MiR-615-5p緩解Aβ25-35誘導(dǎo)的APOE4+/-型海馬細(xì)胞的凋亡和變性

姚 婕， 馬巧亞， 閻麗萍， 張紅梅， 姬文濤

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MiR-615-5p緩解Aβ25-35誘導(dǎo)的APOE4+/-型海馬細(xì)胞的凋亡和變性

姚 婕， 馬巧亞， 閻麗萍， 張紅梅， 姬文濤

目的 探討miR-615-5p對(duì)人海馬細(xì)胞的凋亡和變性的影響及潛在機(jī)制。方法 運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)正常、家族性AD和散發(fā)性AD老年人血液中miR-615-5p的表達(dá)水平，以及APOE4+/-型人胚海馬細(xì)胞和Aβ誘導(dǎo)的APOE4+/-海馬細(xì)胞中miR-615-5p的表達(dá)水平；在Aβ預(yù)處理的APOE4+/-型海馬細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-615-5p mimic和inhibitor后檢測(cè)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激標(biāo)志物含量和突觸生長標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平；運(yùn)用生物學(xué)信息分析和熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)預(yù)測(cè)并驗(yàn)證mir-615-5p對(duì)APOE基因的靶定調(diào)控關(guān)系。結(jié)果 散發(fā)性AD患者和細(xì)胞模型中miR-615-5p的表達(dá)水平顯著下調(diào)；過表達(dá)miR-615-5p顯著抑制海馬細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)突觸生長蛋白的表達(dá)，而沉默miR-615-5p則作用相反；mir-615-5p可靶定結(jié)合APOE mRNA，并下調(diào)APOE4+/-海馬細(xì)胞中APOE4蛋白的表達(dá)。結(jié)論 mir-615-5p通過靶向調(diào)節(jié)APOE，緩解Aβ25-35誘導(dǎo)的APOE4+/-型海馬細(xì)胞的凋亡和變性。

mir-615-5p； 阿爾茨海默??； 載脂蛋白4； 細(xì)胞凋亡； 氧化應(yīng)激

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種嚴(yán)重危害老年人身心健康的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，從最初的記憶減退，到失語、失聰、失用、失明，乃至最終的人格和行為完全改變[1]。我國人口日趨老齡化，AD造成的家庭負(fù)擔(dān)和社會(huì)負(fù)擔(dān)也隨之凸顯。近年來，大量臨床和基礎(chǔ)研究表明β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)在腦內(nèi)的進(jìn)行性沉積是AD的一項(xiàng)重要病理特征[2～5]。Aβ由淀粉樣蛋白前體蛋白(Amyloid precursor protein，APP)基因的編碼產(chǎn)物經(jīng)β-或γ-分泌酶水解而成，經(jīng)運(yùn)輸進(jìn)入腦脊液或腦間質(zhì)液中[2,3]。載脂蛋白E(apolipoprotein E)是機(jī)體內(nèi)運(yùn)輸脂蛋白和多種多肽的重要功能蛋白[6,7]。APOE的等位基因ε4編碼的蛋白APOE4與Aβ有高度的親和性，在Aβ運(yùn)輸進(jìn)入腦脊液的過程中發(fā)揮重要作用[6,8,9]。現(xiàn)有研究表明，APOE4表達(dá)個(gè)體比非APOE4表達(dá)個(gè)體的AD患病風(fēng)險(xiǎn)至少高4倍，APOE4已成為散發(fā)性AD的重要標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[4,10,11]。

MiR-615-5p是近年來新發(fā)現(xiàn)抑癌miRNA，對(duì)多種組織器官的癌變細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移具有抑制作用[12,13]。

