基于響應(yīng)面法的海藻酸鈉固定β-呋喃果糖苷酶工藝優(yōu)化

江波，米書(shū)梅*，阮征，鄧近平，黃亞霖，印遇龍,4*

（1. 南昌大學(xué)食品學(xué)院，江西 南昌 330031；2. 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；

3. 湖南帝億生物科技有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410148；4. 中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

基于響應(yīng)面法的海藻酸鈉固定β-呋喃果糖苷酶工藝優(yōu)化

江波1,2，米書(shū)梅1,2*，阮征1,2，鄧近平3，黃亞霖3，印遇龍1,2,4*

（1. 南昌大學(xué)食品學(xué)院，江西 南昌 330031；2. 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；

3. 湖南帝億生物科技有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410148；4. 中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

糖苷酶在水解/合成生產(chǎn)功能性食品配料（含低聚糖）方面扮演著重要角色。為提高糖苷酶的重復(fù)利用率與穩(wěn)定性，本文對(duì)影響海藻酸鈉固定化β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase, FFase）工藝的因素進(jìn)行分析，利用響應(yīng)面法對(duì)固定化酶工藝進(jìn)行優(yōu)化，最后對(duì)所得固定化酶的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：影響海藻酸鈉固定化FFase工藝的關(guān)鍵因素及最佳條件為4 g/L海藻酸鈉、固定42 min、交聯(lián)溫度26 ℃，酶活回收率為60.95%；在此條件下與游離酶相比，4 ℃下保存12 d后，酶活力依然有60%以上，具有良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性；在溫度低于70 ℃范圍內(nèi)有良好的熱穩(wěn)定性。連續(xù)使用5次后，其固定酶活仍保持初始酶活的51.71%，具有良好的重復(fù)再利用性。關(guān)鍵詞：低聚乳果糖；呋喃果糖苷酶；酶固定化；海藻酸鈉；響應(yīng)面法

糖苷酶即糖苷水解酶，在自然界廣泛存在，它能夠水解糖苷鍵，維持生物體的基本功能[1]。β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase, FFase）既能釋放糖苷底物非還原端的β-果糖基，又能夠?qū)⒄崽侵械墓腔D(zhuǎn)移給含有羥基的受體，被廣泛用于合成功能性低聚糖[2-3]。低聚乳果糖具有多種生理功能，如抗齲齒、緩解便秘、調(diào)節(jié)腸道菌群與調(diào)節(jié)腸道免疫，在保健等方面具有重要的價(jià)值，市場(chǎng)應(yīng)用前景廣闊[4-6]。

β-呋喃果糖苷酶本身穩(wěn)定，但是容易受環(huán)境的種種不利因素影響而喪失活性。另外，很難使酶從反應(yīng)體系中回收利用[7]，游離酶的使用壽命和儲(chǔ)存期均短。而酶的固定化技術(shù)為提高酶的使用效率、降低成本提供了可能性。由于低聚糖的快速發(fā)展，糖苷酶的固定化逐漸成為研究的熱點(diǎn)，其中研究最為廣泛的是離子交換法[8]、大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹(shù)脂[9]、殼聚糖[10]和海藻酸鈉包埋法[11]。Chen等[10]采用磁性Fe3O4的納米微粒包被的殼聚糖作為載體對(duì)果糖苷酶的固定化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)固定化糖苷酶比游離糖苷酶具有更好的使用穩(wěn)定性；Gon?alves等[11]研究了吸附棉、濾紙、布、甘蔗渣、繩、紗布對(duì)FFase的固定化作用，發(fā)現(xiàn)濾紙和繩對(duì)FFase固定化后的酶活、重復(fù)使用性和穩(wěn)定性更好；Mouelhi等[12]研究了海藻酸鈉和殼寡糖對(duì)FFase的固定化效果，并對(duì)其pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和重復(fù)使用性進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)固定化酶的穩(wěn)定性在一定程度上都有所提高；Husain等[13]研究了氧化鋅和氧化鋅納米顆粒對(duì)半乳糖苷酶的固定化，發(fā)現(xiàn)氧化鋅納米顆粒固定的半乳糖苷酶的各種穩(wěn)定性都優(yōu)于氧化鋅固定和游離的糖苷酶。目前關(guān)于固定化的研究多集中在固定化酶的載體以及固定化酶的穩(wěn)定性方面，但是對(duì)固定化條件的優(yōu)化研究很少。

