赭曲霉毒素A完全抗原的制備及鑒定

周景明，李春革，祁艷華，張羅莎，張改平，王愛(ài)萍

(鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州 450001)

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赭曲霉毒素A完全抗原的制備及鑒定

周景明，李春革，祁艷華，張羅莎，張改平，王愛(ài)萍*

(鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州 450001)

赭曲霉毒素A(OTA)是一種對(duì)人和動(dòng)物具有廣泛毒性的霉菌毒素，為建立OTA在食品和飼料中的快速檢測(cè)方法，采用活性酯法(NHS)將OTA與牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清白蛋白(OVA)偶聯(lián)，分別制備了免疫原OTA-BSA和包被原OTA-OVA。紫外掃描和SDS-PAGE鑒定表明，OTA與BSA和OTA與OVA偶聯(lián)成功，偶聯(lián)物OTA-BSA和OTA-OVA的偶聯(lián)比分別為7∶1和4.5∶1。用免疫原OTA-BSA免疫Balb/c小鼠，制備多克隆抗體，用OTA-OVA包被ELISA板進(jìn)行檢測(cè)，小鼠血清中抗OTA的抗體效價(jià)最高可達(dá)1∶51200。表明制備的免疫原OTA-BSA具有良好的免疫原性，為OTA單克隆抗體的制備奠定了基礎(chǔ)。

赭曲霉毒素A；活性酯法；完全抗原；多克隆抗體

赭曲霉毒素(ochratoxin)是由曲霉菌屬(Aspergillus)和青霉菌屬(Penicillium)的某些種產(chǎn)生的二級(jí)代謝產(chǎn)物，包含7種結(jié)構(gòu)類似的化合物。其中赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)最普遍且毒性最強(qiáng)。OTA具有腎臟毒性、肝臟毒性、免疫毒性，以及致畸、致癌和致突變等特性，對(duì)動(dòng)物和人體健康有很大的潛在危害[1]。根據(jù)已發(fā)現(xiàn)的真菌毒素的重要性及危害性排序，OTA僅次于黃曲霉毒素而位列第2，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)于1993年將OTA列為2B類致癌物[2]。因此,世界各國(guó)均非常重視對(duì)OTA的檢測(cè)和控制，分別制定了相關(guān)的限量標(biāo)準(zhǔn)，以確保食品安全和消除國(guó)際貿(mào)易的技術(shù)壁壘。目前，用于檢測(cè)OTA的方法主要有高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography，HPLC)、液相-質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatography mass spectrometer，LC-MS)[3]、毛細(xì)管電泳-二極管列陣檢測(cè)法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、膠體金免疫層析法(gold immunochromatography assay，GICA)等,其中免疫學(xué)方法以其快速、方便、成本低的優(yōu)點(diǎn)成為較常運(yùn)用的OTA檢測(cè)方法之一[4]。

