跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖大鼠海馬內(nèi)GLUT4和CD36等的影響

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跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖大鼠海馬內(nèi)GLUT4和CD36等的影響

張?jiān)汽?,2，婁淑杰1，蔡 明1，李靜靜1，辛 磊1

目的：探討8周有氧耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖大鼠海馬內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4 (Glucose transporter 4，GLUT4)和脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(fatty acid translocase，TAT/CD36)及其相關(guān)指標(biāo)的影響。方法：7周齡SD雄性大鼠隨機(jī)分為普通飼料組(C)和高脂飼料組(H)，分別以普通飼料和高脂飼料飼養(yǎng)8周后，C組大鼠隨機(jī)等分為普通飼料安靜組(NC)和普通飼料運(yùn)動(dòng)組(NE)。選取H組中體質(zhì)量超過C組大鼠平均體質(zhì)量加1.4倍標(biāo)準(zhǔn)差的大鼠20只，隨機(jī)等分為肥胖安靜組(OC)和肥胖運(yùn)動(dòng)組(OE)。NC組和OC組大鼠不運(yùn)動(dòng)，NE組和OE組大鼠經(jīng)1周適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)后進(jìn)行8周中等強(qiáng)度的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。末次運(yùn)動(dòng)結(jié)束后 24 h，禁食過夜，每組大鼠中隨機(jī)選取 6 只，10%水合氯醛麻醉，冰上分離海馬組織，Western blotting法檢測海馬內(nèi)GLUT4、CD36、PI3K、p-PI3K、AMPKα、p-AMPKα、ACC和p-ACC的表達(dá)。結(jié)果：肥胖大鼠海馬內(nèi)CD36的蛋白表達(dá)顯著增加，但GLUT4、PI3K、AMPKα和ACC的蛋白表達(dá)以及PI3K、AMPKα和ACC的磷酸化水平均無顯著變化。跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖大鼠海馬內(nèi)CD36、GLUT4、PI3K、AMPKα和ACC的蛋白表達(dá)以及PI3K、AMPKα和ACC的磷酸化水平均無顯著性影響。結(jié)論：實(shí)驗(yàn)證實(shí)大鼠海馬內(nèi)存在CD36的蛋白表達(dá)，并且首次發(fā)現(xiàn)高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖大鼠出現(xiàn)海馬內(nèi)CD36的蛋白表達(dá)顯著增加，但跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)未能對(duì)肥胖大鼠海馬內(nèi)GLUT4和CD36及其相關(guān)指標(biāo)產(chǎn)生顯著性影響。

大鼠；海馬；運(yùn)動(dòng)；高脂膳食；肥胖；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4；脂肪酸轉(zhuǎn)位酶

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4 (Glucose transporter 4，GLUT4)在海馬CA1-CA3區(qū)錐體細(xì)胞層以及齒狀回顆粒細(xì)胞層表達(dá)[36]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)GLUT4的表達(dá)和轉(zhuǎn)位可能通過與外周組織類似的機(jī)制介導(dǎo)，如Piroli等[39]認(rèn)為，胰島素可以刺激大鼠海馬內(nèi)GLUT4從胞漿轉(zhuǎn)位到質(zhì)膜。Bakirtzi等[5]報(bào)道，在原代培養(yǎng)的小腦神經(jīng)元，胰島素刺激GLUT4轉(zhuǎn)位到細(xì)胞表面，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，長期體育鍛煉可以增加小腦GLUT4的蛋白表達(dá)，進(jìn)而明顯增加小腦的葡萄糖攝取。然而，運(yùn)動(dòng)能否影響高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖大鼠海馬內(nèi)GLUT4的蛋白表達(dá)尚不完全清楚。

外周組織中脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(fatty acid translocase,FAT/CD36)已被廣泛研究，但有關(guān)CD36在大腦中作用的相關(guān)信息卻鮮有報(bào)道。研究顯示，CD36存在于一些腦區(qū)的神經(jīng)元，如從大鼠下丘腦腹內(nèi)側(cè)核(VMN)分離的神經(jīng)元，顯示CD36的mRNA表達(dá)[27，28]，但高脂膳食和運(yùn)動(dòng)能否影響大鼠海馬內(nèi)CD36的蛋白表達(dá)卻是未知的。

