• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞的影響

    2016-12-19 05:52:23羅學(xué)港
    體育科學(xué) 2016年7期
    關(guān)鍵詞:力竭腓腸肌骨骼肌

    郭 文,羅學(xué)港,王 慧,陳 旦

    ?

    降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞的影響

    郭 文1,羅學(xué)港2,王 慧2,陳 旦2

    目的:探討降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞的影響。方法:成年健康雄性SD大鼠,依據(jù)不同的預(yù)處理措施隨機(jī)分成5組:空白對(duì)照組、磷酸鹽緩沖液(PBS)預(yù)處理組、CGRP預(yù)處理組、辣椒素(CAP)預(yù)處理組、CAP預(yù)處理+ CGRP預(yù)處理組,各組動(dòng)物在安靜狀態(tài)時(shí)、運(yùn)動(dòng)80 min時(shí)和運(yùn)動(dòng)至力竭后即刻處死。然后用免疫組化和放射免疫方法檢測(cè)上述條件下大鼠腓腸肌神經(jīng)肌肉接頭CGRP的表達(dá)變化;用蘇木精-伊紅(HE) 染色觀察上述條件下運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠骨骼肌形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化;用化學(xué)比色的方法檢測(cè)上述條件下骨骼肌超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、過氧化氫酶(CAT)及丙二醛(MDA)的變化。結(jié)果:1)給予CGRP預(yù)處理后,大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間明顯縮短(P<0.05),而給予CAP預(yù)處理后大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05);2)CGRP免疫組織化學(xué)和放射免疫結(jié)果顯示,CGRP的免疫陽(yáng)性產(chǎn)物在肌纖維縱切面上,其形狀為橢圓形或棒狀,主要分布于肌纖維膜的表面。給予CGRP預(yù)處理后,大鼠腓腸肌神經(jīng)肌肉接頭CGRP的表達(dá)明顯升高(P<0.05),而給予CAP預(yù)處理后,大鼠腓腸肌神經(jīng)肌肉接頭CGRP的表達(dá)明顯下降(P<0.05);3)HE染色顯示,安靜狀態(tài)下各組骨骼肌的形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯改變;與安靜狀態(tài)相比,運(yùn)動(dòng)80min時(shí)除CGRP預(yù)處理組骨骼肌的細(xì)胞核明顯增多、增大外,其余各組均無明顯改變;力竭運(yùn)動(dòng)后即刻與安靜狀態(tài)下相比,除CAP預(yù)處理組無明顯改變外,其余各組骨骼肌的細(xì)胞核均明顯增多、增大;4)化學(xué)比色結(jié)果顯示,給予CGRP預(yù)處理后,大鼠骨骼肌中SOD、GSH-PX 和CAT的活性明顯下降(P<0.05),MDA的含量明顯上升(P<0.05),而給予CAP預(yù)處理后大鼠骨骼肌中SOD、GSH-PX 和CAT的活性明顯上升(P<0.05),MDA的含量明顯下降(P<0.05)。結(jié)論:CGRP 加劇了運(yùn)動(dòng)性疲勞的產(chǎn)生。

    降鈣素基因相關(guān)肽;運(yùn)動(dòng)性疲勞;骨骼??;自由基

    運(yùn)動(dòng)性疲勞是機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練刺激所產(chǎn)生的一系列綜合性復(fù)雜反應(yīng),易導(dǎo)致骨骼肌系統(tǒng)損傷,神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等功能障礙,機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力下降[7,19,28,32]。運(yùn)動(dòng)性疲勞的產(chǎn)生不僅與中樞神經(jīng)系統(tǒng)沒有足夠的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元驅(qū)動(dòng)有關(guān),而且與神經(jīng)肌肉接頭傳遞的失敗及周圍肌肉代謝水平的改變有關(guān)。因此,神經(jīng)肌肉接頭是運(yùn)動(dòng)性疲勞在外周產(chǎn)生的一個(gè)重要位點(diǎn)。目前,有關(guān)運(yùn)動(dòng)性疲勞與神經(jīng)肌肉接頭的研究主要集中于突觸前和突觸后[27,31]。在突觸前其可能存在的機(jī)制有:Ca2+內(nèi)流的下降;Ca2+對(duì)神經(jīng)末梢囊泡釋放敏感性的下降;可利用的囊泡數(shù)量下降。在突觸后其可能存在的機(jī)制有:乙酰膽堿受體(AChR)的脫敏;肌纖維膜興奮性的下降。

    自從在腦、脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢檢測(cè)出降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)后,CGRP在神經(jīng)肌肉接頭作為一種神經(jīng)調(diào)質(zhì)和/或營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑就被廣泛研究[5,10,20,25]。CGRP被輸送到神經(jīng)肌肉接頭的神經(jīng)末梢后貯存在致密核心小泡(LDCV)[6,15],以Ca2+依賴方式伴隨神經(jīng)刺激而釋放[10,22,30],從而影響肌肉的代謝、結(jié)構(gòu)和功能特征。因此,CGRP的變化將導(dǎo)致該神經(jīng)所支配骨骼肌的代謝、結(jié)構(gòu)和功能特征的改變[24]。研究表明,CGRP有“雙重效應(yīng)”,正常生理?xiàng)l件下CGRP的釋放對(duì)靶組織起營(yíng)養(yǎng)作用,能夠擴(kuò)張周圍血管,促進(jìn)AChR的合成,并對(duì)睪丸下降、胃腸活動(dòng)、胃酸分泌等有良好的功效,并能抑制活性氧自由基的產(chǎn)生和緩減組織的氧化應(yīng)激,對(duì)組織起內(nèi)源性的保護(hù)作用,然而,在應(yīng)激或病理?xiàng)l件下,CGRP也能直接或間接的導(dǎo)致脊髓、骨骼肌興奮性的改變和炎癥的發(fā)生,對(duì)組織造成損傷[12,17]。有關(guān)CGRP與運(yùn)動(dòng)性疲勞的關(guān)系,Homonko等和Theriault(1997)等的研究表明,一次性大強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致大鼠后肢運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元CGRP顯著提高[13];另有研究表明,在運(yùn)動(dòng)過程中骨骼肌CGRP的改變與運(yùn)動(dòng)和/或骨骼肌的缺血缺氧有關(guān)[4],這提示,CGRP可能與運(yùn)動(dòng)性疲勞的產(chǎn)生有關(guān),但CGRP在運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠神經(jīng)肌肉接頭的生理和生物學(xué)角色目前仍不清楚。

    本研究通過一次性運(yùn)動(dòng)至力竭疲勞動(dòng)物模型,運(yùn)用免疫組化、放射免疫、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE) 染色和化學(xué)比色的方法并結(jié)合補(bǔ)充外源性的CGRP和皮下注射CGRP耗竭劑的方法檢測(cè)CGRP對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)間、骨骼肌的形態(tài)結(jié)構(gòu)、酶的活性和自由基代謝的影響,探索CGRP與運(yùn)動(dòng)性疲勞之間的潛在關(guān)系。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

