蛇床子催眠活性組分對小鼠鎮(zhèn)靜催眠、學習記憶及宿醉反應的影響Δ

馬 瀾，仝立國，宋美卿，胡文卓，賈力莉，牛艷艷，仲啟明，馮瑪莉（山西省中醫(yī)藥研究院，太原 030012）

·實驗研究·

蛇床子催眠活性組分對小鼠鎮(zhèn)靜催眠、學習記憶及宿醉反應的影響Δ

馬 瀾＊，仝立國，宋美卿，胡文卓，賈力莉，牛艷艷，仲啟明，馮瑪莉#（山西省中醫(yī)藥研究院，太原 030012）

目的：研究蛇床子催眠活性組分（CHC）對小鼠的鎮(zhèn)靜催眠、學習記憶及宿醉反應的影響。方法：取小鼠60只，隨機分為空白對照組（2%聚山梨酯80溶液）、地西泮組（6 mg/kg）和CHC高、中、低劑量組（520、260、130 mg/kg），每組12只，每天ig相應藥物2次。觀察給藥1 d后各組小鼠的入睡潛伏期和睡眠持續(xù)時間、睡眠后自主活動次數(shù)和站立次數(shù)、避暗實驗的避暗潛伏期和錯誤次數(shù)；給藥16 d后各組小鼠進行定位航行實驗和空間探索實驗。結(jié)果：與空白對照組比較，地西泮組和CHC各劑量組小鼠睡眠持續(xù)時間均延長、睡前和醒后站立次數(shù)均減少；地西泮組小鼠睡前錯誤次數(shù)增加，醒后活動次數(shù)減少，逃避潛伏期延長，目標時間縮短，目標路程占比減少；CHC高劑量組小鼠睡前避暗潛伏期延長，以上差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。與地西泮組比較，CHC中、高劑量組小鼠睡眠持續(xù)時間均延長，醒后活動次數(shù)均增加；CHC低劑量組小鼠睡前活動次數(shù)減少；CHC各劑量組小鼠睡前錯誤次數(shù)均減少，以上差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。與睡前比較，空白對照組小鼠醒后避暗潛伏期延長，CHC各劑量組小鼠醒后活動次數(shù)均增加、醒后站立次數(shù)均減少、醒后避暗潛伏期延長（除中劑量組外），以上差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其余指標差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論：CHC對小鼠有鎮(zhèn)靜催眠作用，但對其學習記憶幾乎無影響，也沒有宿醉反應。

蛇床子；催眠活性組分；鎮(zhèn)靜催眠；學習記憶；宿醉反應

現(xiàn)代醫(yī)學認為失眠通常指患者對睡眠時間和（或）質(zhì)量不滿足并影響日間社會功能的一種主觀體驗[1]。隨著現(xiàn)代社會人們生活節(jié)奏加快及競爭力增大，使得失眠的發(fā)生率逐年攀升[2]。苯二氮類藥物是臨床最常見的鎮(zhèn)靜催眠藥物，長期廣泛地應用可導致藥物依賴性和耐受性[3]。鎮(zhèn)靜催眠藥物往往針對中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一定的抑制作用，同時還會使患者不同程度地產(chǎn)生依賴性、戒斷癥狀和宿醉反應[4]。宿醉反應表現(xiàn)為服藥次晨出現(xiàn)頭暈、嗜睡、精細運動不協(xié)調(diào)及定向障礙等。宿醉反應作為化學類助眠藥物的常見后遺效應不僅嚴重影響了患者的日間工作效率而且?guī)砹艘幌盗械纳鐣栴}，如交通事故、曠工等[5]。因此，對助眠藥物宿醉反應進行評價意義重大。

蛇床子主要含香豆類化合物和較多的揮發(fā)油，包括蛇床子素、佛手柑內(nèi)酯、異虎耳草素、花椒毒素、歐前胡素等單體成分[6]。課題前期研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子醇提物催眠活性強，故分離純化蛇床子不同組分，經(jīng)譜效關系分析[7]，優(yōu)選出鎮(zhèn)靜催眠作用較強的鎮(zhèn)靜催眠活性組分，命名為CHC。本文主要研究CHC對小鼠的鎮(zhèn)靜催眠、學習記憶及宿醉反應的影響。