本文采用多變量響應(yīng)面法，對(duì)海藻酸鈉-戊二醛交聯(lián)法制備固定化FFase進(jìn)行了工藝優(yōu)化，獲得了具有更好穩(wěn)定性和更高重復(fù)使用率的固定化FFase。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

海藻酸鈉購(gòu)自阿拉丁化學(xué)品有限公司；戊二醛購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。高效液相色譜儀1200購(gòu)于美國(guó)Agilent公司，配ELSD檢測(cè)器（300S）購(gòu)于美國(guó)Softa公司；高速冷凍離心機(jī)（5418R）購(gòu)于德國(guó)艾本德公司；恒溫磁力攪拌器（JJ-1）購(gòu)于江蘇中大儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 β-呋喃果糖苷酶游離酶的制備 節(jié)桿菌（Arthrobacter sp. 10138）購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保存中心，接入種子培養(yǎng)基，在125 r/min，30 ℃條件下震蕩培養(yǎng)24 h，得種子液。然后在裝液量系數(shù)0.6，接種量5%（v/v），通氣量2 L/min，轉(zhuǎn)速200 r/min，pH 6.5，30 ℃下培養(yǎng)48 h，得到發(fā)酵液。在4 000 r/min條件下將發(fā)酵液離心20 min，取上清保存于-20℃；24 h后解凍再次離心，得到的上清液即為FFase游離酶。

1.2.2 β-呋喃果糖苷酶的海藻酸鈉固定[14]將一定質(zhì)量的海藻酸鈉緩慢加入溫水中并迅速攪拌，等其溶化均勻后按體積比1∶1與粗酶液混合后靜置片刻。取2.5 mL注射器吸取混合液，緩慢滴入一定濃度的氯化鈣溶液中，固定一段時(shí)間后，緩慢攪拌，并過(guò)濾。得到的球狀固定化酶用去離子水洗滌，加入戊二醛溶液進(jìn)行交聯(lián)。完成交聯(lián)后用去離子水洗滌，即得到FFase固定酶，保存于溫度4 ℃，pH 6.5，滅菌后的緩沖溶液中。

1.2.3 β-呋喃果糖苷酶固定的優(yōu)化 為篩選出對(duì)酶活回收率最重要的因素，運(yùn)用部分因子設(shè)計(jì)（FFD）進(jìn)行優(yōu)化（表1），評(píng)估各因素對(duì)酶活回收率的影響及其各因素之間的交互作用。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)固定化結(jié)果有較大影響的3個(gè)因素，以FFase酶活回收率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)[15-16]，對(duì)固定化條件進(jìn)行優(yōu)化。

表1 部分因子設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 The factor and level design of FFD

1.2.4 固定化酶的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別對(duì)游離酶和固定化酶的貯存、pH、熱穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性進(jìn)行分析。

貯存穩(wěn)定性：分別將游離酶和固定化酶在相同的緩沖液（pH 6.5）和溫度（4 ℃）下保存18 d。然后每隔3 d取出部分游離酶和固定酶，分別測(cè)定其FFase酶活回收率。

pH穩(wěn)定性：將游離酶和固定化酶分別放置于pH 2-11的緩沖溶液中，30 ℃放置1 h，分別測(cè)定游離酶和固定化酶的活力。

熱穩(wěn)定性：將FFase固定酶放置于pH 6.5的緩沖液中，游離酶調(diào)節(jié)pH至6.5，兩者分別放40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃水浴1 h后檢測(cè)酶活回收率。

操作穩(wěn)定性：分別將游離酶和固定化酶在pH 6.5、30 ℃下發(fā)酵12 h，連續(xù)合成低聚乳果糖，連續(xù)使用次數(shù)10次，測(cè)定游離酶和固定化酶酶活回收率。

1.2.5 酶活的定義與酶活回收率 FFase酶活定義：將2 ml的粗酶液和5 ml的糖液（含30%的蔗糖和30%的乳糖，pH 7.0）于37 ℃反應(yīng)24 h即為低聚乳果糖（lactosucrose，LS）。一個(gè)酶活力單位定義為每分鐘在上述條件下產(chǎn)生1×10-9mol LS的量來(lái)表示。

式中：y為酶活回收率；EA1為固定前的FFase酶總酶活；EA2為被固定化的FFase酶的總酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 部分因子設(shè)計(jì)篩選固定化條件

