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    脂聯(lián)素通過干擾TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)抑制血管平滑肌細胞泡沫化*

    2016-12-19 11:07:26尹延偉孫倩倩張英謙胡愛民
    重慶醫(yī)學(xué) 2016年32期
    關(guān)鍵詞:泡沫化油紅平滑肌

    尹延偉,孫倩倩,張英謙,胡愛民,楊 芬,石 進△

    (1.空軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京 100142;2.空軍北京勁松干休所,北京100021;3.空軍總醫(yī)院急診部,北京 100142)

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    ·論 著·

    脂聯(lián)素通過干擾TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)抑制血管平滑肌細胞泡沫化*

    尹延偉1,孫倩倩2,張英謙1,胡愛民3,楊 芬1,石 進1△

    (1.空軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京 100142;2.空軍北京勁松干休所,北京100021;3.空軍總醫(yī)院急診部,北京 100142)

    目的 探討脂聯(lián)素(APN)抑制氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞(VSMCs)泡沫化是否與干擾Toll樣受體4(TLR4)及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相關(guān)。方法 組織貼塊法培養(yǎng)C57BL/6J背景野生型及TLR4基因敲除(TLR4-/-)小鼠主動脈VSMCs。油紅O染色觀察VSMCs內(nèi)脂質(zhì)聚積;酶法檢測VSMCs內(nèi)膽固醇水平;Western blot檢測VSMCs TLR4蛋白表達;ELISA方法檢測VSMCs培養(yǎng)液中炎癥因子IL-6和TNF-α的表達。結(jié)果 ox-LDL刺激VSMCs 48 h顯著誘導(dǎo)細胞泡沫化;ox-LDL誘導(dǎo)VSMCs泡沫化過程中伴隨著TLR4及其下游炎癥因子IL-6、TNF-α表達的上調(diào);而對于TLR4-/-型VSMCs,ox-LDL刺激并不能有效誘導(dǎo)VSMCs泡沫化及IL-6、TNF-α表達上調(diào);APN顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs泡沫化,伴隨著TLR4及其下游炎癥因子IL-6、TNF-α表達的下調(diào)。結(jié)論 APN可通過干擾TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)抑制ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs泡沫化。

    脂聯(lián)素;Toll樣受體4;血管平滑肌細胞;泡沫細胞

    動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是多種心腦血管疾病發(fā)生的病理基礎(chǔ),其以泡沫細胞在血管內(nèi)皮下的大量堆積并伴隨致炎因子的過度表達為特征[1]。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)是泡沫細胞的主要來源細胞之一。之前有研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素(adiponectin,APN)參與AS過程中VSMCs的遷移、增殖與表型轉(zhuǎn)化[2]。Toll樣受體4(toll like recepter 4,TLR4)是啟動免疫和炎性反應(yīng)的重要膜受體,已證實激活TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可顯著促進VSMCs的遷移、增殖與表型轉(zhuǎn)化[3-4]。本研究旨在探討APN是否可通過干擾TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)抑制VSMCs泡沫化,為動脈粥樣硬化的防治提供新思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物 C57BL/6J背景野生型小鼠購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心,C57BL/6J背景TLR4基因敲除(TLR4-/-)小鼠購自上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司,SPF級飼養(yǎng)。實驗用小鼠均為8周齡雄性小鼠,采用組織貼塊法培養(yǎng)原代VSMCs[5]。將原代培養(yǎng)VSMCs分為對照組、ox-LDL組和APN+ox-LDL組。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標準。

    1.1.2 主要試劑 胎牛血清(FBS)、DMEM細胞培養(yǎng)液、抗生素、胰酶購自美國Hyclone公司;氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)購自廣州奕源生物有限公司;油紅O染料、APN購自美國Aldrich Sigma 公司;抗β-actin單克隆抗體(小鼠抗)、抗TLR4單克隆抗體(小鼠抗)購自美國Santa Cruz公司;辣根酶標記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉生物技術(shù)公司;酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(IL-6及TNF-α)購自美國R&D Systems公司。

    1.2 方法

    1.2.1 油紅O染色 用異丙醇配制0.5%的油紅O貯存溶液,與蒸餾水按照3∶2比例稀釋成工作液。ox-LDL刺激細胞48 h后將VSMCs用磷酸鹽緩沖液洗滌3次,10%多聚甲醛溶液固定20 min,加入油紅O工作液,閉光染色30 min。60%異丙醇溶液脫色后鏡下觀察。