1 材料

1.1 儀器

ZZ-6小鼠自主活動儀、BA-200小鼠避暗儀（成都泰盟科技有限公司）；DMS-2 Morris水迷宮（MWM）測試系統(tǒng)（中國醫(yī)學科學院藥物研究所）。

1.2 藥品與試劑

蛇床子（安徽省亳州市遠光中藥飲片廠，批號：121203）；地西泮片（陽性藥物，上海信誼藥廠有限公司，批號：14150301，規(guī)格：每片2.5 mg）；戊巴比妥鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：WS20050411，純度：＞99.0%）；聚山梨酯80（湖北省醫(yī)藥公司化玻站，批號：080308）。

1.3 動物

KM種小鼠，體質(zhì)量18～20 g，♀♂各半，共60只，由山西省中醫(yī)藥研究院實驗動物室提供，許可證號：SCXK（晉）2010-0002，合格證號：0000036。

2 方法

2.1 CHC的制備

稱取蛇床子500 g粉碎成最粗粉，加95%乙醇加熱回流提取3次，每次1 h，濾過，濾液減壓濃縮并干燥得浸膏。浸膏加水溶解混懸后，經(jīng)D101大孔吸附樹脂柱層析，30%～95%濃度乙醇梯度洗脫，收集50%乙醇洗脫液，減壓濃縮干燥，即得CHC[4]。使用時以2%聚山梨酯80溶液制備成1.3%、0.65%、0.325%的混懸液。

2.2 分組與給藥

取小鼠60只，隨機分為空白對照組（2%聚山梨酯80溶液）、地西泮組（6 mg/kg）和CHC高、中、低劑量組（520、260、130 mg/kg），每組12只。每天分2次ig相應藥物，ig間隔時間為7 h，ig容積為20 ml/kg。地西泮給藥劑量按照前期實驗常用劑量設定，CHC高劑量組給藥劑量按照低于CHC的最大耐受量換算設定。

2.3 指標測試

2.3.1 睡眠前后自主活動和避暗反射測試 各組小鼠于第2天上午9：00給藥，60 min后，用小鼠自主活動儀記錄小鼠放入箱后5 min內(nèi)的站立次數(shù)和活動次數(shù)；再用小鼠避暗儀記錄小鼠放入箱后5 min內(nèi)的避暗潛伏期和錯誤次數(shù)；每組小鼠測完后立刻ip戊巴比妥鈉50 mg/kg，并檢測小鼠入睡潛伏期和睡眠持續(xù)時間，睡眠以翻正反射消失為指標，記錄注射戊巴比妥鈉后至小鼠翻正反射消失（小鼠背向下姿勢保持30 s以上）時間作為入睡潛伏期，翻正反射消失至覺醒的時間作為睡眠持續(xù)時間；待小鼠醒后30 min，再次檢測其自主活動及避暗反射。

2.3.2 MWM定位航行空間認知測試 從給藥第16天開始，連續(xù)6 d，每組小鼠ig 60 min后進行定位航行實驗，MWM測試系統(tǒng)自動記錄小鼠逃避潛伏期和搜索策略。若搜索策略為直線式或趨向式，表明空間認知能力較好。統(tǒng)計最后一天的逃避潛伏期和搜索策略作為其定位航行空間認知測試的實驗結(jié)果。

2.3.3 MWM空間探索參考記憶測試 給藥第22天，ig 60 min后，各組小鼠開始進行空間探索實驗。將平臺從水中移走，小鼠面壁放入第三象限水中，時間60 s，MWM測試系統(tǒng)自動記錄總路程（60 s內(nèi)運動總路徑的長度）、平均速度（總路程/時間60 s）、探索策略（趨向式和邊緣式為主，趨向式表明空間參考記憶能力較好）、目標時間（在目標象限停留時間）、目標路程（在目標象限運動路徑的長度）占總路程的比例、穿越時間（入水至第一次穿越目標區(qū)域的時間）、穿越次數(shù)（60 s內(nèi)穿越目標區(qū)域的次數(shù)）。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 CHC對小鼠入睡潛伏期、睡眠持續(xù)時間的影響