針對(duì)上述問題，本實(shí)驗(yàn)選用普通膳食大鼠和高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖大鼠為研究對(duì)象，觀察運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖大鼠海馬內(nèi)GLUT4和CD36蛋白表達(dá)的影響。此外，本實(shí)驗(yàn)還評(píng)估了與GLUT4和CD36功能相關(guān)的分子，如磷酯酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)和乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC )。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量190±10 g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(許可證號(hào)SCXK(滬)2013-0016)。大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠3～5只，動(dòng)物房溫度22℃±2℃，光照遵循12 h：12 h明暗周期，自由攝食和飲水。

最初的適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，將大鼠隨機(jī)分為普通飼料組(C)和高脂飼料組(H)，C組20只，H組50只。實(shí)驗(yàn)第8周末，將C組大鼠隨機(jī)分為普通飼料安靜組(NC)和普通飼料運(yùn)動(dòng)組(NE)，每組10只，繼續(xù)進(jìn)食普通飼料。選取H組中體質(zhì)量超過C組大鼠平均體質(zhì)量加1.4倍標(biāo)準(zhǔn)差的大鼠[45]，并隨機(jī)分為肥胖安靜組(OC)和肥胖運(yùn)動(dòng)組(OE)，每組10只，繼續(xù)進(jìn)食高脂飼料。普通飼料及高脂飼料均由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供(表1)。NC組1只大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中因病死亡，OE組2只大鼠不能完成運(yùn)動(dòng)被淘汰。至運(yùn)動(dòng)干預(yù)結(jié)束，各組大鼠數(shù)量為NC組為9只、NE組為10只、OC組為10只、OE組為8只。所有的實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)上海體育學(xué)院科學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):No.05-2013)。實(shí)驗(yàn)方案符合上海體育學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用規(guī)程。

1.2 試劑和儀器

兔多克隆抗體PI3K p85、Phospho-PI3K p85(Tyr458)/p55 (Tyr199)、ACC、Phospho-ACC(Ser79)，兔單克隆抗體AMPKα、Phospho-AMPKα(Thr172)、β-Actin，辣根酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗、彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)均購于Cell Signaling公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)、BeyoECL Plus (超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒)及PVDF膜購于碧云天生物試劑公司。兔多克隆抗體GLUT4購于Abcam公司，兔多克隆抗體CD36購于Santa Cruz公司，兔多克隆抗體GAPDH購于杭州賢至生物科技有限公司。膜蛋白，核蛋白和胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒購于生工生物工程(上海)有限公司。蛋白質(zhì)電泳儀、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移裝置購于美國Biorad公司。

1.3 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案

NC組和OC組大鼠不運(yùn)動(dòng)。NE組和OE組大鼠經(jīng)1周適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)后進(jìn)行8周坡度0°的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，1次/天，5次/周。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案參考Bedford等[8]的研究制定。運(yùn)動(dòng)負(fù)荷安排如下：按11 m/min，10 min/天開始運(yùn)動(dòng)，之后每天以1 m/min增加運(yùn)動(dòng)速度，5 min/天增加運(yùn)動(dòng)時(shí)間，直至跑速為18 m/min，運(yùn)動(dòng)時(shí)間為40 min/天。然后維持跑速為18 m/min，運(yùn)動(dòng)時(shí)間為40 min/天，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.4 標(biāo)本采集與儲(chǔ)存

運(yùn)動(dòng)干預(yù)結(jié)束24 h后，禁食過夜，每組大鼠中隨機(jī)選取 6只，10%水合氯醛麻醉，麻醉劑量為0.3 ml/100 g體重。迅速取腦，冰上分離海馬組織，凍存于液氮中，后-80℃保存。