OTA分子質(zhì)量為403.8u，屬于小分子物質(zhì)，具有免疫反應(yīng)性，不具備免疫原性，必須與大分子物質(zhì)偶聯(lián)之后，借助大分子的T細(xì)胞表位才能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)OTA的特異性抗體應(yīng)答。本試驗(yàn)采用活性酯法，先將OTA轉(zhuǎn)化成較活潑的中間體，然后與大分子物質(zhì)偶聯(lián)，分別獲得免疫原OTA-BSA和包被原OTA-OVA，并從紫外掃描、SDS-PAGE和動(dòng)物免疫3個(gè)方面對(duì)制備的偶聯(lián)抗原進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 赭曲霉毒素(OTA)為Pribolab公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清白蛋白(OVA)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均為Sigma公司產(chǎn)品；碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氫呋喃(THF)、乙醇均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)法蛋白含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠 IgG(G@M-IgG-HRP)為Abbkine公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器 TP-214分析天平為Denver公司產(chǎn)品；Mini-PROTEAN Tetra System電泳儀、Gel DocTMXR+ 凝膠成像系統(tǒng)、Immuno WashTM1575微孔洗板機(jī)、iMARKTM酶標(biāo)儀，Bio-Rad公司；NanoDrop 2000c分光光度計(jì)、Barnstead Nanopure超純水儀，Thermo公司；CMAG HS4加熱磁力攪拌器為德國(guó)IKA公司產(chǎn)品；H1650-W臺(tái)式高速離心機(jī)為湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；WD-9405B型水平搖床為北京市六一儀器廠產(chǎn)品；透析袋為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3只健康雌性Balb/c小鼠，6周齡，鄭州大學(xué)分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室自繁自養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 偶聯(lián)抗原的制備 稱取1mg OTA溶解于2mL的無(wú)水四氫呋喃(THF)中，按照摩爾比OTA∶NHS∶EDC=1∶2∶4的比例分別加入NHS和EDC,于室溫下避光劇烈搖動(dòng)4h。活化后10000r/min離心15min，取上清，棄沉淀，揮發(fā)THF,殘留物溶解于0.2mL的二甲基甲酰胺中，此為活化產(chǎn)物。稱取10mg BSA,充分溶解于2mL 0.13mol/L NaHCO3溶液中，于4℃預(yù)冷。將活化產(chǎn)物緩慢滴加于BSA溶液中，室溫避光緩慢搖動(dòng)，偶聯(lián)時(shí)間為4h。反應(yīng)產(chǎn)物于0.05mol/L 的NaHCO3溶液中透析72h,去除游離的OTA以及其他小分子物質(zhì),透析結(jié)束后3000r/min離心10min，上清即為OTA與BSA的偶聯(lián)物，置-20℃保存，備用。同法制備OTA-OVA偶聯(lián)物[5]。

1.2.2 偶聯(lián)物的濃度測(cè)定及鑒定

1.2.2.1 偶聯(lián)物蛋白濃度測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)試劑盒按照使用說(shuō)明測(cè)定偶聯(lián)物OTA-BSA和OTA-OVA的濃度。

1.2.2.2 偶聯(lián)物紫外掃描及偶聯(lián)比鑒定 在特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)，根據(jù)偶聯(lián)物偶聯(lián)前后的特征吸收峰，分析吸收峰位置及吸收強(qiáng)度的變化，判斷OTA與BSA、OVA的偶聯(lián)效果。用PBS配制一定濃度的OTA(OTA標(biāo)準(zhǔn)品先用無(wú)水乙醇溶解，之后用PBS稀釋)、BSA、OVA、OTA-BSA、OTA-OVA溶液，在200nm～800nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，判斷偶聯(lián)物偶聯(lián)情況[6]。以O(shè)TA-BSA為例，分別測(cè)定OTA、BSA以及OTA-BSA在333nm、279nm處的吸光度值，按照下面公式進(jìn)行計(jì)算偶聯(lián)比[7]。

K為物質(zhì)在其最大吸收峰處的克分子消光系數(shù)，ρ為濃度，A為吸光度值，M為摩爾質(zhì)量。

1.2.2.3 偶聯(lián)物SDS-PAGE鑒定 對(duì)合成的偶聯(lián)物進(jìn)行SDS-PAGE(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectropheresis)分析，濃縮膠濃度為50g/L，電壓設(shè)為90V，分離膠濃度為120g/L，電壓設(shè)為120V。上樣量為20μL，蛋白膠用考馬斯亮藍(lán)染色液2h后，置于脫色液中進(jìn)行脫色，直至蛋白條帶清晰可見(jiàn)，根據(jù)結(jié)果判斷是否偶聯(lián)成功。

1.2.2.4OTA-BSA免疫原性鑒定

(1)選取3只6周齡健康雌性Balb/c小鼠,用OTA-BSA進(jìn)行免疫。免疫方式是皮下多點(diǎn)注射，免疫劑量為20μg/200μL/只，首免加弗氏完全佐劑，再次免疫均用不完全佐劑，首免3周后，進(jìn)行第2次免疫，之后每隔2周免疫1次，共免疫4次[8]。末次免疫2周后，斷尾采血并用PBS進(jìn)行100倍稀釋，3000r/min離心10min，分裝并保存。

