CX3CR1對缺血性白質(zhì)的損傷作用

苗 晶， 于雪凡， 張 穎， 馮加純

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CX3CR1對缺血性白質(zhì)的損傷作用

苗 晶， 于雪凡， 張 穎， 馮加純

目的 明確CX3CR1在缺血性白質(zhì)中的分布與表達(dá)及與缺血性白質(zhì)損傷的關(guān)系。方法 將150只成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組及缺血組，采用雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎法制備缺血性白質(zhì)損傷模型，造模28 d后Morris水迷宮觀察學(xué)習(xí)記憶功能，同時(shí)于術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d、28 d觀察胼胝體、內(nèi)囊及視神經(jīng)的病理學(xué)變化和CX3CR1表達(dá)量的變化。結(jié)果 (1)造模后28 d，逃避潛伏期、探索路徑長度及跨越平臺次數(shù)缺血組較正常組和假手術(shù)組明顯增加，有顯著性差異(P<0.01)；(2)隨著缺血時(shí)間的延長，Luxol Fast Blue (LFB)染色可見髓鞘崩解范圍擴(kuò)大，分層明顯，部分髓鞘空泡狀；CX3CR1表達(dá)量逐漸增加，與CD11b標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目逐漸增多相一致且高于正常組和假手術(shù)組。結(jié)論 CX3CR1通過介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的變化對缺血性白質(zhì)產(chǎn)生損傷，進(jìn)而影響空間學(xué)習(xí)記憶功能。

腦缺血； 白質(zhì)； CX3CR1； 學(xué)習(xí)記憶

慢性腦缺血是缺血性卒中、Bingswanger病、血管性癡呆、Alzheimer病等多種疾病發(fā)生、發(fā)展過程的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，其中白質(zhì)的改變，尤其是腦室周圍和額葉皮質(zhì)下的白質(zhì)損傷與認(rèn)知功能障礙有著密切的聯(lián)系。已有研究報(bào)道，在急性缺血、創(chuàng)傷、感染等疾病中，CX3CR1表達(dá)上調(diào)對機(jī)體發(fā)揮炎性損害作用[1,2]，但其在引起白質(zhì)病變的研究中尚未見報(bào)道。本研究通過雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎法制備缺血性白質(zhì)損傷模型，觀察CX3CR1在缺血性白質(zhì)中的表達(dá)，探討其與缺血性白質(zhì)損傷的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及模型制備 健康雄性Wistar大鼠150只，3～4月齡，質(zhì)量250～280 g，吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)室提供，清潔級大鼠。按隨機(jī)數(shù)字法將大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、缺血組，每組50只，各組再按時(shí)間分為缺血1 d(n=10)、3 d(n=10)、7 d(n=10)、14 d(n=10)、28 d(n=10)。采用雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎法制備缺血性白質(zhì)損傷模型。具體方法如下：大鼠術(shù)前12 h禁食，4 h禁水。10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸部皮膚消毒去毛，頸部正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈后用“0”號線分別結(jié)扎其遠(yuǎn)、近端，并從中間剪斷，以確保阻斷頸總動脈供血，術(shù)后縫合切口放回籠中飼養(yǎng)。假手術(shù)組除不結(jié)扎、不剪斷雙側(cè)頸總動脈外，其余過程與手術(shù)組相同。

1.2 空間記憶能力測定 造模前及造模后28 d，采用Morris水迷宮法進(jìn)行空間記憶能力的測定。測試程序?yàn)槎ㄎ缓叫性囼?yàn)(place navigation)：每天訓(xùn)練一次，歷時(shí)5 d，將大鼠面向池壁分別從4個(gè)入水點(diǎn)隨機(jī)放入水中，記錄其在90 s內(nèi)尋找到并爬上平臺的時(shí)間和路程，即逃避潛伏期(escape latency)。如果大鼠在90 s內(nèi)未找到平臺，則由實(shí)驗(yàn)者用手牽引其至平臺上，讓大鼠停留10 s，再放回籠中，潛伏期記為90 s?？臻g探索試驗(yàn)(spatial probe)：在定位航行試驗(yàn)后去除平臺，任選一個(gè)入水點(diǎn)，將大鼠放入池中，記錄其在90 s內(nèi)跨越原平臺的次數(shù)。最后計(jì)算平均成績。