    成年健康雄性SD大鼠150只,體重200~250 g,購(gòu)自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,所有動(dòng)物經(jīng)一般體查均無異常。所有大鼠都置于同一動(dòng)物房,分籠飼養(yǎng),室溫16~22℃,相對(duì)濕度45%~55%,正常晝夜節(jié)律,自由飲食。CGRP、辣椒素和多克隆兔抗CGRP抗體均購(gòu)于Sigma公司,骨骼肌超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)、過氧化氫酶(catalase,CAT)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)均購(gòu)于南京建成生物工程研究所,CGRP 放射免疫試劑盒購(gòu)于北京東亞放免技術(shù)研究所。

    1.2 動(dòng)物模型制備

    1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

    將150只大鼠依據(jù)不同的預(yù)處理措施隨機(jī)分成5組:空白對(duì)照組、PBS預(yù)處理組、CGRP預(yù)處理組、CAP預(yù)處理組、CAP預(yù)處理+CGRP預(yù)處理組,各組大鼠在安靜狀態(tài)時(shí)、運(yùn)動(dòng)80 min時(shí)和運(yùn)動(dòng)至力竭后即刻處死。

    1.4 PBS、CGRP和CAP的預(yù)處理

    大鼠皮下注射PBS、CAP、純化的大鼠CGRP。PBS預(yù)處理組、CGRP預(yù)處理組和CAP預(yù)處理組于力竭運(yùn)動(dòng)前4天兩次皮下給予PBS(每次300 μl)、CGRP(每次120 μg,300 μl PBS溶解,Sigma)和CAP (每次50 mg/kg,溶于10%無水酒精+10%吐溫-80+80%生理鹽水中)。CAP預(yù)處理+ CGRP預(yù)處理組于力竭運(yùn)動(dòng)前8天的前1~4天兩次皮下給予CAP (每次50 mg/kg,溶于10%無水酒精+10%吐溫-80+80%生理鹽水中),后5~8天兩次皮下給予CGRP(每次120 μg,300 μl PBS溶解,Sigma)。

    1.5 組織制備

    各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛(4 ml/kg),待麻醉后快速取左側(cè)腓腸肌內(nèi)側(cè)頭,除去表面的凝血及結(jié)締組織,經(jīng)冰冷生理鹽水洗滌幾次,用濾紙吸干水分,用做放射免疫分析的標(biāo)本放入1 ml 0.1 M冰醋酸在手動(dòng)勻漿管中冰浴勻漿研磨,用做酶活性和自由基檢測(cè)的標(biāo)本按1 g組織中加入10 mL冰鹽水的比例作為勻漿介質(zhì)在手動(dòng)勻漿管中稀釋,并勻漿研磨,再經(jīng)4℃ 3 000 r/min離心10 min,取上清液貯存于-20℃冰箱保存待測(cè)。

    用作免疫組織化學(xué)染色和HE染色的組織,在上述大鼠麻醉快速取下左側(cè)腓腸肌內(nèi)側(cè)頭后,開胸經(jīng)左心室插管入升主動(dòng)脈,先灌以生理鹽水(150 ml),繼之以4%多聚甲醛磷酸緩沖液(500 ml,pH7.4,4℃)灌注固定,先快后慢。取右側(cè)腓腸肌內(nèi)側(cè)頭,剔除筋膜,入相同的灌注液4℃后固定過夜,0.01 M PBS充分洗滌后,OCT包埋于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.6 CGRP免疫組織化學(xué)染色

    標(biāo)本于-80℃冰箱取出后,-20℃三頓恒低溫切片機(jī)切片,片厚200 μm,進(jìn)行CGRP免疫組織化學(xué)染色,采用漂浮法,主要過程如下:1)切片用0.01 M PBS(pH 7.4)振動(dòng)漂洗3次,每次10 min;2)入含0.3%的甲醇雙氧水,20 min;3)0.01 M PBS(pH 7.4)振動(dòng)漂洗3次,每次10 min;4)入5 %正常小牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉2 h;5)入1∶1 000的多克隆兔抗CGRP抗體(Sigma)4℃孵育過3夜;6)0.01 M PBS(pH 7.4)振動(dòng)漂洗3次,每次10 min;7)入1∶200生物素化山羊抗兔IgG(Vector)37℃孵育2 h;8)0.01 M PBS(pH 7.4)振動(dòng)漂洗3次,每次10 min;9)入1∶200 ABC 復(fù)合物(Vector,預(yù)先 30 min配制),37℃ 2 h;10)入0.05% DAB + 0.03%雙氧水顯色,0.01 M PBS終止反應(yīng)、貼片、常規(guī)脫水、透明、封片。

    陰性對(duì)照采用正常小牛血清代替一抗,其余步驟與上述相同,結(jié)果為陰性。

    1.7 骨骼肌CGRP濃度的測(cè)定

    測(cè)定時(shí)用0.1 M的PBS 5倍稀釋。按要求依次加樣后,充分混勻,室溫放置20 min后,4℃ 3 000 rpm離心25 min,取上清液,在γ計(jì)數(shù)器上測(cè)定CPM數(shù)。通過預(yù)先編制的程序,直接給出CGRP濃度。

    1.8 HE染色

    標(biāo)本于-80℃冰箱取出后,0.01 M PBS充分洗滌后,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片厚4 μm。HE染色按下列步驟進(jìn)行:常規(guī)脫蠟,梯度乙醇脫水后行HE染色。蘇木精液染色6 min,流水沖洗,1%鹽酸處理3 s,稍水洗,1%氨水返藍(lán)5 s,流水沖洗,0.5%伊紅液染色3 min,稍水洗,80%、90%、100%乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固。

    1.9 SOD、GSH-PX、CAT活性測(cè)定及MDA含量測(cè)定

    SOD、GSH-PX、CAT的活性及MDA的含量測(cè)定采用比色法,組織蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。具體操作如下:1)取樣品加入潔凈試管中,依次加入各試劑,混勻,95℃或37℃水浴,加入中止液;2)蒸餾水調(diào)零,測(cè)定吸光度OD值;3)空白管用蒸餾水代替樣品,標(biāo)準(zhǔn)管用標(biāo)準(zhǔn)液代替樣品,其他步驟相同;4)根據(jù)樣品、空白管、標(biāo)準(zhǔn)管在分光光度計(jì)上的吸光度值,按公式計(jì)算MDA的含量和SOD、GSH-PX、CAT的活性。

    1.10 數(shù)據(jù)收集處理

    切片在Motic顯微鏡下觀察,CGRP的免疫組織化學(xué)染色和HE染色于每組每只動(dòng)物各取3張切片,每張切片采用Nikon Coolpix 950數(shù)碼相機(jī)在Motic顯微鏡下隨機(jī)取8個(gè)部位攝片。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1 平均力竭時(shí)間

    各組大鼠平均運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間如表1所示:空白對(duì)照組和PBS預(yù)處理組相比,兩組大鼠平均運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間無顯著性差異;CAP預(yù)處理組大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間明顯延長(zhǎng),與空白對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CGRP預(yù)處理組大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間明顯縮短,與空白對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);CAP預(yù)處理+CGRP預(yù)處理組與空白對(duì)照組相比,大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間有所下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    表1 本研究大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間一覽表Table 1 The Time of the Rat Treadmill