    1.2.2 膽固醇水平的檢測 細胞內(nèi)總膽固醇水平依據(jù)Xue等[6]的報道方法進行檢測。ox-LDL刺激細胞48 h后,將VSMCs收集到離心管中,加入100 μL異丙醇萃取細胞內(nèi)脂質(zhì)成分。超聲破碎,1 500×g離心10 min。收集上清液,采用酶法測定的方法檢測細胞內(nèi)膽固醇水平。結(jié)果根據(jù)細胞蛋白水平進行標準化。

    1.2.3 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測 ox-LDL刺激VSMCs 48 h后,常規(guī)提取細胞蛋白并定量檢測。50 μg蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后,電轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉液室溫條件下封閉2 h。加一抗溶液(小鼠抗TLR4單克隆抗體,1∶1 000;小鼠抗β-actin單克隆抗體,1∶1 000)4 ℃孵育過夜,TBST溶液洗膜4次,每次10 min,加二抗溶液(辣根酶標記山羊抗小鼠IgG,1∶2 000)室溫孵育2 h,TBST溶液洗膜4次,每次10 min,化學(xué)發(fā)光法曝光,Lab4.6軟件對掃描結(jié)果進行分析。

    1.2.4 ELISA檢測 ox-LDL刺激VSMCs 48 h后,收集培養(yǎng)液,每孔加入50 μL檢測稀釋液RD1N;分別設(shè)定標準孔、對照孔、待測樣品孔(每孔加入50 μL);酶標板加上覆膜,室溫孵育2 h;棄去液體,洗滌液洗滌5次;每孔加入100 μL IL-1β歐聯(lián)物,加蓋新的覆膜室溫下孵育2 h;棄去液體,洗滌液洗滌5次;每孔加入100 μL底物溶液,室溫孵育30 min,避光操作;每孔加入100 μL終止液,輕輕晃動混勻;30 min內(nèi)用ELISA測定儀測定450 nm波長條件下每孔的光密度。

    2 結(jié) 果

    2.1ox-LDL顯著促進VSMCs泡沫化 由圖1油紅O染色可見ox-LDL刺激明顯誘導(dǎo)VSMCs泡沫化(圖1A);此外,細胞內(nèi)脂質(zhì)測定結(jié)果也顯示ox-LDL刺激顯著增加VSMCs中膽固醇水平(圖1B),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    2.2ox-LDL通過激活TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)促進VSMCs泡沫化 由圖2可見ox-LDL刺激在顯著誘導(dǎo)野生型VSMCs泡沫化的同時顯著上調(diào)TLR4及其下游炎癥因子IL-6、TNF-α的表達水平,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);而對于TLR4-/-型VSMCs,ox-LDL刺激并不能有效誘導(dǎo)細胞泡沫化,同時,ox-LDL刺激也不能有效上調(diào)TLR4及其下游炎癥因子IL-6、TNF-α的表達,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    A:油紅O染色;B:膽固醇水平。*:P<0.05,與對照組比較。

    圖1 原代VSMCs泡沫化情況檢測

    A:油紅O染色;B:膽固醇水平;C:TLR4表達;D:IL-6及TNF-α表達。*:P<0.05,與對照組比較;#:P<0.05,與ox-LDL組比較。

    圖2 原代VSMCs泡沫化情況及TLR4、IL-6、TNF-α表達水平的檢測

    2.3APN抑制ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs泡沫化 由圖3可見APN預(yù)刺激2h明顯抑制ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs泡沫化;此外,細胞內(nèi)脂質(zhì)測定結(jié)果也顯示APN預(yù)刺激2h顯著抑制ox-LDL刺激引起的VSMCs內(nèi)膽固醇水平增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    A:油紅O染色;B:膽固醇水平。*:P<0.05,與對照組比較;#:P<0.05,與ox-LDL組比較。

    圖3 原代VSMCs泡沫化情況檢測

    2.4APN通過干擾TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)抑制ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs泡沫化 由圖4可見ox-LDL刺激可顯著上調(diào)VSMCsTLR4及其下游炎癥因子L-6、TNF-α的表達水平,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);而用APN預(yù)刺激VSMCs2h后,ox-LDL刺激并不能有效上調(diào)TLR4及其下游炎癥因子L-6、TNF-α的表達,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    A:TLR4表達;B:IL-6及TNF-α表達。*:P<0.05,與對照組比較;#:P<0.05,與ox-LDL組比較。