1.3 組織病理學(xué)觀察 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)(各組隨機(jī)取出5只)用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)進(jìn)行腹腔麻醉，取視交叉至小腦前的腦組織，用10%中性福爾馬林進(jìn)行固定，常規(guī)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、連續(xù)冠狀切片，厚度4 μm，Olympus光鏡下觀察胼胝體、內(nèi)囊、視束并記錄以下指標(biāo)：行LFB染色，觀察白質(zhì)形態(tài)學(xué)變化。激光共聚焦顯微技術(shù)觀察CX3CR1與CD11b的分布及表達(dá)情況；行CD11b免疫組化染色，光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野記錄上述部位陽性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目。

1.4 Western blot蛋白印跡 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只造模動物進(jìn)行腹腔麻醉后，斷頭，冰上小心分離腦白質(zhì)，進(jìn)行蛋白抽提,根據(jù)Brad-ford法對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，測定蛋白濃度、蛋白裂解液加入4X凝膠上樣緩沖液進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。PVDF轉(zhuǎn)膜、以含5%小牛血清的PBS-T室溫封閉1 h，然后用相應(yīng)的抗體(用含5%小牛血清的PBS-T配制)4 ℃孵育過夜，PBS-T洗膜3次，每次15 min。再用相應(yīng)的堿性磷酸酶標(biāo)記的IgG(用含5%小牛血清的PBS-T配制)室溫反應(yīng)1 h，PBS-T洗膜3次，每次15 min，然后進(jìn)行堿性磷酸酶顯色反應(yīng)，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)對電泳條帶的灰度進(jìn)行掃描分析。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)分析 造模前逃避潛伏期、探索路徑長度和跨越平臺次數(shù)，組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模后28 d上述指標(biāo)，缺血組較正常組比較明顯增加(P<0.01)，假手術(shù)組較正常組比較無明顯變化(P>0.05)(見表1)。

2.2 組織病理學(xué)分析

2.2.1 LFB染色顯示腦白質(zhì)髓鞘病理改變 同一時(shí)間點(diǎn)的正常組、假手術(shù)組髓鞘清晰分布于胼胝體、內(nèi)囊、外囊、扣帶回、視神經(jīng)等區(qū)域，髓鞘排列整齊，無水腫、分層、斷裂及空泡形成；在缺血組，隨著缺血時(shí)間的延長，髓鞘崩解范圍逐漸擴(kuò)大，部分出現(xiàn)空泡樣變化，其中缺血14 d時(shí)視神經(jīng)，缺血28 d時(shí)胼胝體及內(nèi)囊髓鞘分層、空泡化較明顯(見圖1)。

2.2.2 Western blot 結(jié)果 正常組及假手術(shù)組可以表達(dá)少量的CX3CR1；缺血組，隨著缺血時(shí)間的延長，CX3CR1表達(dá)量在28 d內(nèi)持續(xù)增加，表現(xiàn)為：1 d時(shí)略有增加;3 d時(shí)可見增加趨勢;14 d時(shí)較明顯(P<0.01);28 d時(shí)更加顯著(P<0.01)，組間比較，存在明顯差異(見圖2、圖3)。

2.2.3 免疫組化結(jié)果 CX3CR1主要表達(dá)于細(xì)胞膜表面，此類細(xì)胞能同時(shí)在膜上表達(dá)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD11b(見圖4)。同一時(shí)間點(diǎn)的正常組及假手術(shù)組在胼胝體、內(nèi)囊、視束可見少量小膠質(zhì)細(xì)胞，胞體較小，沒有突起；缺血組中，隨著缺血時(shí)間的延長，不同區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目逐漸增加，且胞體變大，出現(xiàn)較長突起，14 d時(shí)增加明顯(P<0.05)，28 d時(shí)更趨顯著(P<0.01)，組間比較，細(xì)胞總數(shù)存在顯著性差異(見表2)。其中，缺血14 d時(shí)視神經(jīng)改變較明顯(P<0.05)，缺血28 d時(shí)胼胝體改變明顯(P<0.01)，28 d時(shí)內(nèi)囊也可見較明顯變化(見表3)。

表1 各組大鼠28 d空間學(xué)習(xí)記憶功能檢測結(jié)果±s)

與正常組比較*P<0.01

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)小膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)目±s)(單位：個(gè)/視野)

與正常組比較*P<0.05,**P<0.01

表3 缺血組不同時(shí)間點(diǎn)不同部位小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目±s)(單位：個(gè)/視野)