各組小鼠入睡潛伏期比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與空白對照組比較，地西泮組和CHC高、中、低劑量組小鼠睡眠持續(xù)時間均延長（P＜0.05或P＜0.01）。與地西泮組比較，CHC中、高劑量組小鼠睡眠持續(xù)時間均延長（P＜0.01）。各組小鼠入睡潛伏期和睡眠持續(xù)時間的檢測結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠入睡潛伏期和睡眠持續(xù)時間的檢測結(jié)果（± s，n＝12）Tab 1 Sleep latency and sleep duration of mice in each grou（p±s，n＝12）

表1 各組小鼠入睡潛伏期和睡眠持續(xù)時間的檢測結(jié)果（± s，n＝12）Tab 1 Sleep latency and sleep duration of mice in each grou（p±s，n＝12）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與地西泮組比較，ΔΔP＜0.01Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.diazepam group，ΔΔP＜0.01

組別空白對照組地西泮組CHC高劑量組CHC中劑量組CHC低劑量組8.51±8.11 5.92±3.61 10.33±12.62 11.91±9.53 12.62±14.62 42±24 119±55＊310±91＊＊ΔΔ215±89＊＊ΔΔ162±82＊＊入睡潛伏期，s 睡眠持續(xù)時間，s

3.2 CHC對小鼠睡眠前后自主活動的影響

與空白對照組比較，地西泮組和CHC各劑量組小鼠睡前和醒后站立次數(shù)均減少，地西泮組小鼠醒后活動次數(shù)減少（P＜0.05或P＜0.01）。與地西泮組比較，CHC中、高劑量組小鼠醒后活動次數(shù)均增加，CHC低劑量組小鼠睡前活動次數(shù)減少（P＜0.05或P＜0.01）。與睡前比較，空白對照組、地西泮組和CHC各劑量組小鼠醒后活動次數(shù)（除地西泮組外）均增加、醒后站立次數(shù)均減少（P＜0.05或P＜0.01）。其余指標差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組小鼠睡眠前后自主活動次數(shù)和站立次數(shù)的檢測結(jié)果見表2。

3.3 CHC對小鼠睡眠前后避暗實驗的影響

與空白對照組比較，CHC高劑量組小鼠睡前避暗潛伏期延長，地西泮組小鼠睡前錯誤次數(shù)增加（P＜0.05或P＜0.01）。與地西泮組比較，CHC各劑量組小鼠睡前錯誤次數(shù)均減少（P＜0.01）。與睡前比較，空白對照組小鼠醒后避暗潛伏期延長，地西泮組小鼠醒后錯誤次數(shù)減少，CHC低、高劑量組小鼠醒后避暗潛伏期延長（P＜0.05或P＜0.01）。其余指標差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組小鼠睡眠前后避暗潛伏期和錯誤次數(shù)的檢測結(jié)果見表3。

表2 各組小鼠睡眠前后自主活動次數(shù)和站立次數(shù)的檢測結(jié)果（±s，n＝12）Tab 2 The times of autonomic activities and standing times in mice before and after sleep in each group（±s，n＝12）

表2 各組小鼠睡眠前后自主活動次數(shù)和站立次數(shù)的檢測結(jié)果（±s，n＝12）Tab 2 The times of autonomic activities and standing times in mice before and after sleep in each group（±s，n＝12）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與地西泮組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與睡前比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.diazepam group，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；vs.before sleep，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 活動次數(shù)睡前 醒后站立次數(shù)睡前 醒后空白對照組地西泮組CHC高劑量組CHC中劑量組CHC低劑量組17.2±6.4 19.3±10.3 15.0±7.7 16.8±8.9 10.9±4.7Δ47.1±21.3##19.1±14.3＊67.1±37.2ΔΔ#70.2±52.1ΔΔ##38.3±28.1#67.2±12.2 29.3±17.4＊＊38.2±15.1＊＊36.2±16.3＊＊29.3±9.8＊＊30.2±32.1##12.1±10.2＊＊##3.9±8.7＊＊##3.3±5.3＊＊##5.1±5.5＊＊##

表3 各組小鼠睡眠前后避暗潛伏期和錯誤次數(shù)的檢測結(jié)果（±s，n＝12）Tab 3 The escape incubation period and the number of errors in mice before and after sleep in each group（± s，n＝12）