1.5 Western blot法檢測海馬蛋白表達(dá)

將海馬組織剪碎，用蛋白抽提試劑盒依次提取胞質(zhì)蛋白(用于檢測PI3K-p85、pPI3K-p85-Tyr458、AMPKα和pAMPKα-Thr172、ACC、p-ACC-Ser79)和膜蛋白(用于檢測GLUT4和CD36)。BCA法檢測樣品蛋白濃度，用裂解液將各組樣品的蛋白濃度調(diào)平后，加入相應(yīng)量蛋白上樣緩沖液(5×)，沸煮10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，后轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。然后用體積分?jǐn)?shù)5%的脫脂牛奶室溫?fù)u床封閉1 h，接著依次與相應(yīng)一抗4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5 min。室溫孵育二抗1 h后，TBST洗膜3次，每次5 min，后用ECL法發(fā)光，顯影。Gel Doc EZ凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)將X光片掃描成圖像并保存為電腦文件后，用Image J軟件進(jìn)行圖像分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 海馬內(nèi) GLUT4和CD36蛋白表達(dá)

雙因素方差分析(整體分析)結(jié)果表明，膳食因素對(duì)海馬內(nèi)GLUT4的蛋白表達(dá)無顯著性影響(P>0.05)，但對(duì)海馬內(nèi)CD36的蛋白表達(dá)有顯著性影響(P<0.05)。運(yùn)動(dòng)因素對(duì)海馬內(nèi)GLUT4和CD36的蛋白表達(dá)均無顯著性影響(P>0.05)。膳食和運(yùn)動(dòng)對(duì)海馬內(nèi)GLUT4和CD36的蛋白表達(dá)不具有顯著性交互作用(P>0.05，表2)。

表2 大鼠海馬內(nèi)GLUT4和CD36的雙因素方差分析結(jié)果一覽表Table 2 Results of Two-way ANOVA on GLUT4 and CD36 in Rat Hippocampus

單因素方差分析結(jié)果顯示，與NC組比較，OC組大鼠海馬內(nèi)GLUT4的蛋白表達(dá)有升高趨勢，但差異無顯著性意義(P>0.05)；與NC組比較，OC組大鼠海馬內(nèi)CD36的蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與NC組比較，NE組大鼠海馬內(nèi)GLUT4和CD36的蛋白表達(dá)均無顯著性變化(P>0.05)；與OC組比較，OE組大鼠海馬內(nèi)GLUT4和CD36的蛋白表達(dá)也無顯著性變化(P>0.05，圖1)。

圖1 海馬內(nèi)GLUT4和CD36蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖Figure 1. Expression of GLUT4 and CD36 Protein of Hippocampus

2.2 海馬內(nèi)PI3K和AMPK信號(hào)通路

雙因素方差分析(整體分析)結(jié)果表明，膳食因素對(duì)海馬內(nèi)PI3K p85、pPI3K p85、AMPKα、pAMPKα、ACC和pACC均無顯著性影響(P>0.05)。運(yùn)動(dòng)因素對(duì)海馬內(nèi)PI3Kp85、pPI3Kp85、AMPKα、pAMPKα、ACC和pACC均無顯著性影響(P>0.05)。膳食和運(yùn)動(dòng)對(duì)海馬內(nèi)PI3Kp85、pPI3Kp85、AMPKα、pAMPKα、ACC和pACC不具有顯著性交互作用(P>0.05，表3)。

單因素方差分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，OC組大鼠海馬內(nèi)PI3K、AMPKα和ACC的蛋白表達(dá)和磷酸化水平均無顯著性變化(P>0.05)；與NC組比較，NE組大鼠海馬內(nèi)PI3K、AMPKα以及ACC的蛋白表達(dá)和磷酸化水平均無顯著性變化(P>0.05)；與OC組比較，OE組大鼠海馬內(nèi)PI3K、AMPKα和ACC的蛋白表達(dá)和磷酸化水平均無顯著性變化(P>0.05，圖2)。

圖2 海馬PI3K、AMPKα和ACC蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖Figure 2. Expression of PI3K,AMPKα and ACC Protein of Hippocampus