    2.2 不同干預(yù)措施條件下運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠腓腸肌神經(jīng)肌肉接頭CGRP的表達(dá)變化

    CGRP的免疫陽(yáng)性產(chǎn)物在肌纖維縱切面上,其形狀為橢圓形或棒狀,主要分布于肌纖維膜的表面。

    1.在安靜狀態(tài)下??瞻讓?duì)照組(圖1A)、PBS預(yù)處理組(圖1B)和CAP預(yù)處理+CGRP預(yù)處理組(圖1E)的免疫陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)較少,呈色較淺;CGRP預(yù)處理組(圖1C)的免疫陽(yáng)性產(chǎn)物較空白對(duì)照組明顯增多,反應(yīng)增強(qiáng),呈色較深;而CAP預(yù)處理組大鼠(圖1D)的免疫陽(yáng)性產(chǎn)物較空白對(duì)照組有所減少,呈色變淺。

    圖1 運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠腓腸肌CGRP免疫組織化學(xué)圖Figure1.CGRP Immunohistochemistry of Gastrocnemius Muscle after Exercise-induced Fatigue(Bar=50 μm)

    放射免疫結(jié)果顯示(表2),空白對(duì)照組、PBS預(yù)處理組和CAP預(yù)處理+CGRP預(yù)處理組相比,大鼠神經(jīng)肌肉接頭CGRP的表達(dá)量無明顯差別(P>0.05);但CGRP預(yù)處理組與空白對(duì)照組相比,大鼠神經(jīng)肌肉接頭CGRP的表達(dá)量明顯升高(P<0.05),而CAP預(yù)處理組大鼠與空白對(duì)照組相比,大鼠神經(jīng)肌肉接頭CGRP的表達(dá)量明顯下降(P<0.05)。

    表2 運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠腓腸肌CGRP 濃度一覽表Table 2 The CGRP Concentration of Gastrocnemius Muscle after Exercise-induced Fatigue(pg/mg wet weight)

    2.運(yùn)動(dòng)80 min時(shí)。與安靜狀態(tài)時(shí)相比,除CGRP預(yù)處理組免疫陽(yáng)性產(chǎn)物明顯增多,反應(yīng)增強(qiáng),呈色較深外,其余各組的免疫陽(yáng)性產(chǎn)物均有所下降,反應(yīng)減弱,呈色變淺(圖1);CGRP預(yù)處理組(圖1H)的免疫陽(yáng)性產(chǎn)物較空白對(duì)照組增多,反應(yīng)增強(qiáng),呈色較深; 而CAP預(yù)處理組大鼠(圖1I)的免疫陽(yáng)性產(chǎn)物較空白對(duì)照組有所減少,呈色變淺。

    放射免疫結(jié)果顯示(表2),與安靜狀態(tài)時(shí)相比,各組運(yùn)動(dòng)80 min時(shí),大鼠神經(jīng)肌肉接頭CGRP的表達(dá)量除CGRP預(yù)處理組顯著上升外(P<0.05),其余各組CGRP的表達(dá)量均有所下降(P<0.05);CGRP預(yù)處理組與空白對(duì)照組相比,大鼠神經(jīng)肌肉接頭CGRP的表達(dá)量明顯升高(P<0.05),而CAP預(yù)處理組大鼠與空白對(duì)照組相比,大鼠神經(jīng)肌肉接頭CGRP的表達(dá)量明顯下降。

    3.力竭運(yùn)動(dòng)后即刻。各組的免疫陽(yáng)性產(chǎn)物與安靜狀態(tài)下各對(duì)應(yīng)組相比明顯增多,反應(yīng)增強(qiáng),呈色變深(圖1);CGRP預(yù)處理組(圖1M)的免疫陽(yáng)性產(chǎn)物較空白對(duì)照組明顯增多,反應(yīng)增強(qiáng),呈色變深; 而CAP預(yù)處理組大鼠(圖1N)的免疫陽(yáng)性產(chǎn)物較空白對(duì)照組有所減少,呈色變淺。

    放射免疫結(jié)果顯示(表2),與安靜狀態(tài)時(shí)相比,各組力竭運(yùn)動(dòng)后即刻大鼠神經(jīng)肌肉接頭CGRP的表達(dá)量顯著上升(P<0.05);CGRP預(yù)處理組與空白對(duì)照組相比,大鼠神經(jīng)肌肉接頭CGRP的表達(dá)量明顯升高(P<0.05),而CAP預(yù)處理組大鼠與空白對(duì)照組相比,大鼠神經(jīng)肌肉接頭CGRP的表達(dá)量明顯下降(P<0.05)。

    2.3 HE染色

    HE染色結(jié)果顯示(圖2),安靜狀態(tài)下各組骨骼肌的形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯改變;運(yùn)動(dòng)80 min時(shí)與安靜狀態(tài)下相比,除CGRP預(yù)處理組骨骼肌的細(xì)胞核明顯增多、增大外,其余各組均無明顯改變;力竭運(yùn)動(dòng)后即刻與安靜狀態(tài)下相比除CAP預(yù)處理組無明顯改變外,其余各組骨骼肌的細(xì)胞核均明顯增多、增大。2.4 骨骼肌MDA含量及SOD、GSH-PX、CAT活性的檢測(cè)

    表3表明,在安靜狀態(tài)時(shí),各組之間MDA含量的變化差異無顯著性(P>0.05)。運(yùn)動(dòng)80 min時(shí),空白對(duì)照組、PBS預(yù)處理組和CAP預(yù)處理+CGRP預(yù)處理組相比,MDA的含量也無明顯差別;但CGRP預(yù)處理組與空白對(duì)照組相比,MDA的含量顯著上升(P<0.05);而CAP預(yù)處理組與空白對(duì)照組相比,MDA的含量略有上升,但差異無顯著性(P>0.05)。力竭運(yùn)動(dòng)后即刻,空白對(duì)照組、PBS預(yù)處理組和CAP預(yù)處理+CGRP預(yù)處理組相比,MDA的含量也無明顯差別;但CGRP預(yù)處理組與空白對(duì)照組相比,MDA的含量顯著上升(P<0.05);CAP預(yù)處理組與空白對(duì)照組相比,MDA的含量也有所上升,但差異無顯著性(P>0.05)。運(yùn)動(dòng)80 min時(shí)、力竭運(yùn)動(dòng)后即刻各組與安靜狀態(tài)下各對(duì)應(yīng)組相比較,MDA的含量均顯著上升(P<0.05)。