表3 各組小鼠睡眠前后避暗潛伏期和錯誤次數(shù)的檢測結(jié)果（±s，n＝12）Tab 3 The escape incubation period and the number of errors in mice before and after sleep in each group（± s，n＝12）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與地西泮組比較，ΔΔP＜0.01；與睡前比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.diazepam group，ΔΔP＜0.01；vs.before sleep，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白對照組地西泮組CHC高劑量組CHC中劑量組CHC低劑量組避暗潛伏期，min睡前0.31±0.32 0.45±0.61 0.90±0.82＊0.79±0.88 0.48±0.35醒后1.83±1.70#1.65±1.68 2.59±2.14#1.05±1.34 2.66±2.15##錯誤次數(shù)睡前1.67±0.89 4.02±1.48＊＊2.33±1.44ΔΔ1.92±0.90ΔΔ2.00±0.60ΔΔ醒后2.25±2.53 1.92±1.24##2.50±2.50 2.75±2.34 2.58±3.34

3.4 CHC對小鼠定位航行空間認知的影響

與空白對照組，地西泮組小鼠逃避潛伏期延長（P＜0.05），其余指標差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。定位航行搜索策略，空白對照組和CHC高劑量組小鼠多為直線式或趨向式，地西泮組和CHC低、中劑量組小鼠多為邊緣式，各組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組小鼠定位航行實驗的檢測結(jié)果見表4。

表4 各組小鼠定位航行實驗的檢測結(jié)果（±s，n＝12）Tab 4 Results of place navigation test of mice in each group（±s，n＝12）

表4 各組小鼠定位航行實驗的檢測結(jié)果（±s，n＝12）Tab 4 Results of place navigation test of mice in each group（±s，n＝12）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05

組別空白對照組地西泮組CHC高劑量組CHC中劑量組CHC低劑量組逃避潛伏期，s 43.1±19.6 53.2±15.5＊50.2±16.8 51.3±18.9 52.1±17.9搜索策略直線式，只21111趨向式，只52543邊緣式，只59678邊緣式百分率，% 42 75 50 58 67

3.5 CHC對小鼠空間探索參考記憶的影響

空間探索測試中，第一次穿越目標時間、穿越目標次數(shù)、總路程、平均速度和穿越策略各組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與空白對照組比較，地西泮組小鼠目標時間和目標路程占總路程的比例均減少（P＜0.05），其余指標差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組小鼠空間探索實驗的檢測結(jié)果見表5。

4 討論

筆者前期研究顯示，蛇床子有鎮(zhèn)靜催眠作用且醒后宿醉反應較地西泮輕[8]；CHC對睡眠剝奪大鼠具有顯著催眠作用，且明顯促進其空間認知和空間參考記憶[4]。但課題組尚未對CHC的不良反應作進一步的評價。本實驗結(jié)果表明，CHC與地西泮比較，其鎮(zhèn)靜催眠作用較強而宿醉反應較弱。

表5 各組小鼠空間探索實驗的檢測結(jié)果（±s，n＝12）Tab 5 Results of spatial probe test of mice in each group（±s，n＝12）

表5 各組小鼠空間探索實驗的檢測結(jié)果（±s，n＝12）Tab 5 Results of spatial probe test of mice in each group（±s，n＝12）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05

組別空白對照組地西泮組CHC高劑量組CHC中劑量組CHC低劑量組目標時間，s 23.8±8.3 15.8±7.6＊23.2±9.5 22.7±11.4 21.6±10.2目標路程占總路程的比例，% 0.40±0.14 0.26±0.13＊0.39±0.16 0.38±0.19 0.36±0.17穿越時間，s 12.3±15.2 10.5±16.2 9.8±5.3 10.9±14.1 11.1±10.8穿越次數(shù)3.72±1.81 2.31±3.01 2.32±2.11 2.71±2.62 1.83±1.31總路程，m 7.61±1.42 7.02±2.21 6.13±2.23 6.91±2.22 7.22±1.14平均速度，cm/s 12.7±2.3 11.6±3.7 10.2±3.6 11.4±3.6 12.0±1.9搜索策略趨向式，只63554邊緣式，只69778邊緣式百分率，% 50 75 58 58 67