(2)多抗血清效價(jià)的檢測(cè)。用碳酸鹽緩沖液將OTA-OVA稀釋為2μg/mL，50μL/孔包被于ELISA板上，4℃包被過(guò)夜。次日PBST洗板3次后，加入50mL/L豬血清進(jìn)行封閉，200μL/孔，37℃溫育2h。PBST洗板3次，拍干封閉液。第1孔加入100μL1∶100稀釋的血清，其余孔加入PBS，50μL/孔，用多通道微量移液器從第1孔吸取50μL血清與第2孔鋪底的PBS混勻后取50μL加入第3孔，以此類推進(jìn)行倍比稀釋，稀釋到第10列為止；第11列加入陰性血清作為陰性對(duì)照，50μL/孔；第12列加入PBS作為空白對(duì)照，50μL/孔,37℃作用1h。PBST洗滌6次，加入1∶5000稀釋的G@M-IgG-HRP,50μL/孔，37℃孵育1h。PBST洗板6次，加入TMB顯色液，50μL/孔，顯色5min。然后加入2mol/L的硫酸終止顯色，50μL/孔，測(cè)定各孔的OD450nm值,同時(shí)設(shè)立陰性(NC)對(duì)照和空白(BC)對(duì)照。以P/N≥2.1的血清最高稀釋度作為該免疫血清的效價(jià)(P為待測(cè)孔的OD450nm值，N為陰性對(duì)照孔的OD450nm值)[9]。

(3)多抗血清敏感性的檢測(cè)。檢測(cè)血清多抗敏感性時(shí)按如前所述方法包被抗原后，抗原包被方法如前所述，第1孔加入640ng/mL的OTA標(biāo)準(zhǔn)品，之后用PBS倍比稀釋,50μL/孔，然后每孔加入檢測(cè)效價(jià)時(shí)OD450nm值為1.0左右的稀釋度的陽(yáng)性血清，50μL/孔，最后留2孔做陰性對(duì)照和空白對(duì)照，37℃作用1h。PBST洗板6次，每孔加入50μL1∶5000稀釋的G@M-IgG-HRP，37℃孵育1h。PBST洗板6次，加入TMB顯色液，50μL/孔，顯色5min，加入2mol/L的硫酸終止顯色，用酶標(biāo)儀讀數(shù)，分析并保存數(shù)據(jù)。計(jì)算不同濃度OTA的抑制率，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。抑制率=(1-B/B0)×100%(B0為不加OTA孔的OD450nm值，B為加入不同濃度OTA孔的OD450nm值)，并計(jì)算IC50值[10]。

2 結(jié)果

2.1 偶聯(lián)物濃度測(cè)定結(jié)果

利用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)得OTA-BSA濃度為2.94mg/mL，OTA-OVA的濃度為1.20mg/mL。

2.2 紫外掃描及偶聯(lián)物偶聯(lián)比鑒定結(jié)果

對(duì)OTA、BSA、OVA、OTA-BSA、OTA-OVA進(jìn)行紫外掃描分析，結(jié)果如圖1、圖2所示。OTA在333nm處有特征吸收峰，BSA、OVA在279nm處有特征吸收峰，偶聯(lián)物的最大吸收峰為379nm處，相對(duì)于OTA、BSA、OVA的峰值產(chǎn)生了一定位置的偏移與疊加現(xiàn)象，初步證明偶聯(lián)物制備成功。進(jìn)而得到OTA、BSA、偶聯(lián)物在333、279、379nm處的吸光度值，根據(jù)1.2.2.2所示公式計(jì)算得出OTA-BSA的偶聯(lián)比為7∶1，OTA-OVA的偶聯(lián)比為4.5∶1。

圖1OTA、BSA、OTA-BSA紫外掃描鑒定圖

Fig.1UltravioletspectrumofOTA，BSA，OTA-BSA

圖2OTA、OVA、OTA-OVA紫外掃描鑒定圖

Fig.2UltravioletspectrumofOTA,OVA,OTA-OVA

2.3 SDS-PAGE鑒定結(jié)果

電泳鑒定結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。由圖3和圖4可知，偶聯(lián)物OTA-BSA、OTA-OVA的條帶比BSA、OVA條帶滯后，且有拖尾現(xiàn)象，證明偶聯(lián)成功。由于BSA分子質(zhì)量約為67ku,OVA的分子質(zhì)量約為45ku,OTA分子質(zhì)量約為0.403ku,偶聯(lián)物OTA-BSA、OTA-OVA分子質(zhì)量分別比BSA、OVA稍大，所以SDS-PAGE鑒定中泳動(dòng)距離不明顯。