影響海藻酸鈉固定化FFase工藝條件包括。采用FFD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)海藻酸鈉濃度、固定時(shí)間、氯化鈣濃度、酶活、戊二醛濃度、交聯(lián)時(shí)間8個(gè)因素進(jìn)行主因素分析，28-2部分因子設(shè)計(jì)，包括16個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，并將中心點(diǎn)重復(fù)4次作誤差分析，以FFase固定酶酶活回收率為響應(yīng)值；結(jié)果不同條件下酶活回收率在14.31%-59.18%變化。

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，模型的P值為0.027，小于0.05，證明模型顯著；相關(guān)系數(shù)R2=0.943 8，表明數(shù)據(jù)擬合度較好，94.38%的FFase酶活回收率可以用此模型解釋。由表2可見(jiàn)，海藻酸鈉濃度（P=0.007 6）、固定時(shí)間（P=0.002 1）對(duì)酶活回收影響非常顯著，交聯(lián)溫度（P=0.044 6）對(duì)固定化酶的酶活回收率有顯著影響。因此海藻酸鈉濃度、固定時(shí)間、交聯(lián)溫度為FFase固定化工藝中關(guān)鍵因素。

表2 部分因子設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 The parameter estimates of variables of FFD

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

利用不同濃度的海藻酸鈉為載體固定FFase發(fā)現(xiàn)：酶活回收率隨著海藻酸鈉濃度的升高而升高，當(dāng)濃度達(dá)到4 g/L時(shí)，達(dá)到最大值（59%）。隨著濃度的繼續(xù)升高，酶活回收率反而下降（圖1）。這說(shuō)明海藻酸鈉濃度的高低會(huì)顯著影響固定酶的活力。這可能是因?yàn)椋汉Ｔ逅徕c與鈣離子反應(yīng)形成凝膠，使酶固定在凝膠中不易脫落。但是當(dāng)濃度較低時(shí)，形成的凝膠孔徑較大，固定化酶較易流失；而當(dāng)濃度過(guò)高時(shí)，凝膠過(guò)于致密，孔徑較小，限制了酶、底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散，從而導(dǎo)致了酶活回收率的降低。因此，海藻酸鈉的最適范圍為3-5 g/L。

圖1 海藻酸鈉濃度、固定時(shí)間和交聯(lián)溫度對(duì)固定化效果的影響Fig. 1 Effect of concentration of sodium alginate on the catalytic ability of immobiled FFase

固定時(shí)間對(duì)酶活回收率影響的結(jié)果見(jiàn)圖1所示。當(dāng)固定時(shí)間為60 min時(shí)，酶活回收率達(dá)到最大值（53%）。固定時(shí)間太長(zhǎng)或太短都會(huì)導(dǎo)致酶活回收率的降低，這是因?yàn)楣潭〞r(shí)間太短，海藻酸鈉鈣凝膠孔徑大，不穩(wěn)定；而時(shí)間太長(zhǎng)，鈣離子對(duì)FFase固定酶的作用加劇，阻礙底物的反應(yīng)，從而使酶活回收率降低。因此，固定時(shí)間應(yīng)控制在40-60 min。

當(dāng)交聯(lián)溫度低于20 ℃時(shí)，交聯(lián)作用不顯著，而高于30 ℃后，酶活回收率急劇降低（圖1）。這是因?yàn)槲於┑慕宦?lián)性質(zhì)與其所在環(huán)境的pH有關(guān)，其交聯(lián)性質(zhì)只有在特定pH下才能充分顯示出來(lái)，溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致pH環(huán)境的變化，從而使戊二醛的交聯(lián)性質(zhì)降低或喪失。因此，固定化的交聯(lián)溫度應(yīng)在20-30 ℃。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，一共選擇試驗(yàn)點(diǎn) 15 個(gè)，其中12個(gè)析因點(diǎn)、3 個(gè)零點(diǎn)，測(cè)得各試驗(yàn)點(diǎn)的酶活回收率（Y），方案與結(jié)果見(jiàn)表3。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面法對(duì)固定化條件進(jìn)一步優(yōu)化處理。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析Table 3 Response surface design layout and experimental results

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇海藻酸鈉濃度（X1）、固定時(shí)間（X2）、交聯(lián)溫度（X3）3個(gè)因素，各取3個(gè)水平，以酶活回收率為響應(yīng)值(Y)，利用SAS 9.2分析軟件進(jìn)行多元回歸分析與擬合，因素對(duì)響應(yīng)值影響的回歸模型方程如下，