3 討論

海馬組織除了參與學(xué)習(xí)和記憶外，其對(duì)食欲和能量平衡的影響也開始被報(bào)道[10,17]，如McNay等[33]認(rèn)為，高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗與海馬功能受損相關(guān)聯(lián)。此外，McNay等[32]使用腦微透析法，發(fā)現(xiàn)海馬依賴性自發(fā)交替任務(wù)測試中，海馬細(xì)胞外葡萄糖濃度降低，提示，海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶與葡萄糖代謝有關(guān)。海馬損傷引起的功能改變顯著增加食物攝入和體質(zhì)量，與肥胖的形成有關(guān)[18，19]。上述研究表明，能量平衡的失調(diào)以及肥胖的產(chǎn)生不僅與經(jīng)典的下丘腦信號(hào)系統(tǒng)缺陷有關(guān)，海馬在其中也發(fā)揮了重要作用，并且海馬內(nèi)能量平衡的失調(diào)可能與海馬依賴性認(rèn)知功能障礙之間存在關(guān)聯(lián)。因此，明確高脂膳食和運(yùn)動(dòng)對(duì)海馬內(nèi)糖脂代謝相關(guān)蛋白的影響，可對(duì)深入理解營養(yǎng)性肥胖和胰島素抵抗相關(guān)疾病的病理生理基礎(chǔ)以及認(rèn)知功能障礙的治療提供一些參考。

3.1 高脂膳食和運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠海馬內(nèi)GLUT4的影響

葡萄糖是大腦中的主要能量供給底物，其穿過細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)是葡萄糖代謝的第一步，運(yùn)輸速率由促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白決定。到目前為止，已經(jīng)確定了14種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員。GLUT4是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員之一，相對(duì)分子質(zhì)量約為45～55 kDa，由12個(gè)跨膜片段(M1-M12)和1個(gè)位于N 端的胞外環(huán)狀結(jié)構(gòu)域組成。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖大鼠海馬內(nèi)GLUT4的蛋白表達(dá)無顯著性變化，另外，運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)肥胖大鼠海馬內(nèi)GLUT4的蛋白表達(dá)也無顯著性影響。高脂膳食和運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)大鼠海馬內(nèi)GLUT4的蛋白表達(dá)無顯著性影響的原因可能與以下因素有關(guān)：1)海馬內(nèi)GLUT4的濃度較低，如Detka等[20]研究了海馬中3種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GLUT1濃度最高，其次是GLUT3，而GLUT4濃度最低；2)海馬內(nèi)葡萄糖的運(yùn)輸以GLUT1和GLUT3為主，如Duelli等[21]報(bào)道，海馬中大多數(shù)葡萄糖攝取是通過表達(dá)于微血管和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的GLUT1以及表達(dá)于神經(jīng)元突起[30]的GLUT3介導(dǎo)；3)海馬內(nèi)GLUT1和GLUT3的運(yùn)輸也許能夠滿足本實(shí)驗(yàn)中大鼠海馬內(nèi)葡萄糖代謝的需求，正如Emmanuel等[22]提出，GLUT1和GLUT3的運(yùn)輸足夠滿足休息時(shí)葡萄糖代謝的需求，只有在持續(xù)的認(rèn)知活動(dòng)過程中能源利用激增時(shí)才需要額外誘導(dǎo)GLUT4的參與。

Winocur等[42]報(bào)道，肥胖Zucker大鼠海馬內(nèi)GLUT4由胞漿向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)位降低。趙海燕等[3]認(rèn)為，GLUT4的表達(dá)減少、轉(zhuǎn)位受阻及含GLUT4的囊泡不能與細(xì)胞膜融合或已融合但GLUT4活性降低等因素均可導(dǎo)致葡萄糖攝取出現(xiàn)障礙。轉(zhuǎn)位后GLUT4的活性降低可能與p38分裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)有關(guān)，但目前對(duì)于p38MAPK的具體作用機(jī)制以及是否存在其他因子參與GLUT4內(nèi)在活性的調(diào)節(jié)還有待進(jìn)一步研究證實(shí)[1]。

由于本研究所使用的蛋白抽提試劑盒只能提取總膜蛋白，無法分離獲得純化的細(xì)胞內(nèi)外膜蛋白，此局限性導(dǎo)致無法確定長期高脂膳食和運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)海馬內(nèi)GLUT4轉(zhuǎn)位的影響。另外，本研究也未能進(jìn)一步確定長期高脂膳食和運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)海馬內(nèi)GLUT4內(nèi)在活性的影響，因此，檢測海馬內(nèi)GLUT4的轉(zhuǎn)位以及內(nèi)在活性的變化將成為以后的一個(gè)研究方向。