1.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 2.OTA-BSA; 3.BSA
1.ProteinmolecularweightMarker; 2.OTA-BSA; 3.BSA

圖3OTA-BSA的SDS-PAGE分析
Fig.3AnalysisofOTA-BSAbySDS-PAGE

1.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);2.OTA-OVA; 3.OVA
s1.ProteinmolecularweightMarker; 2.OTA-OVA; 3.OVA

圖4OTA-OVA的SDS-PAGE分析
Fig.4AnalysisofOTA-OVAbySDS-PAGE

2.4 免疫學(xué)鑒定結(jié)果

2.4.1 抗血清效價(jià)檢測(cè) 雖然OTA與載體蛋白在分子結(jié)構(gòu)上已經(jīng)證明偶聯(lián)成功，但合成的偶聯(lián)抗原能否誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)OTA的抗體，還要通過(guò)動(dòng)物免疫來(lái)檢驗(yàn)。用OTA-BSA免疫的3只小鼠，以O(shè)TA-OVA為包被抗原通過(guò)ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清中針對(duì)OTA的抗體及效價(jià)如表1所示。從表1可以看出，1號(hào)和2號(hào)小鼠的血清抗體效價(jià)均達(dá)到了1∶51200，其中1號(hào)小鼠的免疫效果最好。根據(jù)血清抗體檢測(cè)結(jié)果可知，合成的OTA-BSA具有良好的免疫效果。

2.4.2 血清多抗敏感性檢測(cè) 多抗敏感性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)小鼠血清敏感性，選取抗體效價(jià)較高的1號(hào)小鼠血清進(jìn)行試驗(yàn)。以O(shè)TA濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以B/B0為縱坐標(biāo)，繪制1號(hào)小鼠血清的抑制曲線，如圖5所示，并計(jì)算其IC50值。結(jié)果IC50為9.467ng/mL。進(jìn)一步說(shuō)明了合成的OTA-BSA具有較好的免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)OTA的特異性抗體。

表1 間接ELISA測(cè)定小鼠血清抗OTA抗體效價(jià)Table 1 OTA antibody titers of mouse sera detected by indirect ELISA

表2 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定1號(hào)小鼠血清的抑制效果Table 2 The inhibitive effect of number one mouse serum detected by icELISA

圖5 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定1號(hào)小鼠血清的抑制曲線
Fig.5TheinhibitivecurveofnumberonemouseserumdetectedbyicELISA

3 討論

OTA屬于小分子物質(zhì)，不能作為完全抗原免疫動(dòng)物制備其單克隆抗體，與大分子物質(zhì)偶聯(lián)制備偶聯(lián)物，用偶聯(lián)物免疫動(dòng)物才能刺激動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)OTA的特異性的抗體。由于BSA價(jià)廉易得，理化性質(zhì)穩(wěn)定，在水相或某些有機(jī)溶劑中有較高的溶解度、分子內(nèi)含有大量的活潑基團(tuán)(如氨基、羧基)等優(yōu)點(diǎn)，所以本試驗(yàn)選用OTA與BSA的偶聯(lián)作為免疫原。用偶聯(lián)物免疫動(dòng)物時(shí)，動(dòng)物至少會(huì)產(chǎn)生兩類抗體，一類是針對(duì)小分子半抗原的，另一類則是針對(duì)載體。為了檢測(cè)產(chǎn)生的針對(duì)半抗原的抗體，必須排除針對(duì)載體的抗體的干擾，所以合成包被原的載體也尤為重要，本試驗(yàn)選用與BSA結(jié)構(gòu)差別較大的OVA作為包被原載體，用來(lái)檢測(cè)免疫原免疫動(dòng)物的效果。