    表4、表5、表6表明,在安靜狀態(tài)時(shí),各組之間SOD、GSH-PX和CAT的活性變化差異無顯著性(P>0.05)。運(yùn)動(dòng)80 min時(shí),空白對(duì)照組、PBS預(yù)處理組和CAP預(yù)處理+CGRP預(yù)處理組相比,SOD、GSH-PX和CAT的活性差異也無顯著性(P>0.05);但CGRP預(yù)處理組與空白對(duì)照組相比,SOD、GSH-PX和CAT的活性顯著下降;而CAP預(yù)處理組大鼠與空白對(duì)照組相比,SOD、GSH-PX和CAT的活性顯著上升(P<0.05)。力竭運(yùn)動(dòng)后即刻,空白對(duì)照組、PBS預(yù)處理組和CAP預(yù)處理+CGRP預(yù)處理組相比,SOD、GSH-PX和CAT的活性也無明顯差別;但CGRP預(yù)處理組與空白對(duì)照組相比,SOD、GSH-PX和CAT的活性顯著下降(P<0.05);而CAP預(yù)處理組大鼠與空白對(duì)照組相比,SOD、GSH-PX和CAT的活性顯著上升(P<0.05)。運(yùn)動(dòng)80 min時(shí)、力竭運(yùn)動(dòng)后即刻各組與安靜狀態(tài)下各對(duì)應(yīng)組相比較,骨骼肌SOD和GSH-PX的活性均顯著上升(P<0.05);CAT的活性在運(yùn)動(dòng)80 min時(shí)、力竭運(yùn)動(dòng)后即刻各組與安靜狀態(tài)下各對(duì)應(yīng)組相比較,除CGRP預(yù)處理組差異無顯著性外,其余各組均顯著上升(P<0.05)。

    3 討論

    本研究運(yùn)用一次性運(yùn)動(dòng)至力竭疲勞動(dòng)物模型,通過給大鼠皮下注射CGRP和用CAP耗竭CGRP的方法從行為學(xué)、形態(tài)學(xué)和生理機(jī)能的角度檢測(cè)CGRP對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞的影響,探索CGRP與運(yùn)動(dòng)性疲勞之間的潛在關(guān)系。

    本研究首先測(cè)量了不同干預(yù)措施條件下大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭的平均時(shí)間。研究結(jié)果表明,給大鼠皮下注射CGRP后,在其他組運(yùn)動(dòng)至80 min時(shí)該組已達(dá)力竭狀態(tài),大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間縮短大約37%;而用CAP耗竭內(nèi)源性CGRP后大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間延長(zhǎng)大約32%。這提示,CGRP可能加速了大鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞的產(chǎn)生。

    圖2 運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠腓腸肌HE染色圖Figure 2. HE Stain of Gastrocnemius Muscle after Exercise-induced Fatigue(Bar=50 μm)

    表3 運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠腓腸肌MDA 含量一覽表Table 3 The MDA Content of Gastrocnemius Muscle after Exercise-induced Fatigue(nmol/mg prot)

    表4 運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠腓腸肌SOD 活性一覽表Table 4 The SOD Activity of Gastrocnemius Muscle after Exercise-induced Fatigue(U/mg)

    表5 運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠腓腸肌GSH-PX的活性一覽表Table 5 The GSH-PX Activity of Gastrocnemius Muscle after Exercise-induced Fatigue(U/mg)

    表6 運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠腓腸肌CAT的活性一覽表Table 6 The CAT Activity of Gastrocnemius Muscle after Exercise-induced Fatigue(U/mg)

    通過免疫組織化學(xué)和放射免疫的方法,測(cè)試不同干預(yù)措施條件下大鼠安靜狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)至80 min時(shí)、力竭運(yùn)動(dòng)后即刻腓腸肌神經(jīng)肌肉接頭CGRP的變化,發(fā)現(xiàn)力竭運(yùn)動(dòng)后即刻,大鼠腓腸肌神經(jīng)肌肉接頭CGRP的表達(dá)量與安靜狀態(tài)時(shí)相比明顯上升。以往研究表明,一次大強(qiáng)度的下坡跑后,大鼠后肢運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的CGRP顯著提高,并持續(xù)2周左右,到第四周恢復(fù)到安靜水平[13],這與本研究結(jié)果基本一致。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元CGRP表達(dá)的增加可能是由于運(yùn)動(dòng)時(shí)腓腸肌的收縮提高了相關(guān)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的發(fā)放活動(dòng),從而引起運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元CGRP的表達(dá)均增加。運(yùn)動(dòng)80 min時(shí)各組與安靜狀態(tài)下各對(duì)應(yīng)組相比較,除CGRP預(yù)處理組外,其余各組CGRP的表達(dá)量有所下降,這可能是由于大鼠經(jīng)過一段時(shí)間的運(yùn)動(dòng),機(jī)體機(jī)能狀態(tài)未達(dá)到力竭水平出現(xiàn)的一種保護(hù)性現(xiàn)象。給大鼠皮下注射CGRP后,無論安靜狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)80 min時(shí),還是力竭運(yùn)動(dòng)后即刻,大鼠腓腸肌神經(jīng)肌肉接頭CGRP的表達(dá)均明顯升高,而補(bǔ)充CAP后,無論安靜狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)80 min時(shí),還是力竭運(yùn)動(dòng)后即刻大鼠腓腸肌神經(jīng)肌肉接頭CGRP的表達(dá)均明顯下降。這說明,本研究的干預(yù)是有效的。

    為了進(jìn)一步了解CGRP對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞的影響,本研究檢測(cè)了不同干預(yù)措施條件下CGRP對(duì)大鼠骨骼肌形態(tài)結(jié)構(gòu)及骨骼肌酶的活性和自由基含量的影響。1990年,F(xiàn)isher等通過建立大鼠鈍挫傷模型,發(fā)現(xiàn)傷后骨骼肌出現(xiàn)了許多肌細(xì)胞核,形態(tài)類似衛(wèi)星細(xì)胞,說明,骨骼肌細(xì)胞核的變化可初步反映骨骼肌受損傷的程度。本研究發(fā)現(xiàn),給大鼠皮下注射CGRP,運(yùn)動(dòng)至80 min時(shí)(力竭運(yùn)動(dòng)后即刻)大鼠骨骼肌的細(xì)胞核明顯增多、增大,而用CAP耗竭CGRP后大鼠骨骼肌細(xì)胞核增多、增大的現(xiàn)象不明顯。提示,CGRP干預(yù)導(dǎo)致了顯著的肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,因而,CGRP可能加速了骨骼肌的損傷。骨骼肌細(xì)胞核的增多、增大可能與以下原因有關(guān):1)骨骼肌損傷時(shí),肌衛(wèi)星細(xì)胞分裂,變成紡錘形的成肌細(xì)胞,然后多個(gè)成肌細(xì)胞融合成管狀的多核細(xì)胞(稱為肌管),最后變成骨骼肌纖維;2)破碎骨骼肌纖維的細(xì)胞核及其周圍的肌漿可變?yōu)槌杉〖?xì)胞;3)結(jié)締組織中的某種細(xì)胞也可分化為成肌細(xì)胞[1]。