最近，有報(bào)道顯示miR-615在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的表達(dá)水平顯著高于脊髓源性神經(jīng)干細(xì)胞[14]，提示其在神經(jīng)細(xì)胞分化和功能形成過程中發(fā)揮潛在作用。本研究對(duì)比正常、家族性AD和散發(fā)性AD老年人血液中miR-615-5p的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-615-5p散發(fā)性AD老年患者血液中表達(dá)水平顯著降低；進(jìn)一步在APOE4+/-型人胚海馬細(xì)胞中探索miR-615-5p對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元的凋亡和功能的影響，以期為散發(fā)性AD的治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料 磷酸緩沖鹽溶液PBS、青-鏈霉素購自天津?qū)汌紊铮籋oechst33258細(xì)胞凋亡染色劑、Aβ25-35、Aβ1-42、熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性CAT檢測(cè)試劑盒、丙二醛MDA含量測(cè)定試劑盒、活性氧ROS含量測(cè)定試劑盒、表皮生長因子(EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)購自美國Sigma公司；脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染試劑、DMEM/F12培養(yǎng)基、N2、B27、胎牛血清 (FBS)、膠原酶I、胰蛋白酶等購自Invitrogen公司；RNA提取試劑盒、總蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購自北京天根生化科技公司；實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司；PVDF膜、ECL蛋白發(fā)光檢測(cè)試劑盒購自美國Millipore公司；兔抗小鼠caspase-3抗體、兔抗小鼠caspase-9抗體、兔抗小鼠GAP-43抗體、兔抗小鼠Syn抗體、兔抗小鼠APOE4抗體、兔抗小鼠Aβ抗體和兔抗小鼠β-tululin抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自英國Abcam公司；細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶和其他細(xì)胞培養(yǎng)耗材購自南京賽業(yè)公司；miR-615-5p反轉(zhuǎn)錄試劑盒(含特異性反轉(zhuǎn)錄引物)和miR-615-5p實(shí)時(shí)定量試劑盒(含miR-615-5p上下游檢測(cè)引物和內(nèi)參基因U6 RNA引物)由廣州銳博生物技術(shù)有限公司提供；2’-甲氧基修飾的單鏈miR-615-5p 模擬寡核苷酸(mimic)、抑制寡核苷酸(inhibitor)和陰性對(duì)照寡核苷酸NC由瑞士Roche公司設(shè)計(jì)、合成并進(jìn)行有效性檢測(cè)(最適濃度為60 nmol)；其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。Bio-Rad實(shí)時(shí)定量PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方 法

1.2.1 倫理學(xué)聲明 本研究的方案經(jīng)由西安交通大學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。受試患者和志愿者均被告知詳細(xì)情況，并由本人/監(jiān)護(hù)人簽訂書面協(xié)議。

1.2.2 血液樣本采集 本研究受試者包括18名非AD志愿者、25名家族性AD患者和25名散發(fā)性AD患者。各組受試者年齡在55～70歲之間，平均年齡63歲左右，受試者中無腦部或全身感染、各類腫瘤、腦部外傷、卒中、癲癇等疾患，無過度瘦弱和過度肥胖者。受試者血液樣本由技術(shù)熟練的老年科住院部護(hù)士采集，采血在氣溫適宜的早晨(進(jìn)食前)進(jìn)行，于每個(gè)受試者前臂靜脈采集5 ml左右血液樣本，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 APOE4+/-型人胚海馬細(xì)胞的分離培養(yǎng) APOE4+/-型海馬細(xì)胞來源于2012年-2015年間本院的3例稀有病例,12～14 w流產(chǎn)、基因型為APOE4+/-的胚胎。分離雙側(cè)海馬， 無血清DMEM/F12培養(yǎng)液清洗后，剔除血管和腦膜后剪成1 mm3左右的小塊，0.125%胰酶、37 ℃消化10～12 min，加入少量含血清培養(yǎng)液終止消化。800 r/min離心 5 min，棄上清；加入適量培養(yǎng)基，800 r/min離心 5 min，棄上清，加入適量DMEM/F12培養(yǎng)液(添加1% N2、2% B27、20 ng/ml bFGF和20 ng/ml EGF)重懸沉淀，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板上，置 CO2于37 ℃、95%濕度、5%CO2條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1 h后吸取未貼壁神經(jīng)元，計(jì)數(shù)后接種105個(gè)細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng) 24 h后更換新培養(yǎng)液，之后每2～3次半量換液，觀察神經(jīng)元形態(tài)和生長情況。培養(yǎng)至10 d左右的細(xì)胞用于后續(xù)研究。