半抗原與載體結(jié)合的部位直接影響所制備抗體的特異性。一般來(lái)說(shuō)，應(yīng)選擇對(duì)免疫識(shí)別不太重要的部位進(jìn)行偶聯(lián)，如距離半抗原主要抗原決定簇部位較遠(yuǎn)且不是維持半抗原結(jié)構(gòu)必要的部位。這是因?yàn)榭贵w通常對(duì)遠(yuǎn)離偶聯(lián)位點(diǎn)的半抗原具有較好的識(shí)別能力，有利于產(chǎn)生效價(jià)高且特異性好的抗體[11]。OTA分子中有羧基，可以用混合酸酐法和活性酯法對(duì)其進(jìn)行偶聯(lián)，由于混合酸酐法步驟繁雜，制備的抗體血清特異性差以及副產(chǎn)物多等缺點(diǎn)，而活性酯法卻有步驟簡(jiǎn)便、制備的抗體特異性強(qiáng)、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)，所以本試驗(yàn)選用活性酯法制備免疫原與包被原。

人工合成抗原偶聯(lián)比的大小與半抗原功能基團(tuán)的活性、位阻、反應(yīng)條件及反應(yīng)原料等有關(guān)。偶聯(lián)比的大小與偶聯(lián)物免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗血清的特異性有關(guān)。因此，免疫前測(cè)定偶聯(lián)物偶聯(lián)比具有特殊意義。一般情況下，半抗原與載體偶聯(lián)比為3∶1～45∶1時(shí)具有較強(qiáng)的免疫原性[12]。并不是載體上偶聯(lián)的半抗原數(shù)目越多越好，據(jù)報(bào)道，載體表面覆蓋過(guò)多的半抗原不利于載體與淋巴細(xì)胞抗原受體的結(jié)合，也不能刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)[13]。不同偶聯(lián)比的合成抗原，可以根據(jù)試驗(yàn)需要調(diào)節(jié)免疫劑量來(lái)達(dá)到較好的免疫效果。本試驗(yàn)合成的人工抗原OTA與BSA偶聯(lián)比為7∶1，OTA與OVA偶聯(lián)比為4.5∶1，從小鼠免疫試驗(yàn)結(jié)果看，合成的偶聯(lián)抗原具有較好的免疫效果。

在對(duì)合成的偶聯(lián)物進(jìn)行紫外掃描及SDS-PAGE電泳鑒定中，由于偶聯(lián)物特征吸收峰相對(duì)于BSA、OVA及OTA的特征吸收峰有位置偏移，且有疊加效應(yīng)；OTA與載體的偶聯(lián)物分子質(zhì)量要大于單純載體的分子質(zhì)量，所以在電泳鑒定中，偶聯(lián)物條帶相對(duì)于載體條帶有滯后、拖尾的現(xiàn)象。在本試驗(yàn)中，從動(dòng)物免疫結(jié)果來(lái)看，抗OTA的抗體效價(jià)可達(dá)1∶51200，其IC50為9.467ng/mL，說(shuō)明本研究制備的抗體具有較高的效價(jià)和特異性。人工抗原的成功制備為后續(xù)制備OTA單克隆抗體奠定了基礎(chǔ)[14]。

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Preparation and Identification of Complete Antigen for Ochratoxin A

ZHOU Jing-ming，LI Chun-ge，QI Yan-hua，ZHANG Luo-sha，ZHANG Gai-ping,WANG Ai-ping

(SchoolofLifeScience,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan,450001,China)

Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin which has a wide range of toxicity to human and animals.In order to establish a rapid detection method of OTA in food and cereals,OTA was coupled with BSA and OVA using NHS method to prepare the immunogen OTA-BSA and coating antigen OTA-OVA.UV scanning spectrum and SDS-PAGE methods showed that BSA and OVA were successfully coupled with OTA.The coupling ratio of them were 7∶1and 4.5∶1,respectively.The polyclonal antibody was prepared by immunizing Balb/c mice with OTA-BSA,and the titer was up to 1∶51200by ELISA after coating ELISA plate with OTA-OVA.The result showed that the prepared immunogen OTA-BSA had a satisfied immunogenicity and provided a basis for the preparation of OTA monoclonal antibody.

ochratoxin A；NHS method；complete antigen；polyclonal antibody

2015-06-12

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014BAD13B05)；鄭州大學(xué)2015年度大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目

周景明(1972-)，男，河南南陽(yáng)人，副教授，博士，主要從事分子免疫學(xué)和免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究。*通訊作者

Q949.32

A

1007-5038(2016)01-0038-05