    圖4 原代VSMCsTLR4、IL-6、TNF-α表達水平的檢測

    3 討 論

    目前,AS目前已成為世界范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康的重大公共衛(wèi)生問題,盡管其發(fā)生、發(fā)展涉及非常復(fù)雜的病理過程,與年齡、性別、血脂異常、高血壓、糖尿病、肥胖、吸煙、飲食、遺傳、地理及氣候等多種因素相關(guān),但關(guān)于AS確切的發(fā)病機制目前仍不十分明確[7]。泡沫細胞在血管內(nèi)皮下的大量沉積是AS的重要標志[1]。以往的觀點認為巨噬細胞是泡沫細胞的主要來源,后來的研究顯示,VSMCs也具有在細胞內(nèi)聚積脂質(zhì)并呈現(xiàn)泡沫細胞樣變的能力,一些AS病變中的泡沫細胞實際上是發(fā)生了表型轉(zhuǎn)化的VSMCs[8]。目前研究已證實VSMCs是中晚期AS病變中泡沫細胞的主要來源。因此,對平滑肌源性泡沫細胞形成的干預(yù)是延緩AS進程的重要環(huán)節(jié)。

    以往觀點認為,AS是一種退行性疾病,但近年來研究發(fā)現(xiàn)其同樣是一種慢性炎癥性疾病,AS的發(fā)生與發(fā)展始終伴隨著炎癥反應(yīng)[9]。因此,近年來大量研究開始從炎癥角度出發(fā)探索AS的發(fā)病機制。TLR4是廣泛表達于人體細胞膜上的炎癥相關(guān)蛋白分子,通過核因子κB(NF-κB)激活或JNK/SAPK激活途徑介導(dǎo)下游炎癥因子的表達,進而激活人體內(nèi)炎癥反應(yīng)。近年來研究發(fā)現(xiàn)TLR4介導(dǎo)的炎性反應(yīng)在VSMCs的遷移、增殖與表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用[3-4]。在本實驗中,用ox-LDL誘導(dǎo)VSMCs泡沫化,檢測TLR4及其下游炎癥因子IL-6、TNF-α的表達水平。研究發(fā)現(xiàn)ox-LDL刺激在明顯誘導(dǎo)野生型VSMCs泡沫化同時顯著上調(diào)TLR4及其下游炎癥因子IL-6、TNF-α的表達水平,說明VSMCs泡沫化過程中伴隨著TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)激活。為了進一步驗證以上結(jié)果,應(yīng)用ox-LDL刺激TLR4-/-型VSMCs,結(jié)果顯示TLR4缺陷損害ox-LDL的促泡沫化作用,這進一步說明TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在VSMCs泡沫化過程中的發(fā)揮重要作用。

    APN是一種由分化中的脂肪細胞分泌的細胞因子,其不僅具有抗炎及改善胰島素抵抗等活性,在抗AS方面也發(fā)揮重要作用。在本實驗中,發(fā)現(xiàn)用APN預(yù)刺激VSMCs2h可顯著抑制ox-LDL的促泡沫化作用,說明APN在阻礙平滑肌源性泡沫細胞形成方面具有重要作用,但其具體機制如何不得而知。有研究發(fā)現(xiàn),APN可能具有通過干擾TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)進而抑制巨噬細胞源性泡沫細胞形成的作用[10]。此外,APN還可以通過抑制VSMCs遷移、增殖與表型轉(zhuǎn)化對AS的發(fā)展起到阻礙作用[2]?;谝陨涎芯客茰y,APN可能具有通過干擾TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)進而抑制平滑肌源性泡沫細胞形成的作用。為了驗證以上假設(shè),本文在前期實驗基礎(chǔ)之上進一步檢測了TLR4及其下游炎癥因子IL-6、TNF-α的表達水平,研究發(fā)現(xiàn)APN預(yù)刺激顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的TLR4激活及其下游炎癥因子L-6、TNF-α的表達水平,說明APN可通過干擾TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)抑制ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs泡沫化。

    綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)激活TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可促進VSMCs對脂質(zhì)的攝取,APN可通過干擾以上炎癥過程抑制VSMCs對脂質(zhì)的攝取進而阻礙泡沫細胞的形成,進而在抗AS過程中發(fā)揮重要的作用。本研究從一個新的角度探討了平滑肌源性泡沫細胞形成的分子機制。該研究將為AS的防治提供新的思路。

    [1]YuXH,FuYC,ZhangDW,etal.Foamcellsinatherosclerosis[J].ClinChimActa,2013(424):245-252.