    研究表明,通過測(cè)量大鼠骨骼肌中MDA的含量及SOD、GSH-PX 和CAT的活性能反映大鼠的運(yùn)動(dòng)能力及運(yùn)動(dòng)性疲勞的產(chǎn)生[8,9,33]。MDA是細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的一種主要產(chǎn)物,生物膜脂質(zhì)的不飽和脂肪酸最易受到自由基的攻擊而發(fā)生過氧化,所以,組織MDA的含量可反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化水平,間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊損傷的嚴(yán)重程度[16,18]。在自由基的連鎖反應(yīng)中,SOD、GSH-PX 和CAT都是機(jī)體內(nèi)的抗過氧化物酶。SOD是體內(nèi)主要的自由基清除酶,能夠催化超氧陰離子歧化為O2和H2O2,從而保護(hù)細(xì)胞膜和線粒體等免受氧化損傷,而H2O2可以被GSH-PX 和CAT催化分解為O2和H2O[2,14]。CAT 主要集中在過氧化物酶體中,而GSH-PX 主要在細(xì)胞質(zhì)中。GSH-PX能特異地催化GSH對(duì)H2O2的還原反應(yīng),起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的作用[23]。本研究表明,給大鼠皮下注射CGRP后,與空白對(duì)照組相比,大鼠骨骼肌中MDA含量顯著升高,SOD、GSH-PX 和CAT的活性顯著下降,而用CAP耗竭CGRP后,與空白對(duì)照組相比,大鼠骨骼肌中MDA含量顯著下降,SOD、GSH-PX 和CAT的活性顯著升高。這提示,CGRP在一定程度上增加了大鼠力竭運(yùn)動(dòng)后體內(nèi)自由基的生成量,降低了體內(nèi)自由基的清除,增加了自由基對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)成分的氧化損傷作用,加速了運(yùn)動(dòng)性疲勞的產(chǎn)生。研究報(bào)道,CGRP有預(yù)防小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)病及抗氧化應(yīng)激的作用,增加SOD和CAT的生成,降低MDA的含量[26]。這一報(bào)道與本研究結(jié)果正好相反,這可能與實(shí)驗(yàn)?zāi)P突駽GRP劑量有關(guān)。在脊椎動(dòng)物骨骼肌,CGRP通過作用于CGRP受體,誘發(fā)肌肉的收縮[29],在成年嚙齒類動(dòng)物膈肌,CGRP縮短了肌肉收縮的相對(duì)不應(yīng)期[11],上調(diào)了骨骼肌纖維cAMP的水平[21]。結(jié)合本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果,認(rèn)為,CGRP對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞的影響可能是由于CGRP對(duì)骨骼肌長(zhǎng)時(shí)間的作用導(dǎo)致骨骼肌長(zhǎng)時(shí)間收縮,從而引起大鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞的提前發(fā)生。

    綜上所述,本研究觀察到CGRP干預(yù)可導(dǎo)致大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間縮短,形態(tài)學(xué)上骨骼肌損傷加劇,骨骼肌自由基生成增多,提示,CGRP加速了運(yùn)動(dòng)性疲勞的產(chǎn)生。但是,CGRP加速運(yùn)動(dòng)性疲勞產(chǎn)生的具體機(jī)制,尤其是其下游的作用靶點(diǎn),需要更進(jìn)一步的研究。

    4 結(jié)論

    CGRP干預(yù)后,大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間明顯下降,骨骼肌的細(xì)胞核明顯增多、增大,MDA的含量上升,SOD、GSH-PX和CAT的活性下降,提示,CGRP可能介導(dǎo)了運(yùn)動(dòng)性疲勞的產(chǎn)生。

    [1]戚正本.多核細(xì)胞的形成機(jī)理及其運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)意義[J].體育成人教育學(xué)刊,2007,23(6):49-51.

    [2]BAYRAKTAR N,KILIC S,BAYRAKTAR M R,etal.Lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities in cancerous bladder tissue and their relation with bacterial infection:A controlled clinical study[J].J Clin Lab Anal,2010,24(1):25-30.

    [3]BEDFORD T G,TIPTON C M,WILSON N C,etal.Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures[J].J Appl Physiol,1979,47(6):1278-1283.

    [4]BELL D,MCDERMOTT B J.Calcitonin gene-related peptide in the cardio-vascular system:Characterization of receptor populations and their (patho) physiological significance[J].Pharmacol Rev,1996,48(2):253-288.

    [5]BLESCH A,TUSZYNSKI M H.GDNF gene delivery to injured adult CNS motor neurons promotes axonal growth,expression of the trophic neuropeptide CGRP,and cellular protection[J].J Comp Neurol,2001,436(4):399-410.

    [7]CARMICHAEL M D,DAVIS J M,MURPHY E A,etal.Role of brain macrophages on IL-1beta and fatigue following eccentric exercise-induced muscle damage[J].Brain Behav Immun,2010,24(4):564-568.

    [8]CHI A,LI H,KANG C,etal.Anti-fatigue activity of a novel polysaccharide conjugates from Ziyang green tea[J].Int J Biol Macromol,2015,80:566-572.

    [9]FAN W,WU X,PAN Y,etal.1-(1,3-Benzodioxol-5-yl-carbo-nyl) piperidine,a modulator of α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid receptor,ameliorates exercise-induced fatigue in mice[J].Biol Pharm Bull,2014,37(1):13-17.

    [10]FERNANDEZ H L,ROSS G S,NADELHAFT I.Neurogenic calcitonin gene-related peptide:A neurotrophic factor in the maintenance of acetylcholinesterase molecular forms in adult skeletal muscles[J].Brain Res,1999,844(1-2):83-97.

    [11]FLEMING N W,LEWIS B K,WHITE D A,etal.Acute effects of calcitonin gene-related peptide on the mechanical and electrical responses of the rat hemidiaphragm[J].J Pharmacol Exp Ther,1993,265(3):1199-1204.

    [12]GARDINER S M,COMPTON A M,KEMP P A,etal.Haemodynamic effects of human a-calcitonin gene-related peptide following administration of endothelin-1 or N-nitro-Larginine methyl ester in conscious rats[J].Br J Pharmacol,1991,103(1):1256-1262.

    [13]HOMONKO D A,THERIAULT E.Calcitonin gene-related pe-ptide is increased in hindlimb motoneurons after exercise[J].Int J Sports Med,1997,18:1-7.

    [14]KIM K C,KANG K A,ZHANG R,etal.Risk reduction of ethyl acetate fraction of Empetrum nigrum var.Japonicum via antioxidant properties against hydrogen peroxide-induced cell damage[J].J Toxicol Environ Health A,2009,72(21-22):1499-1508.

    [15]KLOOT W V D,BENJAMIN W B,BALEZINA O P.Calcitonin gene-related peptide acts presynaptically to increase quantal size and output at frog neuromuscular junctions[J].J Physiol,1998,507(Pt3):689-695.

    [16]LIANG Y,FANG J Q,WANG C X,etal.Effects of transcutaneous electric acupoint stimulation on plasma SOD and MDA in rats with sports fatigue[J].Acupuncture Res,2008,33(2):120-123.

    [17]LU J T,SON Y J,LEE J,etal.Mice lacking alpha-calcitonin gene-related peptide exhibit normal cardiovascular regulation and neuromuscular development[J].Mol Cell Neurosci,1999,14(2):99-120.

    [19]MAGAL M,DUMKE C L,URBIZTONDO Z G,etal.Relationship between serum creatine kinase activity following exercise-induced muscle damage and muscle fibre composition[J].J Sports Sci,2010,13:1-10.

    [21]MATSUMOTO N,UCHIDA S,WANG X B,etal.Effect of denervation of the phrenic nerve on the action of calcitonin gene-related peptide in rat diaphragm[J].Life Sci,1990,47(6):547-555.