1.2.4 血液和海馬細(xì)胞中miR-615-5p表達(dá)水平的檢測(cè) 用血液總RNA提取試劑盒和細(xì)胞總RNA提取試劑盒分別提取血液樣本和海馬細(xì)胞中的總RNA，運(yùn)用miR-615-5p反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，定量試劑盒檢測(cè)miR-615-5p表達(dá)水平。反應(yīng)體系為25 μl體系，包括2 μl的cDNA模板(含500 ng cDNA)、上下游定量引物各0.5 μl(終濃度為0.5 μmol/L)、12.5 μl反應(yīng)緩沖液和9.5 μl超純水。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性1 min,以95 ℃變性15 s、60 ℃退火延伸60 s的條件擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，Bio-Rad實(shí)時(shí)定量PCR儀自帶IQ5軟件分析計(jì)算擴(kuò)增循環(huán)數(shù)Ct值，相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.5 Hoechst 33258染色檢測(cè)海馬細(xì)胞凋亡 對(duì)照和各處理以4%甲醛溶液固定1 h，以預(yù)冷的PBS溶液洗滌兩次，添加5 μg/ml Hoechst 33258染液覆蓋細(xì)胞樣品，室溫染色4 min。PBS洗滌3次，每次3 min，在熒光顯微鏡下觀察(340 nm激發(fā)光)。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：活細(xì)胞呈彌散、均勻熒光，凋亡內(nèi)可見濃染、致密的熒光顆粒，有3個(gè)或以上的DNA熒光碎片的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，Epies (R) Porfile Analyzer細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)軟件對(duì)正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后計(jì)算凋亡細(xì)胞比例。

1.2.6 Western印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，總蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞中總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量；配制SDS-PAGE凝膠，每個(gè)膠孔上樣50 ng蛋白樣品進(jìn)行電泳；2.5 h后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜；室溫下用5%脫脂奶粉緩沖液封閉轉(zhuǎn)有蛋白的PVDF膜1 h，分別加入兔抗小鼠caspase-3抗體(1∶400)、兔抗小鼠caspase-9抗體(1∶400)、兔抗小鼠GAP-43抗體(1∶300)、兔抗小鼠Syn抗體(1∶300)、兔抗小鼠APOE4抗體(1∶200)、兔抗小鼠Aβ抗體(1∶200)和兔抗小鼠β-tululin抗體(1∶800)，4 ℃孵育過夜；TBST緩沖液清洗PVDF膜3次，每次10 min；加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶1000)，室溫孵育2 h；TBST清洗4次，每次8 min，孵育ECL發(fā)光液，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影、采集圖像， Quantity One軟件進(jìn)行條帶分析，重復(fù)3次以上。

1.2.7 CAT活性、ROS和MDA水平的檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，離心棄上清，分別運(yùn)用膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性CAT檢測(cè)試劑盒、丙二醛MDA含量測(cè)定試劑盒、活性氧ROS含量測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中CAT的活性及ROS、MDA的含量，按照試劑盒說明書進(jìn)行逐步操作。

1.2.8 熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)驗(yàn)證miR-615-5p對(duì)APOE基因的靶定 擴(kuò)增APOE mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’untranslated region，3’UTR)全長，連接于pGL3雙熒光素酶報(bào)告基因載體上；將構(gòu)建好的載體單獨(dú)或與miR-615-5p mimic共同轉(zhuǎn)染于APOE4+/-型人胚海馬細(xì)胞中，孵育72 h，按熒光素酶報(bào)告基因分析試劑盒中所述步驟進(jìn)行操作，以多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 散發(fā)性AD患者血液中miR-615-5p的表達(dá)水平顯著下調(diào) 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)18名非AD志愿者、25名家族性AD患者和25名散發(fā)性AD患者血液中miR-615-5p的表達(dá)水平，結(jié)果顯示家族性AD患者血液中miR-615-5p的表達(dá)水平與非AD志愿者基本一致(P>0.05)，散發(fā)性AD患者血液中miR-615-5 p的表達(dá)水平顯著低于非AD志愿者(P<0.01)(見圖1A)。