回歸分析見(jiàn)表4，方差分析見(jiàn)表5。由方程可知，因素的主效應(yīng)順序依次為：固定時(shí)間(X2)，海藻酸鈉濃度(X1)與交聯(lián)溫度(X3)。

由表4、5的分析結(jié)果可以看出：F模型=42.09，P=0.003，則表明模型對(duì)于響應(yīng)值影響顯著，說(shuō)明了不同固定化條件酶活回收率差異顯著。響應(yīng)面模型的失擬項(xiàng)表示響應(yīng)面模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)的實(shí)際值不擬合的概率[17]。而實(shí)驗(yàn)中失擬項(xiàng)P值為0.219，這表明響應(yīng)面模型的失擬項(xiàng)不顯著。同時(shí)模型的R2=0.987 0，說(shuō)明該模型能夠說(shuō)明98.7%的響應(yīng)值的變化，進(jìn)一步證明了回歸方程對(duì)因素水平擬合結(jié)果的可靠性。因此，模型選擇合適，可用該回歸方程對(duì)固定化酶活回收率進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2.4 響應(yīng)面法分析及優(yōu)化

2.4.1 酶活回收率的分析 根據(jù)回歸方程，固定一個(gè)因素，分析其他因素對(duì)酶活回收率的影響，作出響應(yīng)面及等高線圖（圖2-4），可直觀地看出各因子對(duì)響應(yīng)值的影響變化趨勢(shì)，而且回歸模型存在最大值。再對(duì)回歸方程[18]進(jìn)行方差分析及偏回歸系數(shù)估計(jì)。

表4 響應(yīng)面結(jié)果回歸分析Table 4 Regression analysis of Response surface design

表5 方差分析Table 5 Variance analysis

圖2 海藻酸鈉濃度、固定時(shí)間(X1、X2)交互作用的曲面和等高線圖Fig. 2 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of the sodium alginate concentration and reticulation time

圖3 海藻酸鈉濃度、交聯(lián)溫度(X1、X3)交互作用的曲面和等高線圖Fig. 3 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of the sodium alginate concentration and crosslinking temperature

圖4 固定時(shí)間、交聯(lián)溫度(X2、X3)交互作用的曲面和等高線圖Fig. 4 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of the reticulation time and crosslinking temperature

從圖2可以看出，當(dāng)交聯(lián)溫度為25 ℃時(shí)，海藻酸鈉和固定時(shí)間對(duì)酶活回收率具有非常顯著的影響。當(dāng)海藻酸鈉濃度不變時(shí)，酶活回收率隨著固定時(shí)間的延長(zhǎng)而升高；當(dāng)固定時(shí)間不變時(shí)，酶活回收率隨著海藻酸鈉濃度的增加而升高；酶活回收率的變化速率顯示了固定時(shí)間的主效應(yīng)大于海藻酸鈉濃度，與統(tǒng)計(jì)結(jié)果相符。

從圖3可以看出，當(dāng)固定時(shí)間為60 min時(shí)，海藻酸鈉濃度對(duì)固定化酶的酶活回收率的影響較交聯(lián)溫度更為顯著。當(dāng)交聯(lián)溫度不變時(shí)，酶活回收率隨著海藻酸鈉濃度的增加而升高；當(dāng)海藻酸鈉濃度不變時(shí)，交聯(lián)溫度在25 ℃左右，酶活回收率達(dá)到最大。酶活回收率的變化速率顯示了海藻酸鈉濃度的主效應(yīng)大于交聯(lián)溫度，與統(tǒng)計(jì)結(jié)果相符。

從圖4可以看出，當(dāng)海藻酸鈉濃度為4 g/L時(shí)，固定化時(shí)間比交聯(lián)溫度對(duì)固定化酶的影響較為顯著。當(dāng)交聯(lián)溫度不變時(shí)，酶活回收率隨著固定時(shí)間的延長(zhǎng)而升高；當(dāng)固定時(shí)間不變時(shí)，交聯(lián)溫度在25 ℃左右，酶活回收率達(dá)到最大。酶活回收率的變化速率顯示了固定時(shí)間的主效應(yīng)大于交聯(lián)溫度，與統(tǒng)計(jì)結(jié)果相符。

2.4.2 固定化條件的優(yōu)化 為得到最佳的固定化條件，利用SAS軟件進(jìn)行嶺脊分析[19]最大值，得到海藻酸鈉濃度X1、固定時(shí)間X2、交聯(lián)溫度X3的代碼值分別為：0.154 9、0.111 9和0.231 2，酶活回收率理論最大值為60.95%。考慮實(shí)際操作的便利性，固定化最佳條件為：海藻酸鈉濃度4 g/L、固定時(shí)間為42 min、交聯(lián)溫度為26 ℃。

