥組出血時間）/模型對照組出血時間×100%]。

2.2 痔瘡熏洗液的鎮(zhèn)痛作用考察

采用醋酸法鎮(zhèn)痛試驗[8]。取KM小鼠50只，♀♂各半，同“2.1”項下分組。小鼠腹部剪毛，剪毛面積約為1.5 cm×1.5 cm，將藥物對應涂于小鼠腹部脫毛區(qū)（給藥劑量同“2.1”項下），給藥體積均為10 ml/kg，0.5 h后再涂1次。末次給藥1 h后，各組小鼠ip給予0.6%冰醋酸（0.1 ml/10 g），記錄15 min內(nèi)小鼠扭體次數(shù)（扭體反應表現(xiàn)為小鼠腹部內(nèi)凹、軀干與后腿伸張、臀部抬高），計算扭體抑制率[扭體抑制率（%）＝（模型對照組扭體次數(shù)－給藥組扭體次數(shù)）/模型對照組扭體次數(shù)×100%]。

2.3 痔瘡熏洗液的體外抗菌作用考察[9-10]

2.3.1 最低抑菌濃度（MIC） 采用肉湯二倍稀釋法測定痔瘡熏洗液的MIC。精確吸取1 ml痔瘡熏洗液至滅菌試管中，加入3 ml營養(yǎng)肉湯，混勻；從中吸出2 ml至試管內(nèi)，余下的2 ml混合液再加入2 ml營養(yǎng)肉湯，混勻；再從中吸出2 ml至下一個試管內(nèi)，以此類推，制備生藥質(zhì)量濃度依次為725.00、362.50、181.25、90.62、45.31、22.66、11.33 g/L共7個供試藥液。每個質(zhì)量濃度的受試藥液各加入50 μl菌懸液（菌液終濃度為105CFU/ml），置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果。如果藥液管澄清，則表示細菌生長受抑，以無細菌生長試管內(nèi)藥物的最低濃度為該菌的MIC。另設不含藥物的菌懸液管作為細菌生長對照及空白對照管。

2.3.2 最低殺菌濃度（MBC） 用直徑為2 mm的接種環(huán)將抑菌試驗中未見細菌生長的試管內(nèi)培養(yǎng)液挑取、接種到無藥營養(yǎng)瓊脂平板表面，于37℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h，仍無細菌生長的最低受試藥物濃度即為MBC。

2.4 痔瘡熏洗液的抗炎作用考察

2.4.1 痔瘡熏洗液對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響[3，6]取KM小鼠50只，♀♂各半，同“2.1”項下分組。于小鼠左耳涂布二甲苯（0.02 ml/只）致炎，30 min后將藥物涂于左耳（給藥劑量同“2.1”項下），給藥體積為10 ml/kg，0.5 h后重復1次。末次涂藥后3 h頸椎脫臼法處死小鼠，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑為8 mm的打孔器分別在兩耳同一部位打下耳片，精密稱定質(zhì)量，計算耳腫脹度與腫脹抑制率[耳腫脹度（mg）＝左耳質(zhì)量（mg）－右耳質(zhì)量（mg）；腫脹抑制率（%）＝（模型對照組腫脹度－給藥組腫脹度）/模型對照組腫脹度×100%]。

2.4.2 痔瘡熏洗液對角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響[3]取SD大鼠50只，♂，同“2.1”項下分組。在各組大鼠的右后足部涂相應藥物（給藥劑量同“2.1”項下），給藥體積均為10 ml/kg，bid，連續(xù)3 d。末次給藥后在大鼠右后足跖部ih 0.25%角叉菜膠（0.1 ml/只）致炎，致炎后5 min于致炎處再涂受試藥物。在末次給藥后0.5、1、2、4、6 h分別用千分尺測量大鼠左、右后足跖厚度，計算足趾腫脹度[足跖腫脹度（mm）＝右足跖厚度（mm）－左足跖厚度（mm）]。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 痔瘡熏洗液的止血作用考察結(jié)果