3.2 高脂膳食和運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠海馬內(nèi)PI3K的影響

高脂膳食除了可以影響胰島素作用的外周靶器官的胰島素敏感性，還可以影響腦內(nèi)某些區(qū)域的胰島素敏感性，引起中樞胰島素抵抗的出現(xiàn)。Pratchayasakul 等[40]研究發(fā)現(xiàn)，12周高脂膳食引起大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元胰島素受體(insulin receptor ，IR)，胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate 1，IRS-1)和蛋白激酶B (protein kinase B ，PKB，也被稱為Akt)的磷酸化水平均出現(xiàn)下降。但McNeilly等[35]研究表明，高脂飲食喂養(yǎng)的動(dòng)物雖然出現(xiàn)外周胰島素抵抗，但海馬內(nèi)胰島素信號(hào)并沒有發(fā)生顯著性改變?？梢?，外周胰島素抵抗與海馬內(nèi)胰島素信號(hào)的改變之間并非總是保持一致。

McEwen 等[31]發(fā)現(xiàn)，胰島素受體與敏感性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT4均在海馬內(nèi)表達(dá)。Grillo等[24]報(bào)道，側(cè)腦室注射胰島素增加Akt磷酸化，同時(shí)伴隨GLUT4轉(zhuǎn)位到海馬質(zhì)膜增加，這可由PI3K抑制劑阻斷。對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞進(jìn)行的研究也表明，胰島素以PI3K依賴性方式刺激GLUT4轉(zhuǎn)位到質(zhì)膜，并增加葡萄糖攝取[11]。除了影響GLUT4的轉(zhuǎn)位，PI3K信號(hào)通路活化還可以誘導(dǎo)GLUT4蛋白表達(dá)，并促進(jìn)能量代謝和細(xì)胞存活[9]。McNay等[34]認(rèn)為，IRS-PI3K-GLUT4信號(hào)通路是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)胰島素作用最可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，因此，該信號(hào)通路可能在海馬葡萄糖代謝中發(fā)揮了重要作用。鑒于GLUT4和胰島素信號(hào)通路之間的密切關(guān)聯(lián)，本研究進(jìn)一步檢測了海馬內(nèi)胰島素信號(hào)通路的關(guān)鍵分子之一——PI3K。如同高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖對(duì)GLUT4的影響，本實(shí)驗(yàn)并沒有檢測到肥胖大鼠海馬內(nèi)胰島素信號(hào)通路的關(guān)鍵分子PI3K磷酸化水平的顯著變化，這意味著，海馬胰島素信號(hào)級(jí)聯(lián)的近端部分并沒有因?yàn)?7周高脂膳食而受損，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與McNeilly等[35]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。另外，本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)8周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖大鼠海馬PI3K磷酸化水平有顯著性影響，這一結(jié)果與運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖大鼠海馬GLUT4蛋白表達(dá)的影響相一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，海馬內(nèi)PI3K的激活以及膜蛋白GLUT4的表達(dá)不受17周高脂膳食和8周運(yùn)動(dòng)干預(yù)的顯著影響。

3.3 高脂膳食和運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠海馬內(nèi)CD36的影響

除了葡萄糖代謝，脂質(zhì)代謝對(duì)于大腦也至關(guān)重要。Ouellet等[37]證實(shí)，二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸可以通過擴(kuò)散通過血腦屏障，但該研究也承認(rèn)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的參與。CD36屬于B類清道夫受體家族，是一種表面糖蛋白，定位于細(xì)胞的囊泡膜、質(zhì)膜和線粒體膜上[12，13]。Xu等[44]認(rèn)為，CD36可以在不影響脂肪酸質(zhì)膜通量的情況下，通過增強(qiáng)脂肪酸的細(xì)胞內(nèi)代謝來增加脂肪酸的攝取。研究表明，CD36表達(dá)于小鼠多個(gè)腦區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞[23]，那么，海馬是否存在CD36蛋白表達(dá)？齊勇等[2]通過免疫組化法發(fā)現(xiàn)，正常大鼠和腦出血大鼠海馬處血管內(nèi)皮細(xì)胞存在CD36表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過Western blotting法證實(shí)，大鼠海馬內(nèi)存在CD36的蛋白表達(dá)，并且首次發(fā)現(xiàn)，高脂肪飲食誘導(dǎo)的肥胖可以引起海馬CD36蛋白表達(dá)顯著增加，表明高脂飲食引起的代謝改變可以調(diào)節(jié)海馬脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而可能增加海馬對(duì)脂肪酸的攝取和利用，這將減少葡萄糖供能，這也許是高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖對(duì)海馬GLUT4和PI3K無顯著影響的原因之一。另外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，8周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠海馬CD36蛋白表達(dá)無顯著性影響。這與本研究對(duì)GLUT4的檢測類似，由于無法獲得純化的質(zhì)膜蛋白和線粒體膜蛋白，因此，無法確定高脂膳食和運(yùn)動(dòng)干預(yù)是否影響CD36向質(zhì)膜或線粒體膜的轉(zhuǎn)位。