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 為了對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，在優(yōu)化的固定化條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，固定化酶酶活回收率平均值為59.33%，RSD為1.91%，與理論值60.15%非常接近，由此證明模式合理，結(jié)果理想。

2.5 固定化酶穩(wěn)定性研究

將固定化酶和游離酶分別在相同的條件下保存18 d，測(cè)定酶活回收率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：固定化酶與游離酶相比，固定酶的貯存穩(wěn)定性較好（圖5A）。游離酶在第3 d時(shí)，酶活為95.32%，6 d后開(kāi)始快速下降，12 d時(shí)，相對(duì)酶活只有9.81%，而固定酶在12 d后相對(duì)酶活仍有60%，18 d后還有41.13%。固定化酶的貯存穩(wěn)定性對(duì)實(shí)際應(yīng)用非常重要，如果固定化酶在貯存中出現(xiàn)失活，將會(huì)大大降低它的使用價(jià)值。

將固定化酶與游離酶分別在相同的pH下放置1 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與游離酶相比，固定化酶具有更好的pH穩(wěn)定性（pH 4-9），固定化酶的相對(duì)酶活都大于70%（圖5B）。pH會(huì)改變酶和底物的解離，過(guò)酸或過(guò)堿都會(huì)對(duì)酶的活性產(chǎn)生不利影響，甚至使其變性失活，只有在一定pH條件下，酶的活性才能達(dá)到最高。在不同pH條件下，游離酶比固定化酶對(duì)pH的變化更為敏感，表明FFase固定化后pH穩(wěn)定性有了顯著提高。

將固定化酶和游離酶在不同溫度下放置相同時(shí)間，發(fā)現(xiàn)：固定化酶的熱穩(wěn)定優(yōu)于游離酶。游離酶高于45 ℃時(shí)，酶活回收率急劇下降，70 ℃則基本失活；在60 ℃時(shí)，固定酶的相對(duì)酶活為79.27%，高于65 ℃時(shí)，相對(duì)酶活開(kāi)始快速降低（圖5C）。由此可見(jiàn)，固定化酶的熱穩(wěn)定性明顯高于游離酶，這可能是由于酶固定化后，凝膠限制了酶分子的整體運(yùn)動(dòng)，從而使其使用穩(wěn)定性增加。固定化酶的熱穩(wěn)定性對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。

固定化酶的使用穩(wěn)定性是其最重要的性能指標(biāo)，F(xiàn)Fase固定酶的使用穩(wěn)定性即重復(fù)再利用性結(jié)果如圖6所示。當(dāng)FFase固定酶連續(xù)使用5次，相對(duì)酶活回收率在51.71%；使用7次后酶活回收率為16.19%。使用次數(shù)越多，固定酶顆粒破碎使酶外泄，相對(duì)酶活回收率下降。這是因?yàn)镕Fase包埋在海藻酸鈉鈣凝膠中，F(xiàn)Fase不易泄露，增強(qiáng)了其機(jī)械強(qiáng)度，從而使固定化酶能重復(fù)多次利用，提高其使用穩(wěn)定性。

圖5 固定化酶與游離酶的貯存、pH和熱穩(wěn)定性Fig. 5 The storing, pH, thermal stability of immobilized enzyme and free enzyme

圖6 固定化酶的使用穩(wěn)定性Fig. 6 Effect of the operate time on FFase immobilized enzyme

3 討 論

與游離酶相比，F(xiàn)Fase經(jīng)海藻酸鈉固定化后，在高溫和極端pH值下具有更好的穩(wěn)定性，這可能是因?yàn)槊附Y(jié)構(gòu)的固定，限制了酶結(jié)構(gòu)波動(dòng)的緣故[20]。轉(zhuǎn)化酶經(jīng)過(guò)木屑固定化后，它在pH 7.6和8.0時(shí)具有更好的穩(wěn)定性，而游離酶在高pH條件下完全失活[21]。固定化酶穩(wěn)定性的提高對(duì)于應(yīng)用具有重要的意義，比如蔗糖在高溫下更容易溶解，致病菌在高溫下不能生長(zhǎng)[22]，此外，酶熱穩(wěn)定性的提高也限制了生物催化劑在生產(chǎn)中的長(zhǎng)期使用[23]。