與模型對照組比較，各給藥組小鼠斷尾出血時間均明顯縮短（P＜0.05或P＜0.01）。痔瘡熏洗液中、高劑量組小鼠斷尾出血時間較復方荊芥熏洗劑組更短，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠斷尾出血時間和出血時間縮短率測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 Results of tail bleeding time and the rate of bleeding time decreasing in mice of each grou（p±s，n＝10）

表1 各組小鼠斷尾出血時間和出血時間縮短率測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 Results of tail bleeding time and the rate of bleeding time decreasing in mice of each grou（p±s，n＝10）

注：與模型對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.model control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別模型對照組復方荊芥熏洗劑組痔瘡熏洗液低劑量組痔瘡熏洗液中劑量組痔瘡熏洗液高劑量組劑量，g（生藥）/kg 0.56 2.40 4.80 9.60出血時間，min 11.54±4.3 7.39±5.7＊＊8.70±6.6＊6.42±4.9＊＊4.41±3.6＊＊出血時間縮短率，% 35.96 24.61 44.36 61.78

3.2 痔瘡熏洗液的鎮(zhèn)痛作用考察結(jié)果

與模型對照組比較，各給藥組小鼠扭體反應次數(shù)均明顯減少（P＜0.05或P＜0.01），痔瘡熏洗液低、中、高劑量組的抑制率分別為21.89%、37.29%、45.13%，抑制率與劑量之間存在一定的量效關系。這說明痔瘡熏洗液對冰醋酸注入腹腔引起的深部、較大面積、較長時間的炎性疼痛有顯著的抑制作用，結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠扭體次數(shù)和扭體抑制率測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 Results of writhing times and inhibitory rate of writhing in mice of each grou（p±s，n＝10）

表2 各組小鼠扭體次數(shù)和扭體抑制率測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 Results of writhing times and inhibitory rate of writhing in mice of each grou（p±s，n＝10）

注：與模型對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.model control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別模型對照組復方荊芥熏洗劑組痔瘡熏洗液低劑量組痔瘡熏洗液中劑量組痔瘡熏洗液高劑量組劑量，g（生藥）/kg 0.56 2.40 4.80 9.60扭體反應次數(shù)37.0±8.8 22.3±10.4＊＊28.9±6.2＊23.2±8.9＊＊20.3±6.9＊＊抑制率，% 28.91 21.89 37.29 45.13

3.3 痔瘡熏洗液的體外抗菌作用考察結(jié)果

痔瘡熏洗液對8種病原菌均有較強的抑菌和殺菌作用，對應的MIC和MBC均低于復方荊芥熏洗液對照組，這表明痔瘡熏洗液的體外抗菌作用較強，結(jié)果見表3。

表3 痔瘡熏洗液對8種病原菌的MIC和MBC測定結(jié)果（n＝3，g/ml）Tab 3 MIC and MBC of Hemorrhoids fumigant to 8 pathogens（n＝3，g/ml）

3.4 痔瘡熏洗液的抗炎作用考察結(jié)果

3.4.1 痔瘡熏洗液對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響結(jié)果 與模型對照組比較，各給藥組小鼠的耳腫脹度均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），且呈現(xiàn)一定的量效關系；痔瘡熏洗液中、高劑量組小鼠耳腫脹度較復方荊芥熏洗劑組稍低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），結(jié)果見表4。

表4 各組小鼠耳腫脹度和腫脹抑制率測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 4 Results of ear swelling and inhibitory rate of swelling in mic（e±s，n＝10）

表4 各組小鼠耳腫脹度和腫脹抑制率測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 4 Results of ear swelling and inhibitory rate of swelling in mic（e±s，n＝10）

注：與模型對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.model control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別模型對照組復方荊芥熏洗劑組痔瘡熏洗液低劑量組痔瘡熏洗液中劑量組痔瘡熏洗液高劑量組劑量，g（生藥）/kg 0.56 2.40 4.80 9.60腫脹度，mg 22.60±4.15 16.50±5.56＊＊17.80±6.95＊14.40±6.67＊＊13.60±4.95＊＊腫脹抑制率，% 26.99 21.23 36.28 39.82