2.2 Aβ處理降低AD細(xì)胞模型中miR-615-5 p的表達(dá)水平 分別以50 mmol KCl、10 μmol Aβ1-42、10 μmol Aβ25-35和等體積PBS(作為對(duì)照)處理APOE4+/-型人胚海馬細(xì)胞(見圖1B),Hoechst 33258染色結(jié)果所示，對(duì)照組中部分細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)濃染致密顆粒塊狀熒光(指示凋亡細(xì)胞)，KCl 處理后細(xì)胞內(nèi)多呈彌散均勻熒光，而Aβ1-42 或Aβ25-35處理后致密顆粒塊狀熒光增多(見圖1B)。同時(shí)實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果顯示，KCl處理促進(jìn)細(xì)胞中miR-615-5p的表達(dá)水平，而Aβ處理降低細(xì)胞中miR-615-5p的表達(dá)水平(見圖1C)。

2.3 miR-615-5p抑制Aβ誘導(dǎo)的APOE4+/-型海馬細(xì)胞凋亡 在Aβ預(yù)處理的APOE4+/-型海馬細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-615-5p mimic和inhibitor，mimic轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-615-5 p的表達(dá)水平提高至4倍以上(P<0.05)，inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-615-5 p的表達(dá)水平下降至30%左右(P<0.05，見圖2A)。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，mimic轉(zhuǎn)染組凋亡細(xì)胞的比例顯著下降，而inhibitor轉(zhuǎn)染組凋亡細(xì)胞的比例顯著上升(P<0.05，見圖2B)；凋亡關(guān)鍵基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，mimic轉(zhuǎn)染抑制半胱氨酸蛋白酶caspase-3和9的表達(dá)，而inhibitor轉(zhuǎn)染則促進(jìn)caspase-3和9的表達(dá)(見圖2C)。

2.4 miR-615-5p緩解Aβ誘導(dǎo)的APOE4+/-型海馬細(xì)胞氧化應(yīng)激、促進(jìn)突觸生長 分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平，結(jié)果(見表1)，miR-615-5p mimic轉(zhuǎn)染提高APOE4+/-海馬細(xì)胞中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(Choline acetyltransferase，CAT)的活性(P<0.05)，減少活性氧(Reactive oxygen species，ROS)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)的產(chǎn)生(P<0.05)，有助于緩解細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激。此外，免疫印跡定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-615-5p mimic促進(jìn)突觸生長標(biāo)志因子GAP-43(生長相關(guān)蛋白-43，growth associated protein)和Syn(突觸素，synaptophysin)的表達(dá)(P<0.05)。miR-615-5p inhibitor的作用則與miR-615-5p mimic相反(見表2)。

2.5 miR-615-5p靶向結(jié)合并抑制APOE4+/-型海馬細(xì)胞中APOE4蛋白的表達(dá) 我們運(yùn)用靶基因預(yù)測(cè)軟件TargetScan和miRDB預(yù)測(cè)到mir-615-5p可結(jié)合APOE mRNA的3’UTR區(qū)域，隨后運(yùn)用熒光素酶報(bào)告基因分析驗(yàn)證二者的結(jié)合，轉(zhuǎn)入mir-615-5p mimic后熒光素酶活性降低(見圖3A)，表明APOE4是mir-615-5p的靶基因。在APOE4+/-型海馬細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mir-615-5p mimic后，APOE4蛋白表達(dá)水平下降，Aβ含量也下降；mir-615-5p inhibitor轉(zhuǎn)染則促進(jìn)APOE4蛋白的表達(dá)，增加Aβ含量(見圖3B)。