除了熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性外，固定化酶的操作穩(wěn)定性是工業(yè)應(yīng)用中成本效益的關(guān)鍵因素[24]。通過(guò)將海藻酸鈉固定后的FFase進(jìn)行多次重復(fù)使用，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)固定化酶重復(fù)操作5次后相對(duì)酶活力仍保持在51.71%，重復(fù)7次使用，酶活有16.19%。裴哲等[25]發(fā)現(xiàn)采用海藻酸鈉為載體固定化香菇纖維素酶后，固定化酶在重復(fù)使用6次后，仍保持72.20%的酶活力。雷生嬌和潘思軼[26]的研究發(fā)現(xiàn)以海藻酸鈉為載體，戊二醛為交聯(lián)劑的柚皮苷固定化酶重復(fù)使用7次后，活力仍保持在60%以上。有研究表明β-葡萄糖苷酶經(jīng)海藻酸鈉-殼聚糖包埋固定化后，重復(fù)使用8次之后其相對(duì)酶活力仍大于50%[27]。采用多種載體聯(lián)合固定的方式，可能會(huì)使固定酶的穩(wěn)定性更好，因此，我們將會(huì)對(duì)多種載體聯(lián)合固定FFase進(jìn)行進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

以海藻酸鈉為載體固定化FFase，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)固定條件進(jìn)行優(yōu)化，得到FFase固定化的最佳工藝條件為：4 g/L海藻酸鈉，固定42 min，交聯(lián)溫度26 ℃，在該條件下，酶活回收率為60.95%。與游離酶相比，固定酶具有更好的貯存穩(wěn)定性、pH和熱穩(wěn)定性。其重復(fù)操作5次后相對(duì)酶活力仍保持在51.71%。

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（責(zé)任編輯：王育花）

Optimization of immobilization of β-fructofuranosidase to sodium alginate by response surface methodology

JIANG Bo1,2, MI Shu-mei1,2*, RUAN Zheng1,2, DENG Jin-ping3, HUANG Ya-lin3, YIN Yu-long1,2,4*

（1. College of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang, Jiangxi 330031, China; 2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang, Jiangxi 330047, China; 3. Hunan Diyi Biotechnology Co., Ltd, Changsha, Hunan 410148, China; 4. Institute of Subtropical Agriculture, the Chinese Academy of Sciences, Changsha, Hunan 410125, China）

Glycosidases play a vital role in the process of manufacturing functional ingredients. To improve the stability and repetitive usage of glycosidase, many important factors affecting the immobilization of β-fructofuranosidase to sodium alginate were investigated, and the immobilization parameters was optimized by response surface methodology. The crucial factors affecting the immobilization of β-fructofuranosidase contained sodium alginate concentration, immobilization time, and cross-linking temperature. The optimal immobilization conditions were obtained as follows: sodium alginate concentration 4 g/L, immobilization time 42 min, cross-linking temperature 26 ℃, and the recovery of enzyme activity 60.95%. Under the optimal conditions, the residual enzyme activity was more than 60% of the initial enzyme activity after storage for 12 d at 4 ℃. The thermal stability of immobilized FFase was higher than free FFase at 70 ℃. The enzyme activity retained over 51.71% of the initial value after the fifth repeat usage. It showed that the immobilized FFase had the better repetitive utilization.

lactosucrose, fructofuranosidase, enzyme immobilization, sodium alginate, response surface methodology

MI Shu-mei, E-mail: mishumei880912@126.com; YIN Yu-long, E-mail: yinyulong@isa.ac.cn.

Q814.2

A

1000-0275（2016）06-1206-08

10.13872/j.1000-0275.2016.0123

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江西省科技支撐項(xiàng)目（20132BBF60059）；國(guó)家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2014GB2D200216）。

江波（1987-），男，江西宜春人，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)，E-mail：178359961@qq.com；通訊作者：米書(shū)梅（1987-），女，山東濟(jì)寧人，碩士，研究方向?yàn)楣δ苁称?，E-mail：mishumei880912@126.com；印遇龍（1956-），男，湖南常德人，博士，研究員，研究方向?yàn)閯?dòng)物營(yíng)養(yǎng)，E-mail：yinyulong@isa.ac.cn。

2015-12-16，接受日期：2016-07-25

Foundation item: Science and Technology Supporting Project of Jiangxi Province (20132BBF60059); National Agricultural Science and Technology Achievements Transformation Projects (2014GB2D200216).

Received 16 December, 2015;Accepted 25 July, 2016