    [22]NAVES L A,KLOOT W V D.Repetitive nerve stimulation decreases the acetylcholine content of quanta at the frog neuromuscular junction[J].J Physiol,2001,532(Pt3):637-647.

    [23]NAZIROGLU M,CIHANGIR UGUZ A,KO?AK A,etal.Acetaminophen at different doses protects brain microsomal Ca2+-ATPase and the antioxidant redox system in rats[J].J Membr Biol,2009,231(2-3):57-64.

    [24]RINGER C,WEIHE E,SCHüTZ B.Pre-symptomatic alterations in subcellular betaCGRP distribution in motor neurons precede astrogliosis in ALS mice[J].Neurobiol Dis,2009,35(2):286-295.

    [25]ROSA E,CHA J,BAIN J R,etal.Calcitonin gene-related peptide regulation of glial cell-line derived neurotrophic factor in differentiated rat myotubes[J].J Neurosci Res,2015,93(3):514-520.

    [26]SHE F,SUN W,MAO J M,etal.Calcitonin gene-related peptide gene therapy suppresses reactive osygen species in the pancreas and prevents mice from autoimmune diabetes[J].Acta Physiologica Sinica,2003,55(6):625-632.

    [27]SIECK G C,PRAKASH Y S.Fatigue at the neuromuscular junction.Branch point vs.presynaptic vs.postsynaptic mechanisms[J].Adv Exp Med Biol,1995,384:83-100.

    [28]THOMSON R L,ROGERS D K,HOWE P R,etal.Effect of acute exercise-induced fatigue on maximal rate of heart rate increase during submaximal cycling[J].Res Sports Med,2015,20:1-15.

    [29]TORGAN C E,KRAUS W E.Regulation of type II adenylyl cyclase mRNA in rabbit skeletal muscle by chronic motor nerve pacing[J].Am J Physiol,1996,271(2 Pt 1):E253-260.

    [30]UCHIDA S,YAMAMOTO H,IIO S,etal.Release of calcitonin gene-related peptide-like immunoreactive substance from neuromuscular junction by nerve excitation and its action on striated muscle[J].J.Neurochem,1990,54(3):1000-1003.

    [31]URBANO F J,LINO N G,GONZLEZ-INCHAUSPE C M,etal.Acid-sensing ion channels 1a (ASIC1a) inhibit neuromuscular transmission in female mice[J].Am J Physiol Cell Physiol,2014,306(4):C396-406.

    [32]WEBER T,DUCOS M,MULDER E,etal.The relationship between exercise-induced muscle fatigue,arterial blood flow and muscle perfusion after 56 days local muscle unloading[J].Clin Physiol Funct Imaging,2014,34(3):218-29.

    [33]YANG Q,JIN W,LV X,etal.Effects of macamides on endurance capacity and anti-fatigue property in prolonged swimming mice[J].Pharm Biol,2015,9:1-8.

    Effects of Calcitonin Gene-related Peptide on the Exercise-induced Fatigue of Rats

    GUO Wen1,LUO Xue-gang2,WANG Hui2,CHEN Dan2

    The purpose of this paper is to study the effects of CGRP on the exercise-induced fatigue of rats.Methods:Healthy adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups according to the different pretreatment:the blank control group,the PBS pretreatment group,the CGRP pretreatment group,the CAP pretreatment group,the CAP pretreatment +CGRP pretreatment group.The rats were sacrificed at the resting state,the exercise to 80 min and the exercise to exhaustion,Then the immunohistochemistry and radioimmunoassay was used to detecting the expression of CGRP at the condition of the different pretreatment,the HE staining was used to detecting the change of morphous formation of skeletal muscle at the condition of the different pretreatment,the chemistry colorimetric method was used to detecting the change of superoxide dismutase,glutathione peroxidase,catalase,and malondialdehyde at the conditions of the different pretreatment.Results:1) The time of the treadmill exercise to exhaustion was significantly decurtated after CGRP pretreatment (P<0.05),and the time of the treadmill exercise to exhaustion was significantly prolonged after CAP pretreatment (P<0.05).2) Immunohistochemistry and radioimmunoassay showed that CGRP immunopositive products were elliptical or rod-shape at longitudinal section of muscle fiber.The expression of CGRP was significantly increased after the CGRP pretreatment (P<0.05),and the expression of CGRP was significantly decreased after the CAP pretreatment (P<0.05).3) HE staining showed that there were no obvious differences in amorphous constitution of skeletal muscle in all groups at the resting state.There were also no obvious changes in morphous constitution of skeletal muscle at the other groups at the exercise to 80 min than at the resting state,excluding cell nucleus of skeletal muscle were significantly increased and augmented at the CGRP pretreatment group,Cell nucleus of skeletal muscle were significantly increased and augmented in all other groups,while there were no obvious changes in morphous constitution of skeletal muscle at the CAP pretreatment group at exercise to exhaustion than at the resting state.4) The chemistry colorimetric showed that the content of MDA was significantly increased (P<0.05),and the activity of SOD,GSH-PX,CAT was significantly decreased after the CGRP pretreatment (P<0.05),While the content of MDA was significantly decreased (P<0.05),and the activity of SOD,GSH-PX,CAT was significantly increased after the CAP pretreatment (P<0.05).Conclusions:The CGRP intensified the generation of exercise-induced fatigue.

    calcitoningene-relatedpeptide;exercise-inducedfatigue;skeletalmuscles;freeradical

    2015-12-08;

    2016-06-23

    湖南省教育科學(xué)規(guī)劃基金項(xiàng)目(XJK011QTM002)。

    郭文(1978-),女,湖南益陽(yáng)人,副教授,博士,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù),E-mail:gw7808200@163.com。

    1.湖南師范大學(xué) 體育學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410012;2.中南大學(xué) 湘雅醫(yī)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410013 1.Hunan Normal University,Changsha 410012,China;2.Central South University,Changsha 410013,China.