表1 miR-615-5p表達(dá)變化對(duì)Aβ25-35預(yù)處理的APOE4+/-型人胚海馬細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響

與對(duì)照組(Aβ25-35處理組)比較*P<0.05

表2 miR-615-5p表達(dá)變化對(duì)APOE4+/-型人胚海馬細(xì)胞突觸生長標(biāo)志因子表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組(Aβ25-35處理組)比較*P<0.05

A.18名非AD志愿者、25名家族性AD患者和25名散發(fā)性AD患者血液中miR-615-5p的表達(dá)水平對(duì)比；B.50 mmol KCl、10 μmol Aβ1-42和10 μmol Aβ25-35分別處理APOE4+/-型人胚海馬細(xì)胞24 h后Hoechst 33258染色；C.50 mmol KCl、10 μmol Aβ1-42和10 μmol Aβ25-35分別處理APOE4+/-型人胚海馬細(xì)胞24 h后miR-615-5p的表達(dá)水平變化.與正常(對(duì)照)組比較aP<0.05,aaP<0.01

圖1 AD患者血液及散發(fā)性AD細(xì)胞模型中miR-615-5p表達(dá)水平的檢測(cè)

A.60 nmol miR-615-5p mimic和inhibitor分別轉(zhuǎn)染Aβ25-35預(yù)處理的APOE4+/-型人胚海馬細(xì)胞72 h后miR-615-5p的表達(dá)水平變化；B.miR-615-5p mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；C.miR-615-5p mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡蛋白caspase-9和caspase-3的水平變化.與 Aβ25-35處理組比較aP<0.05

圖2 miR-615-5p對(duì)Aβ預(yù)處理的APOE4+/-型海馬細(xì)胞的凋亡的影響

A.熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)驗(yàn)證miR-615-5p與APOE基因的靶定結(jié)合;B.miR-615-5p mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染后APOE4+/-型海馬細(xì)胞中APOE4蛋白和Aβ含量變化

圖3 miR-615-5p靶定APOE基因并抑制APOE4+/-型海馬細(xì)胞中APOE4的表達(dá)

3 討 論

自2007發(fā)現(xiàn)迄今，miR-615-5p功能報(bào)道多見于內(nèi)臟癌組織細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移的研究中，被鑒定為具有抑癌作用的miRNA。索耀君等首次探討miR-615在脊髓源性神經(jīng)干細(xì)胞與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元間的表達(dá)特征[14]，發(fā)現(xiàn)miR-615在分離的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中顯著高表達(dá)，揭開了miR-615在神經(jīng)系統(tǒng)功能和發(fā)育調(diào)控研究的序幕。本研究以AD患者和散發(fā)性AD細(xì)胞模型為研究對(duì)象，檢測(cè)并對(duì)比正常、家族性AD和散發(fā)性AD老年人血液中miR-615-5p的表達(dá)水平，以及APOE4+/-型海馬細(xì)胞和Aβ誘導(dǎo)的APOE4+/-海馬細(xì)胞中miR-615-5p的表達(dá)水平，散發(fā)性AD患者和細(xì)胞模型中miR-615-5p的表達(dá)水平顯著下調(diào)，提示miR-615-5p在散發(fā)性AD進(jìn)程中可能發(fā)揮調(diào)控作用。

AD發(fā)病機(jī)制在細(xì)胞和分子水平主要體現(xiàn)為Aβ等大量積累引起的細(xì)胞凋亡增加、氧化應(yīng)激和炎癥水平劇增和神經(jīng)突觸生長抑制[15～17]。在Aβ預(yù)處理的APOE4+/-型海馬細(xì)胞中以轉(zhuǎn)染miR-615-5p mimic和inhibitor的方式過表達(dá)或沉默miR-615-5p，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-615-5p顯著抑制海馬細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)突觸生長標(biāo)志因子的表達(dá)，而沉默miR-615-5p則對(duì)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和突觸生長因子表達(dá)有相反的結(jié)果。因此，本文從正反兩方面表明miR-615-5p對(duì)散發(fā)性AD細(xì)胞模型就有保護(hù)作用。