    [2]StoletovK,FangLH,ChoiSH,etal.Vascularlipidaccumulation,lipoproteinoxidation,andmacrophagelipiduptakeinhypercholesterolemiczebrafish[J].CircRes,2009,104(8):952-960.

    [3]ZhangLL,GaoCY,FangCQ,etal.PPARγattenuatesintimalhyperplasiabyinhibitingTLR4-mediatedinflammationinvascularsmoothmusclecells[J].CardiovascRes,2011,92(3):484-493.

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    [5]曹小潔,張莉莉,郭露,等.oxLDL通過PPARγ-ABCG1通路促進血管平滑肌細胞泡沫化[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2015,37(4):325-329.

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    [7]GaleslootTE,JanssLL,BurgessS,etal.Ironandhepcidinasriskfactorsinatherosclerosis:whatdothegenessay?[J].BMCGenet,2015,16(1):79.

    [8]DoranAC,MellerN,McnamaraCA.Roleofsmoothmusclecellsintheinitiationandearlyprogressionofatherosclerosis[J].ArteriosclerThrombVascBiol,2008,28(5):812-819.

    [9]YinYW,LiaoSQ,ZhangMJ,etal.TLR4-mediatedinflammationpromotesfoamcellformationofvascularsmoothmusclecellbyupregulatingACAT1expression[J].CellDeathDis,2014(5):1574.

    [10]WangM,WangD,ZhangY,etal.Adiponectinincreasesmacrophagescholesteroleffluxandsuppressesfoamcellformationinpatientswithtype2diabetesmellitus[J].Atherosclerosis,2013,229(1):62-70.

    Adiponectin inhibits foam cell formation of vascular smooth muscle cell by interfering TLR4-mediated inflammation reaction*

    YinYanwei1,SunQianqian2,ZhangYingqian1,HuAimin3,YangFen1,ShiJin1△

    (1.DepartmentofNeurology,AirForceGeneralHospital,Beijing100142,China;2.JinsongSanatoriumofBeijingAirForce,Beijing100021,China;3.DepartmentofEmergency,AirForceGeneralHospital,Beijing100142,China)

    Objective To investigate whether adiponectin(APN)inhibiting oxidized low density lipoprotein(ox-LDL)induced foam cell formation of vascular smooth muscle cells(VSMCs)is associated to interfere toll like recepter 4(TLR4)and its mediated inflammation reactions.Methods Primary VSMCs were isolated from the thoracic aorta of the male(C57BL/6J)wild-type mice and TLR4 knockout(TLR4-/-)mice.Oil red O staining was used to observe the intracellular lipid deposition in VSMCs;enzymatic assay was used to analyze the intracellular total cholesterol content in VSMCs;the expression of TLR4 in VSMCs was detected by Western blot;the levels of IL-6 and TNF-α in the VSNCs culture solution were quantified by using ELISA.Results Ox-LDL stimulating VSMC for 48 h significantly induced its foam cell formation,and this process was accompanied by the up-regulation of TLR4,downstream inflammatory factors IL-6 and TNF-α expression;however,in TLR4-/- VSMCs,the ox-LDL stimulation failed to effectively induce the VSMC foam cell formation,as well as the expression up-regulation of IL-6 and TNF-α;APN significantly inhibited the ox-LDL induced-VSMC foam cell formation,and down-regulated the expressions of TLR4,IL-6 and TNF-α.Conclusion APN could inhibit ox-LDL induced VSMC foam cell formation by interfering TLR4 mediated inflammation reaction.

    adiponectin;Toll like recepter 4;vascular smooth muscle cell;foam cell

    10.3969/j.issn.1671-8348.2016.32.001

    全軍醫(yī)學(xué)科技青年培育項目基金資助(13QNP080)。 作者簡介:尹延偉(1982-),主治醫(yī)師,博士,主要從事動脈粥樣硬化性心腦血管疾病防治與研究。△

    R543.5

    A

    1671-8348(2016)32-4465-03

    2016-04-02

    2016-05-15)

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