值得注意的是，CD36在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮多種作用。腦缺血時(shí)，CD36在促進(jìn)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]，此外，CD36還可能參與了缺血后星形膠質(zhì)瘢痕的形成[6]。有趣的是，CD36還被證明與阿爾茨海默氏病有關(guān)，過表達(dá)淀粉樣前體蛋白的小鼠缺失CD36，可改善認(rèn)知功能的惡化[38]。雖然本研究證實(shí)了CD36在海馬內(nèi)表達(dá)，但是，有關(guān)CD36在海馬中究竟發(fā)揮何種作用及其作用機(jī)制卻是未知的，需要進(jìn)一步深入探討。

3.4 高脂膳食和運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠海馬內(nèi)AMPK-ACC信號(hào)通路的影響

Chabowski等[14]報(bào)道，用激動(dòng)劑AICAR藥理激活心肌細(xì)胞 AMPK的同時(shí)，CD36的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著增加。那么，高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖引起的海馬CD36蛋白表達(dá)升高是否與AMPK信號(hào)通路有關(guān)？雖然，AMPK在外周組織代謝調(diào)控中的重要性已被認(rèn)知許久，但其在大腦功能中的作用卻是近些年才被研究。Culmsee等[16]報(bào)道，AMPK的催化亞基(alpha1和alpha2)和非催化亞基(β2和γ1)在海馬神經(jīng)元表達(dá)。AMPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)的一個(gè)主要靶點(diǎn)是ACC[43]，AMPK的激活可以磷酸化ACC的Ser79位點(diǎn)導(dǎo)致ACC的失活[26]。ACC可以將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)變?yōu)楸釂熙］o酶A，而丙二酰輔酶A是脂肪酸從頭合成的主要構(gòu)件以及肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1的變構(gòu)抑制劑[25]。AMPK通過調(diào)節(jié)下游ACC和肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1在控制脂質(zhì)代謝中起核心作用[41]。

鑒于肥胖大鼠海馬CD36蛋白表達(dá)的改變可能與AMPK信號(hào)通路有關(guān)以及AMPK和ACC在脂質(zhì)代謝中的重要作用，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估了AMPK和ACC的蛋白表達(dá)以及磷酸化水平。本研究發(fā)現(xiàn)，AMPKα和ACC均在海馬內(nèi)表達(dá)，但高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖大鼠海馬AMPKα和ACC蛋白表達(dá)和磷酸化水平均無顯著變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肥胖大鼠海馬CD36蛋白表達(dá)升高與AMPK信號(hào)通路的變化并不一致。Andersson等[4]的研究表明，運(yùn)動(dòng)本身并不引起大鼠下丘腦AMPK活性的顯著變化。同樣，本研究也顯示，運(yùn)動(dòng)對(duì)正常和肥胖大鼠海馬AMPKα和ACC活性無顯著影響。但Marosi等[29]的研究結(jié)果表明，15周的運(yùn)動(dòng)引起大鼠海馬AMPK磷酸化水平增加。本實(shí)驗(yàn)與Marosi等的研究結(jié)果出現(xiàn)不同的原因可能來自運(yùn)動(dòng)周期長短的差異，Marosi等采用的運(yùn)動(dòng)周期長達(dá)15周，而本實(shí)驗(yàn)采用的運(yùn)動(dòng)周期僅為8周。Bayod等[7]報(bào)道，36周運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，大鼠不同的大腦區(qū)域，包括海馬磷酸化AMPK水平增加?？傊?，海馬AMPK的激活可能是運(yùn)動(dòng)干預(yù)的關(guān)鍵靶分子，但運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)AMPK信號(hào)通路發(fā)揮顯著影響可能需要較長的時(shí)間。