眾所周知，miRNA的生物學(xué)作用由其靶定基因的生物學(xué)功能決定。在肝癌細(xì)胞中，miR-615-5p通過靶定調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子2抑制癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[18]；在胰腺癌中和乳腺癌中，miR-615-5p的作用靶點(diǎn)為促進(jìn)細(xì)胞增殖的Akt2基因[12]；最近一項(xiàng)關(guān)于非小細(xì)胞肺癌的研究證實(shí)miR-615-5p可靶定結(jié)合并抑制腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白4基因從而抑制肺癌細(xì)胞增殖[19]。APOE4是散發(fā)性AD的重要標(biāo)志，APOE4高表達(dá)會(huì)加速Aβ進(jìn)入腦脊液的運(yùn)輸過程，從而加速AD的進(jìn)程[9,20,21]。本研究以APOE4等位基因?yàn)榘悬c(diǎn)，通過生物信息學(xué)工具對(duì)miR-615-5p和APOE的調(diào)控關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)，TargetScan和miRanda的輸出結(jié)果均表明APOE是miR-615-5p的潛在靶基因，隨后熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)和過表達(dá)后APOE4表達(dá)檢測(cè)結(jié)果也都證實(shí)APOE是miR-615-5p的靶基因，這也揭示了miR-615-5p能夠緩解APOE4+/-海馬細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)細(xì)胞突觸生長蛋白表達(dá)的原因。

綜上所述，miR-615-5p在散發(fā)性AD患者和細(xì)胞模型中表達(dá)水平顯著下調(diào)，可靶定結(jié)合并抑制APOE基因表達(dá)，從而緩解Aβ25-35誘導(dǎo)的APOE4+/-型海馬細(xì)胞的凋亡和變性。

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MiR-615-5p alleviates the apoptosis and degeneration of Aβ25-35-induced APOE4+/-hippocampus cells

YAO Jie,MA Qiaoya,YAN Liping,et al.[the First Ward of Cadre Ward

(Department of Aged Neurology),the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiao Tong University,Xi’an 710004,China]

Objective Apolipoprotein E4 (apoE4) to explore the regulatory role and mechanism of miR-615-5p in the apoptosis and function of human hippocampus cells.Methods Expression of blood miR-615-5p were detected with real-time qPCR in familial Alzheimer’s disease (AD) patients,sporadic AD patients and non-AD aged volunteers,as well as APOE4+/- human embryonic hippocampus cells and Aβ-pretreated APOE4+/-hippocampus cells;the mir-615-5p mimic or inhibitor was transfected into the Aβ-pretreated APOE4+/-hippocampus cells,and then cell apoptosis,oxidative stress level and synaptic growth protein expression were detected;bioinformatics and luciferase reporter gene analyses were applied to evaluate and validate the targeting relationship between miR-615-5p and APOE4.Results MiR-615-5p was significantly decreased in sporadic AD patients and Aβ-pretreated APOE4+/-hippocampus cells;mir-615-5p mimic transfection suppressed cell apoptosis and oxidative stress,and promoted the expression of synaptic growth proteins;in contrast,mir-615-5p inhibitor transfection had an opposite effect; APOE mRNA was targeted by mir-615-5p and APOE4 protein level in APOE4+/-hippocampus cells was suppressed by mir-615-5p mimic transfection.Conclusion MiR-615-5p alleviates the apoptosis and degeneration of Aβ25-35-induced APOE4+/-hippocampus cells.

miR-615-5p; Alzheimer’s disease; APOE4; Cell apoptosis; Oxidative stress

1003-2754(2016)06-0540-05

2016-04-06；

2016-05-30

[西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院干部病房一病區(qū)(老年神經(jīng)科)，陜西 西安 710004]

馬巧亞，E-mail：huiqingguohn@163.com

R734.2;Q752;Q291

A