同一部位組內(nèi)比較*P<0.05,**P<0.01

圖1 缺血后白質(zhì)不同區(qū)域髓鞘病理變化

圖2 各組不同時(shí)間點(diǎn)CX3CR1蛋白蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果(注：Z為正常組，S為假手術(shù)組，C為缺血組);圖3 各組不同時(shí)間點(diǎn)CX3CR1蛋白表達(dá)量(注：與正常組比較**P<0.01)

圖4 紅色熒光為CX3CR1；綠色熒光為CD11b；黃色熒光為二者共同表達(dá)于細(xì)胞膜上(×400)

3 討 論

近年來隨著影像學(xué)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識到腦白質(zhì)疏松不僅是衰老過程中的部分表現(xiàn)，而且可以使腦卒中發(fā)生的危險(xiǎn)性增加。因此，缺血性白質(zhì)損傷成為血管性癡呆的又一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。雙側(cè)頸總動脈永久性閉塞可引起白質(zhì)病變，在阻塞的急性期，腦血流立即下降，并在很低的水平持續(xù)2～3 d，形成了缺血-缺氧模型。該模型在術(shù)后2.5 h可以使胼胝體的血流減少到正常的48.8%，7 d之后，血流減少到60%～75%，并在這一低水平持續(xù)很長時(shí)間[3]，同時(shí)由于大鼠Wills環(huán)發(fā)達(dá)、代償好，并沒有導(dǎo)致任何一個(gè)腦區(qū)血流灌注完全停止，因而在一定程度上造成腦低灌注。綜上，本研究應(yīng)用雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎法這一經(jīng)典模型制備缺血性白質(zhì)損傷模型較可靠。

CX3CR1曾被稱為V28孤兒受體，現(xiàn)被認(rèn)為是七次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，當(dāng)與其配體Fractalkine結(jié)合后可被激活，通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號途徑發(fā)揮炎性作用[4]。Yeo等人對癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠腦室注射抗CX3CR1抗體，發(fā)現(xiàn)CX3CR1與癲癇狀態(tài)引起的炎性環(huán)境相關(guān)[5]。Clark等研究發(fā)現(xiàn)，CX3CR1可以通過增加突觸后膜興奮性導(dǎo)致慢性疼痛[2]。Shan 等通過單側(cè)黑質(zhì)內(nèi)注射MPP形成帕金森病模型，觀察到CX3CR1與該疾病引起的炎癥反應(yīng)有關(guān)[6]。綜上，CX3CR1與多種疾病如創(chuàng)傷、感染、變性疾病引起的炎性機(jī)制相關(guān)，但目前關(guān)于CX3CR1與慢性缺血引起的白質(zhì)損傷國內(nèi)外尚無報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，CX3CR1與缺血性白質(zhì)損傷密切相關(guān)，腦組織慢性缺血后，其主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞膜表面，且隨著缺血時(shí)間的延長，表達(dá)量逐漸增加。Jolivel等發(fā)現(xiàn)，在局灶性大腦中動脈閉塞模型中，cx3cr1基因敲除小鼠較雜合型小鼠梗死體積減小，血腦屏障破壞減輕[1]。Cipriani等發(fā)現(xiàn)替代基因cx3cr1后，急性缺血引起的腦組織損害減輕[7]，提示CX3CR1參與急性缺血引起腦組織變性壞死過程。本研究不僅發(fā)現(xiàn)CX3CR1與缺血相關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)在尚未形成明顯壞死病灶前，與缺血引起的腦白質(zhì)改變密切相關(guān)，這與病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果及行為學(xué)改變相一致，可為臨床干預(yù)缺血性白質(zhì)病變提供理論依據(jù)。

同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)隨著缺血時(shí)間的延長，表面標(biāo)記CD11b的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目在增加，與CX3CR1表達(dá)含量增加相一致。我們推測CX3CR1引起缺血后白質(zhì)損傷的機(jī)制可能如下：Fractalkine主要表達(dá)于神經(jīng)元，是在正常腦組織內(nèi)唯一出現(xiàn)的化學(xué)趨化因子，特異性與受體CX3CR1結(jié)合抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活，使其處于靜息狀態(tài)[8]；在缺血等炎性刺激時(shí)，CX3CR1表達(dá)增加會激活小膠質(zhì)細(xì)胞、促進(jìn)actin蛋白重聚、形態(tài)改變進(jìn)而使小膠質(zhì)細(xì)胞具有趨化活性，釋放炎性因子[5]；CX3CR1能作用與NF-κB產(chǎn)生Toll-4發(fā)揮炎性作用[7]；小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)主要的免疫細(xì)胞，CD11b標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞是產(chǎn)生IL-1β的主要的細(xì)胞，IL-1β在正常水平時(shí)，對于形成長時(shí)程增強(qiáng)及維持記憶功能很重要，若過度表達(dá)則可加重記憶損害[9]。因而，CX3CR1可能在缺血條件下激活小膠質(zhì)細(xì)胞從而介導(dǎo)腦白質(zhì)損傷，出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，但其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。此外，本研究主要觀察了CX3CR1在缺血28 d內(nèi)與白質(zhì)損傷的關(guān)系，至于其在缺血后期如何變化及與白質(zhì)改變的關(guān)系將是我們下一步將要深入研究的課題。