戊巴比妥鈉協(xié)同催眠實驗是研究鎮(zhèn)靜催眠藥物催眠作用的常用實驗之一[9]。戊巴比妥鈉引起鎮(zhèn)靜是通過選擇性抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)而發(fā)揮作用的。CHC協(xié)同閾劑量戊巴比妥鈉可顯著延長小鼠的睡眠持續(xù)時間，且作用顯著強于地西泮，提示CHC鎮(zhèn)靜催眠作用顯著。

動物的自主活動可以反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能狀態(tài)，當中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮時動物活動次數(shù)增加，抑制時則活動次數(shù)減少[10]。本實驗結(jié)果表明，地西泮抑制了醒后小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而CHC則沒有這種抑制作用。

避暗實驗均為被動性回避實驗，可用于研究藥物對動物學習記憶功能的影響，當避暗潛伏期長或錯誤次數(shù)少時，說明動物的學習記憶能力較強，反之則較弱。本研究將自主活動實驗與避暗實驗結(jié)合起來，從中樞興奮性及學習記憶能力兩個方面考察了CHC及地西泮對小鼠行為學的影響。本實驗結(jié)果表明，地西泮對醒后小鼠的學習記憶能力有抑制作用，而CHC則沒有這種抑制作用。

MWM主要是用于研究大鼠或小鼠的空間學習記憶能力。本實驗結(jié)果表明，地西泮可以導致小鼠學習和記憶能力的下降，而CHC則無此顯著作用。

綜上所述，CHC對小鼠有鎮(zhèn)靜催眠作用，但對其醒后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性和學習記憶能力均無影響，提示了CHC沒有宿醉反應。

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Effects of Hypnotic Active Constituent of Cnidium monnieri on Sedation and Hypnosis，Learning and Memory，Hangover of Mice

MA Lan，TONG Liguo，SONG Meiqing，HU Wenzhuo，JIA Lili，NIU Yanyan，ZHONG Qiming，F(xiàn)ENG Mali（Shanxi Academy of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan 030012，China）

OBJECTIVE：To study the effects of hypnotic active constituent of Cnidium monnieri（CHC）on sedation and hypnosis，learning and memory，hangover of mice.METHODS：60 mice were randomly divided into blank control group（2%Tween 80 solution），diazepam group（6 mg/kg）and CHC high-dose，medium-dose and low-dose groups（520，260，130 mg/kg），with 12 mice in each group.They were given relevant medicine intragastrically twice a day.The sleep latency and sleep duration，the times of autonomic activities and standing times after sleep，escape incubation period and the number of errors in step through test were observed in each group 1 d after medication.The place navigation test and spatial probe test were conducted 16 day after medication.RESULTS：Compared with blank control group，sleep duration of mice was prolonged in diazepam group and CHC groups while standing times before and after sleep were decreased；in diazepam group，the number of errors was increased before sleep，while activity times was decreased after sleep；escape incubation period was prolonged，while target time was shortened；the ratio of target distance was decreased；escape incubation period of mice was prolonged in CHC high-dose group，with statistical significance（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with diazepam group，sleep duration of mice was prolonged in CHC medium-dose and high-dose group，and activity times after sleep were increased；activity times before sleep were decreased in CHC low-dose group；the number of errors before sleep were decreased in CHC groups，with statistical significance（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with before sleep，escape incubation period of blank control group was prolonged；activity times after sleep of CHC groups were increased while standing times after sleep were decreased；escape incubation period after sleep was prolonged（except for medium-dose group），with statistical significance（P＜0.05 or P＜0.01）.There was no statistical significance in other indexes（P＞0.05）.CONCLUSIONS：CHC shows sedation and hypnotic effect in mice，but has no effect on learning and memory and doesn’t induce hangover response.

Cnidium monnieri；Hypnotic active constituent；Sedation and hypnosis；Learning and memory；Hangover

R965

A

1001-0408（2016）34-4764-04

2016-02-23

2016-05-01）

（編輯：鄒麗娟）

國家自然科學基金面上項目（No.81173574）；山西省實驗動物專項資金項目[No.2013（K05）]

＊碩士研究生。研究方向：中藥有效性與安全性評價。電話：0351-4174328。E-mail：814788701@qq.com

#通信作者：主任醫(yī)師，碩士。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎藥理學。電話：0351-4174328。E-mail：fengmali1@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.34.04