    G804.7

    A

    10.16469/j.css.201607008

    猜你喜歡
    力竭腓腸肌骨骼肌
    高頻超聲評(píng)估2型糖尿病患者腓腸肌病變的診斷價(jià)值
    石氏三色膏治療小腿腓腸肌損傷60例
    中成藥(2018年10期)2018-10-26 03:41:40
    西歸粗多糖對(duì)游泳力竭小鼠的抗運(yùn)動(dòng)性疲勞作用
    中成藥(2018年3期)2018-05-07 13:34:34
    心多大才好
    歲月(2017年7期)2017-07-18 18:52:11
    富硒板黨對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響及機(jī)制
    紋狀體A2AR和D2DR對(duì)大鼠力竭運(yùn)動(dòng)過程中蒼白球GABA和Glu釋放的調(diào)控研究
    8-羥鳥嘌呤可促進(jìn)小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞的增殖和分化
    骨骼肌細(xì)胞自噬介導(dǎo)的耐力運(yùn)動(dòng)應(yīng)激與適應(yīng)
    腓腸肌損傷的MRI臨床診斷研究
    磁共振成像(2015年5期)2015-12-23 08:52:53
    骨骼肌缺血再灌注損傷的機(jī)制及防治進(jìn)展
    免费av中文字幕在线| 97人妻天天添夜夜摸| 成年美女黄网站色视频大全免费| av国产精品久久久久影院| 国产又色又爽无遮挡免| 99香蕉大伊视频| 中文字幕最新亚洲高清| 国产成人精品在线电影| 在线观看www视频免费| 99香蕉大伊视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 精品免费久久久久久久清纯 | 一级片'在线观看视频| 蜜桃国产av成人99| a级毛片在线看网站| 亚洲精品第二区| 欧美在线一区亚洲| 亚洲成人免费av在线播放| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 1024香蕉在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 成人三级做爰电影| 欧美在线黄色| 亚洲avbb在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲久久久国产精品| 国产精品一区二区精品视频观看| 大香蕉久久成人网| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 1024香蕉在线观看| 丰满少妇做爰视频| 免费观看人在逋| 午夜91福利影院| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲成人手机| 亚洲免费av在线视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 久久久久久久国产电影| 国产激情久久老熟女| 考比视频在线观看| 久久青草综合色| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 精品亚洲成国产av| av在线播放精品| 多毛熟女@视频| 中国美女看黄片| 青春草视频在线免费观看| 午夜免费鲁丝| 欧美激情高清一区二区三区| av网站在线播放免费| 亚洲第一青青草原| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产精品 国内视频| 美女视频免费永久观看网站| 69精品国产乱码久久久| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 成人影院久久| 国产成人av教育| 深夜精品福利| 高清欧美精品videossex| 日本wwww免费看| 亚洲中文av在线| 又紧又爽又黄一区二区| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲精品国产区一区二| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲天堂av无毛| 精品亚洲成a人片在线观看| 日本av手机在线免费观看| 亚洲精品自拍成人| 男女无遮挡免费网站观看| 一区二区三区四区激情视频| 欧美日本中文国产一区发布| 一本久久精品| 大陆偷拍与自拍| 免费在线观看日本一区| 久久av网站| 九色亚洲精品在线播放| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产黄色免费在线视频| 国产一区二区激情短视频 | 日韩制服丝袜自拍偷拍| 精品第一国产精品| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲 国产 在线| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 黄片小视频在线播放| av不卡在线播放| 美国免费a级毛片| 亚洲综合色网址| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产熟女午夜一区二区三区| 老汉色∧v一级毛片| 男女高潮啪啪啪动态图| 久久免费观看电影| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产一区有黄有色的免费视频| 咕卡用的链子| 久久久久国产一级毛片高清牌| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| a级片在线免费高清观看视频| 丰满少妇做爰视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 男女床上黄色一级片免费看| 国产精品99久久99久久久不卡| 免费不卡黄色视频| 91精品三级在线观看| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲一区二区三区欧美精品| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 91九色精品人成在线观看| 国产男女内射视频| 美女主播在线视频| 51午夜福利影视在线观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 多毛熟女@视频| 51午夜福利影视在线观看| 咕卡用的链子| 日韩中文字幕视频在线看片| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产99久久九九免费精品| 久久香蕉激情| 欧美精品一区二区大全| 香蕉丝袜av| 国产精品一区二区在线观看99| 丝袜美腿诱惑在线| 他把我摸到了高潮在线观看 | 日韩免费高清中文字幕av| av网站在线播放免费| 后天国语完整版免费观看| 国产精品av久久久久免费| 国产真人三级小视频在线观看| 老司机在亚洲福利影院| 久久 成人 亚洲| 成人手机av| 热99久久久久精品小说推荐| 韩国高清视频一区二区三区| 制服诱惑二区| 亚洲精品美女久久av网站| 秋霞在线观看毛片| 不卡av一区二区三区| 欧美日韩av久久| 午夜精品国产一区二区电影| 男人舔女人的私密视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 久久久久精品人妻al黑| 51午夜福利影视在线观看| 久久99一区二区三区| 一级,二级,三级黄色视频| 欧美成狂野欧美在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 国产成人av激情在线播放| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产在线一区二区三区精| 久久中文看片网| 国产男女超爽视频在线观看| 久久中文字幕一级| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| av网站在线播放免费| 国产成人免费无遮挡视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| a 毛片基地| 国产欧美日韩一区二区三区在线| www.自偷自拍.com| 在线永久观看黄色视频| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲五月婷婷丁香| 成人三级做爰电影| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 女人久久www免费人成看片| 最近最新免费中文字幕在线| 午夜精品久久久久久毛片777| 久久久国产一区二区| 无限看片的www在线观看| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲精品美女久久av网站| 一级,二级,三级黄色视频| 777米奇影视久久| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产极品粉嫩免费观看在线| av片东京热男人的天堂| 亚洲国产av影院在线观看| 日韩制服骚丝袜av| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产1区2区3区精品| 黄色 视频免费看| 亚洲av美国av| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久久久视频综合| 又黄又粗又硬又大视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 一级,二级,三级黄色视频| 伦理电影免费视频| 久热爱精品视频在线9| avwww免费| 交换朋友夫妻互换小说| 各种免费的搞黄视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲三区欧美一区| 精品一品国产午夜福利视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 一级,二级,三级黄色视频| 十八禁人妻一区二区| 青草久久国产| 久久久久精品国产欧美久久久 | 亚洲自偷自拍图片 自拍| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产老妇伦熟女老妇高清| 97精品久久久久久久久久精品| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产精品一区二区免费欧美 | 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲伊人久久精品综合| 99国产精品99久久久久| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 考比视频在线观看| 色94色欧美一区二区| 亚洲人成电影免费在线| 青春草亚洲视频在线观看| 一区二区三区乱码不卡18| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲av国产av综合av卡| 日韩中文字幕视频在线看片| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 国产高清国产精品国产三级| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美日本中文国产一区发布| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 欧美中文综合在线视频| 不卡av一区二区三区| 丝袜喷水一区| 男女之事视频高清在线观看| 在线av久久热| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 青草久久国产| 久久这里只有精品19| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产高清videossex| 淫妇啪啪啪对白视频 | 婷婷成人精品国产| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产精品九九99| 久久久久国内视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 国产精品av久久久久免费| 亚洲av国产av综合av卡| 人妻久久中文字幕网| 亚洲欧美清纯卡通| 免费在线观看影片大全网站| 考比视频在线观看| 成年美女黄网站色视频大全免费| 一本色道久久久久久精品综合| 精品国内亚洲2022精品成人 | 久久亚洲国产成人精品v| 人成视频在线观看免费观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 久久人人爽人人片av| 国产av一区二区精品久久| 成人手机av| 久久影院123| 又紧又爽又黄一区二区| av线在线观看网站| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲七黄色美女视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 91精品伊人久久大香线蕉| 韩国高清视频一区二区三区| 国产又色又爽无遮挡免| 久久香蕉激情| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久久国产精品影院| 午夜免费成人在线视频| 捣出白浆h1v1| 久久免费观看电影| 亚洲国产av影院在线观看| 久久综合国产亚洲精品| a 毛片基地| 日韩视频在线欧美| 国产亚洲精品久久久久5区| bbb黄色大片| 