[1]Jolivel V,Bicker F,Biname F,et al.Perivascular microglia promote blood vessel disintegration in the ischemic penumbra[J].Acta Neuropathol,2015,129(2):279-295.

[2]Clark AK,Gruber-Schoffnegger D,Drdla-Schutting R,et al.Selective activation of microglia facilitates synaptic strength[J].J Neurosci,2015,35(11):4552-4570.

[3]Huang Y,Zhang W,Lin L,et al.Is endothelial dysfunction of cerebral small vessel responsible for white matter lesions after chronic cerebral hypoperfusion in rats[J].J Neurol Sci,2010,299(1/2):72-80.

[4]Arnoux I,Audinat E.Fractalkine signaling and microglia functions in the developing brain[J].Neural Plast,2015,2015:689404.

[5]Yeo SI,Kim JE,Ryu HJ,et al.The roles of fractalkine/CX3CR1 system in neuronal death following pilocarpine-induced status epilepticus[J].J Neuroimmunol,2011,234(1～2):93-102.

[6]Shan S,Hong-Min T,Yi F,et al.New evidences for fractalkine/CX3CL1 involved in substantia nigral microglial activation and behavioral changes in a rat model of Parkinson’s disease[J].Neurobiol Aging,2011,32(3):443-58.

[7]Cipriani R,Villa P,Chece G,et al.CX3CL1 is neuroprotective in permanent focal cerebral ischemia in rodents[J].J Neurosci,2011,31(45):16327-16335.

[8]Ryu J,Lee CW,Hong KH,et al.Activation of fractalkine/CX3CR1 by vascular endothelial cells induces angiogenesis through VEGF-A/KDR and reverses hindlimb ischaemia[J].Cardiovasc Res,2008,78(2):333-340.

[9]Williamson LL,Sholar PW,Mistry RS,et al.Microglia and memory: modulation by early-life infection[J].J Neurosci,2011,31(43):15511-15521.

The harmful effect of CX3CR1 on white matter lesions in ischemia

MIAO Jing,YU Xuefan,ZHANG Ying,et al.

(Department of Neurology,The First Hospital of Jilin University,Changchun 130021,China)

Objective To explore the distribution and expression of CX3CR1 in ischemic white matter and the relationship between it and white matter damaging.Methods Ischemia white matter lesions (WMLs) can be introduced experimentally by permanent,bilateral common carotid artery’s occlusion( 2VO) of rats to cause chronic cerebral ischemia.150 rats were randomly divided into three groups which included normal,vehicle and ischemia groups. Their spatial learning and memory abilities were assessed using the Morris water maze on the 28th day after operation.After 1 d,3 d,7 d,14 d and 28 d for surgery,rats were sacrificed.Coronal sections in corups callosum,capsula interna and optic nerves were stained with Luxol Fast Blue (LFB) and labeled with CX3CR1 and CD11b antibodies.Expression of CX3CR1 were assessed by Western blot.Results The ischemia groups increased escape latency and swimming distance of 2VO rats from 28 d in maze tests,together with the percent time in the target quadrant (P<0.01).Coronal sections showed vacuole-shape and breakdown of myelin by LFB at corups callosum,capsula interna and optic nerves where common labeled of CX3CR1 and CD11b were observed.Expression of CX3CR1 is increasing with the ischemic time prolong.Conclusion CX3CR1 may have an effect on the ischemia brain white matter by the changing of microglia,which results in dysmnesia.

Cerebral ischemia; White matter lesions; CX3CR1; Learning and memory

1003-2754(2016)06-0536-04

2016-04-09；

2016-05-30

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科和神經(jīng)科學(xué)中心，吉林 長春 130021)

馮加純，E-mail：fengjcfrank@qq.com

R743.3

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