4 結(jié)論

本研究證實(shí)大鼠海馬內(nèi)存在CD36蛋白表達(dá)，且首次發(fā)現(xiàn)高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖可以引起大鼠海馬CD36蛋白表達(dá)顯著升高。但海馬GLUT4蛋白表達(dá)以及PI3K、AMPKα和ACC的蛋白表達(dá)和磷酸化水平均不受高脂膳食和運(yùn)動(dòng)干預(yù)的顯著影響。

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Effects of Treadmill Exercise on GLUT4,CD36 and Related Proteins in the Hippocampus of Obese Rats

ZHANG Yun-li1,2,LOU Shu-jie1,CAI Ming1,LI Jing-jing1,XIN Lei1

Objective:To investigate the impact of 8-week aerobic endurance exercise training on glucose transporter 4 (GLUT4),fatty acid translocase(CD36) and related indexes in the hippocampus of obese rats. Methods:7-week-old male SD rats were randomly divided into normal diet group (C) and high fat diet group (H). The rats were maintained for 8 weeks on either normal diet or high fat diet. And then,the rats in group C were randomly and equally divided into normal diet sedentary group (NC) and normal diet exercise group (NE). Twenty rats in group H,whose body weight values were above the mean value plus 1.4 times the standard deviations of the body weights of rats in group C,were picked out and then randomly divided into obese sedentary group (OC) and obese exercise group (OE). Rats in group NC and group OC were without exercise training. Rats in group NE and group OE were performed an 8-week moderate intensity treadmill exercise training after being adapted to the treadmill for a week. The rats were fasted overnight 24 hours after the last exercise training,and then 6 rats were randomly selected in each group,anaesthetized with 10% chloral hydrate. Hippocampal tissues were isolated in ice bath. The expressions of GLUT4,CD36,PI3K,p-PI3K,AMPKα,p-AMPKα,ACC and p-ACC were detected by Western blotting. Results:The protein expression of CD36 in the hippocampus of obese rats was significantly increased,but the protein expressions of GLUT4,PI3K,AMPKα and ACC as well as the phosphorylation levels of PI3K,AMPKα and ACC were not significantly changed. The treadmill exercise training did not show significant effects on the protein expressions of CD36,GLUT4,PI3K,AMPKα and ACC as well as the phosphorylation levels of PI3K,AMPKα and ACC in the hippocampus of obese rats. Conclusion:The results demonstrated that CD36 protein was expressed in rat hippocampus,and this study found for the first time that CD36 protein expression increased significantly in the hippocampus of high fat diet-induced obese rats,while the treadmill exercise training did not exert significant effects on GLUT4,CD36 and related indexes.

rats;hippocampus;exercise;highfatdiet;obesity;glucosetransporter4;fattyacidtranslocase

2016-01-01；

2016-06-29

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81572241)，上海市人類運(yùn)動(dòng)能力開發(fā)與保障重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(上海體育學(xué)院)基金項(xiàng)目(11DZ2261100)。

張?jiān)汽?1977-)，女，江蘇徐州人，講師，在讀博士研究生，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)和腦健康，Tel:(0635)8539810，E-mail:zhangyunli@lcu.edu.cn；婁淑杰(1963-)，女，內(nèi)蒙古人，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)神經(jīng)生物學(xué)，Tel:(021)51253243，E-mail:shujielou319@163.com；蔡明(1986-)，男，山東日照人，在讀博士研究生，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)神經(jīng)生物學(xué)，E-mail:ethan321@126.com。

1.上海體育學(xué)院 運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院，上海 200438；2.聊城大學(xué) 體育學(xué)院，山東 聊城 252059 1.Shanghai University of Sport,Shanghai 200438,China；2.Liaocheng University,Liaocheng 252059,China.

G804.2

A

10.16469/j.css.201607007