久久精品国产综合久久久| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产成人精品在线电影| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产精品国产av在线观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产xxxxx性猛交| 91av网站免费观看| 十八禁人妻一区二区| 桃花免费在线播放| 日日爽夜夜爽网站| 国产深夜福利视频在线观看| 成在线人永久免费视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久久久精品人妻al黑| 日本a在线网址| 久久久久视频综合| 国产成人精品久久二区二区免费| 中文字幕制服av| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 亚洲国产看品久久| 母亲3免费完整高清在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 成人影院久久| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲精品在线美女| 两个人免费观看高清视频| 免费高清在线观看日韩| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲综合色网址| 丰满少妇做爰视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 美女高潮到喷水免费观看| 免费观看a级毛片全部| 男女国产视频网站| 丰满少妇做爰视频| av在线老鸭窝| 国产福利在线免费观看视频| 久久久久视频综合| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 美女中出高潮动态图| 久久久久国内视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产精品九九99| 黄色片一级片一级黄色片| 国产成人a∨麻豆精品| 波多野结衣av一区二区av| 精品国产乱码久久久久久男人| 中文字幕色久视频| 午夜福利影视在线免费观看| 午夜福利乱码中文字幕| 母亲3免费完整高清在线观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 在线观看www视频免费| 老汉色av国产亚洲站长工具| 69精品国产乱码久久久| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产深夜福利视频在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 免费不卡黄色视频| 欧美性长视频在线观看| 一区福利在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产一区有黄有色的免费视频| a级毛片在线看网站| 欧美久久黑人一区二区| 久久久久久久国产电影| 男女之事视频高清在线观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 成人国产一区最新在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 9色porny在线观看| 在线观看www视频免费| 99精国产麻豆久久婷婷| www.熟女人妻精品国产| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 午夜福利视频精品| 91精品三级在线观看| 婷婷丁香在线五月| 国产亚洲av高清不卡| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 欧美中文综合在线视频| 日韩一区二区三区影片| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 人人妻人人澡人人看| 丝袜脚勾引网站| a级片在线免费高清观看视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产成人精品久久二区二区免费| 日韩精品免费视频一区二区三区| 免费在线观看黄色视频的| 成年人午夜在线观看视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 欧美精品一区二区免费开放| 午夜日韩欧美国产| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲熟女精品中文字幕| 色婷婷久久久亚洲欧美| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 五月天丁香电影| 亚洲国产精品999| av片东京热男人的天堂| 国产精品一二三区在线看| 欧美xxⅹ黑人| 久久久久久久久免费视频了| 美女视频免费永久观看网站| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲国产精品999| 亚洲国产av新网站| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 1024香蕉在线观看| 99热国产这里只有精品6| 热re99久久国产66热| 欧美av亚洲av综合av国产av| cao死你这个sao货| 午夜免费鲁丝| 男女午夜视频在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久久久久人人人人人| 中文字幕人妻丝袜制服| av一本久久久久| 婷婷色av中文字幕| 黄色视频不卡| 老司机午夜十八禁免费视频| 超碰成人久久| 黄片小视频在线播放| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲国产精品成人久久小说| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲情色 制服丝袜| 欧美亚洲日本最大视频资源| 天天添夜夜摸| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产精品一区二区精品视频观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 黄色怎么调成土黄色| 午夜福利乱码中文字幕| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产精品一二三区在线看| 天天操日日干夜夜撸| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产区一区二久久| 国产精品一区二区精品视频观看| 女人久久www免费人成看片| 国产精品一区二区免费欧美 | 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲免费av在线视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 俄罗斯特黄特色一大片| 黑人猛操日本美女一级片| 不卡一级毛片| 亚洲人成77777在线视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 在线观看www视频免费| 99精国产麻豆久久婷婷| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 777米奇影视久久| 成人av一区二区三区在线看 | 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产免费现黄频在线看| 人妻久久中文字幕网| 国产精品久久久久久精品古装| 叶爱在线成人免费视频播放| 中文字幕最新亚洲高清| 国产精品影院久久| 亚洲av欧美aⅴ国产| 精品国内亚洲2022精品成人 | 国产精品九九99| 高清av免费在线| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 手机成人av网站| 国产在线视频一区二区| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲欧美一区二区三区久久| 免费黄频网站在线观看国产| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 12—13女人毛片做爰片一| 一级,二级,三级黄色视频| netflix在线观看网站| kizo精华| 成年女人毛片免费观看观看9 | 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 9色porny在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 少妇的丰满在线观看| 老汉色∧v一级毛片| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产精品一区二区在线不卡| 日本91视频免费播放| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲欧美激情在线| 免费高清在线观看日韩| av天堂久久9| 欧美av亚洲av综合av国产av| 视频区图区小说| 国产日韩欧美视频二区| 国产亚洲精品久久久久5区| 欧美久久黑人一区二区| 男女午夜视频在线观看| 18在线观看网站| 一本综合久久免费| 国产91精品成人一区二区三区 | 亚洲精品国产精品久久久不卡| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 男男h啪啪无遮挡| 午夜精品国产一区二区电影| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产亚洲欧美精品永久| 极品少妇高潮喷水抽搐| 美女大奶头黄色视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| 久久毛片免费看一区二区三区| 女人精品久久久久毛片| 不卡一级毛片| 亚洲人成电影观看| 色播在线永久视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 少妇人妻久久综合中文| 老汉色∧v一级毛片| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 制服人妻中文乱码| 免费黄频网站在线观看国产| 日本av免费视频播放| 久久久久网色| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 亚洲国产欧美在线一区| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 日韩免费高清中文字幕av| 91精品三级在线观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 999久久久国产精品视频| av网站免费在线观看视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 午夜免费观看性视频| 午夜老司机福利片| 亚洲五月色婷婷综合| 国产精品av久久久久免费| 亚洲情色 制服丝袜| tube8黄色片| 日本av免费视频播放| 男人爽女人下面视频在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 一级毛片女人18水好多| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 各种免费的搞黄视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 一区二区三区精品91| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产成人精品在线电影| 久久国产精品人妻蜜桃| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲av男天堂| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产黄色免费在线视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 老司机影院毛片| 久久青草综合色| 欧美激情 高清一区二区三区| √禁漫天堂资源中文www| 丝袜喷水一区| 99热国产这里只有精品6| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 在线观看免费高清a一片| 亚洲男人天堂网一区| 老司机福利观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 久久久精品区二区三区| 电影成人av| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 国产黄色免费在线视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲中文日韩欧美视频| videosex国产| 99久久综合免费| 亚洲精品一二三| 一本色道久久久久久精品综合| 国产深夜福利视频在线观看| 久久香蕉激情| 国产精品久久久久久精品古装| 丝袜人妻中文字幕| a 毛片基地| 男人添女人高潮全过程视频| 日本wwww免费看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 午夜老司机福利片| 韩国精品一区二区三区| 最黄视频免费看| 18禁观看日本| 一进一出抽搐动态| 久久久久久人人人人人| 在线观看免费午夜福利视频| 12—13女人毛片做爰片一| 午夜精品久久久久久毛片777|