3.4.2 痔瘡熏洗液對角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響結(jié)果 角叉菜膠誘發(fā)的大鼠足跖腫脹在4 h內(nèi)達到峰值。與模型對照組比較，各給藥組大鼠在給藥后0.5、1、2、4、6 h足跖腫脹度均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)果見表5。

表5 各組大鼠給藥不同時間后足跖腫脹度測定結(jié)果（±s，n＝10，mm）Tab 5 Results of paw swelling in rat（s±s，n＝10，mm）

表5 各組大鼠給藥不同時間后足跖腫脹度測定結(jié)果（±s，n＝10，mm）Tab 5 Results of paw swelling in rat（s±s，n＝10，mm）

注：與模型對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.model control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別模型對照組復方荊芥熏洗劑組痔瘡熏洗液低劑量組痔瘡熏洗液中劑量組痔瘡熏洗液高劑量組劑量，g（生藥）/kg 0.56 2.40 4.80 9.60 0.5 h 1.76±0.53 1.33±0.42＊1.28±0.47＊1.22±0.36＊1.02±0.47＊＊1 h 3.72±0.44 2.93±0.33＊3.38±0.52＊3.02±0.46＊2.72±0.49＊＊2 h 4.63±0.39 4.26±0.52＊4.33±0.43＊4.22±0.48＊3.76±0.66＊＊4 h 6.23±0.72 5.57±0.59＊5.82±0.64＊5.71±0.68＊5.14±0.69＊6 h 4.31±0.66 3.91±0.54＊3.98±0.38＊3.78±0.61＊3.86±0.57＊

4 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)認為痔的發(fā)病以風、濕、熱、瘀為主，臨床表現(xiàn)為局部炎癥腫痛、便血、脫出等癥狀，因此治療上以清熱燥濕、涼血祛風、活血化瘀、消腫止痛為主。痔瘡熏洗液方中苦參、功勞木清熱燥濕、解毒消腫、殺蟲止癢，為君藥；古羊藤清熱解毒、散瘀止痛，黃柏清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡，白礬解毒殺蟲、燥濕止癢，三藥加強君藥清熱解毒、活血止痛、燥濕止癢之功；兩面針、石榴皮活血化瘀、行氣止痛、澀腸止瀉、止血；荊芥、冰片祛風通竅、透疹消瘡、清熱止痛。諸藥合用，共奏清熱利濕解毒、活血化瘀、行氣通絡、消腫止痛、祛腐生肌之功；加之采用熏洗坐浴療法，直接作用于病變部位，藥效能得到充分發(fā)揮。由上述可知，痔瘡熏洗液符合中醫(yī)對本病治則。復方荊芥熏洗劑由防風、荊芥、苦參、透骨草、生川烏等7味中藥組成，具有祛風燥濕、清熱解毒、消腫止痛之功效，用于外痔、混合痔、肛裂、肛周膿腫等癥的治療[11]，因此本研究以其作為陽性對照藥。

大便時出血是痔瘡的常見癥狀，長期出血不僅會導致患者貧血，而且嚴重影響患者的心理健康。通過小鼠斷尾出血實驗表明，痔瘡熏洗液低、中、高3個劑量作用后均可明顯縮短出血時間，這提示痔瘡熏洗液具有良好的止血效果。大便時疼痛是痔瘡的另一常見癥狀。為驗證痔瘡熏洗液的鎮(zhèn)痛作用，筆者采用化學刺激法中的小鼠扭體法，刺激劑為醋酸溶液。該法具有敏感、簡便、重復性好的特點[12-13]，但對實驗室溫度要求嚴格：室溫宜恒定于20℃為宜，室溫較低或較高時，小鼠扭體次數(shù)會減少或不扭體。本研究表明，痔瘡熏洗液對醋酸所致疼痛有明顯的鎮(zhèn)痛效果。

由于肛周局部解剖的因素及糞便的污染，易導致肛周感染，加重痔病的炎癥反應，所以需要進行藥物抗菌治療。液體培養(yǎng)基試管連續(xù)稀釋法測MIC，操作簡便、穩(wěn)定、可靠，是一種體外測試藥物抗菌活性的常用實驗方法[14]。本實驗挑選了8種引起外科疾病的常見病原菌，采用可以定量分析并且敏感性較高的肉湯二倍稀釋法考察痔瘡熏洗液的抗菌作用。結(jié)果表明，痔瘡熏洗液對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等8種外科致病菌均有較強的抑菌和殺菌作用。痔病發(fā)作時炎癥反應非常明顯，使身體長時間處于炎癥的侵害環(huán)境中，對免疫功能、新陳代謝以及內(nèi)分泌系統(tǒng)都會產(chǎn)生不良的影響，所以藥物抗炎治療非常重要。因此，筆者對痔瘡熏洗液進行外用給藥的非特異性炎癥模型抗炎實驗，結(jié)果表明，痔瘡熏洗液對二甲苯所致小鼠耳腫脹和大鼠足跖腫脹有較強抗炎作用。

綜上，本研究通過相關模型，證實了痔瘡熏洗液具有較好的止血、鎮(zhèn)痛、抗菌和抗炎作用。

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Study on the Hemostasis，Analgesic，Anti-inflammatory and Anti-bacterial Effects of Zhuang Medicine Hemorrhoids Fumigant

HUANG Yizhi1，HUANG Mingzheng2，CHEN Chao2，SUN Pingliang2，HUANG Quanfang2，WU Xiaoyan2（1.Dept. of Pharmacy，Guangxi Medical College，Nanning 530021，China；2.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Guangxi University of TCM，Nanning 530023，China）

OBJECTIVE：To investigate the hemostasis，analgesic，anti-inflammatory and anti-bacterial effect of Zhuang medicine Hemorrhoids fumigant.METHODS：KM mice（or SD rats）were randomly divided into model control group，Compound schizonepeta lotion group[positive drug，0.56 g（crude drug）/kg]and Hemorrhoids fumigant low-dose，medium-dose and highdose groups[2.40，4.80，9.60 g（crude drug）/kg]according to body mass，with 10 rats or mice in each group，for external administration.The hemostasis，analgesic and anti-inflammation effects of Hemorrhoids fumigant were investigated through determining tail bleeding time，0.6%acetic acid-writhing times and xylene-induced ear swelling of mice and carrageenin-induced paw swelling of rats.The broth two times dilution method was used to determine minimal inhibitory concentration（MIC）and minimum bactericidal concentration（MBC）of Hemorrhoids fumigant to Pseudomonas aeruginosa（PA），Staphylococcus epidermidis（SE），Escherichia coli（EC），Monilia albicans（MA），Staphylococcus aureus（SA），Salmonella paratyphi B（SPB），Bacillus subtilis（BS）and Klebsiella pneumoniae（KP）.RESULTS：Compared with model control group，the tail bleeding time，writhing times and the degree of ear swelling in mice were decreased in treatment groups，and the degree of paw swelling in rats was decreased in treatment groups，with statistical significance（P＜0.05 or P＜0.01）.MIC of Hemorrhoids fumigant to PA，SE，EC，MA，SA，SPB，BS，KP were 0.045，0.091，0.091，0.181，0.091，0.091，0.091，0.181 g/ml，respectively；corresponding MBC were 0.091，0.181，0.181，0.363，0.091，0.181，0.181，0.181 g/ml，respectively.CONCLUSIONS：Hemorrhoids fumigant shows obvious hemostasis，analgesic，anti-inflammatory and anti-bacterial effects.

Hemorrhoids fumigant；Hemostasis；Analgesic；Anti-inflammatory；Anti-bacterial；Rat；Mice

R285

A

1001-0408（2016）34-4817-04

2016-04-13

2016-08-13）

（編輯：林 靜）

廣西衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項課題（No.GZZJ13-05）

＊講師。研究方向：藥理學。電話：0771-2287060。E-mail：yizhi0771@163.com

#通信作者：主任中藥師。研究方向：藥品質(zhì)量控制與中藥制劑研發(fā)。電話：0771-5645433。E-mail：gzyyxb@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.34.20