葡萄葉總黃酮的提取及體外抑菌活性研究

庫爾班江·巴拉提，周兆祥

(1.伊犁師范學院自治區(qū)教育廳普通高等學校重點實驗室，新疆伊寧 835000；2.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

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葡萄葉總黃酮的提取及體外抑菌活性研究

庫爾班江·巴拉提1，周兆祥2

(1.伊犁師范學院自治區(qū)教育廳普通高等學校重點實驗室，新疆伊寧 835000；2.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

為測定葡萄葉總黃酮體外抑菌活性，采用索氏提取器回流法提取葡萄葉總黃酮；采用K-B瓊脂擴散法分別用大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白假絲酵母菌、枯草芽胞桿菌做抑菌試驗；以抑菌效果最明顯的金黃色葡萄球菌為指示菌，以總黃酮的提取率及抑菌圈直徑為指標，單因素試驗篩選葡萄葉總黃酮最佳提取工藝，乙醇濃度750mL/L、料液比1∶40、提取溫度70℃、提取時間3.5h，在此提取條件下測得葡萄葉中總黃酮的平均提取率為7.16%；葡萄葉中總黃酮對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌具有較強的抑菌作用，其中對金黃色葡萄球菌抑菌活性最大，而對枯草芽胞桿菌的抑菌作用不太明顯。

葡萄葉總黃酮；提取工藝；體外抑菌活性

葡萄(Vitisvinifera)是葡萄科(Vitaceae)葡萄屬(Vitis)落葉藤本植物，是世界最古老的植物之一。 葡萄栽培在我國各地普遍存在，尤其是新疆地區(qū)有豐富的葡萄資源[1-3]。葡萄葉作為一種傳統(tǒng)民間中藥材，大量臨床研究表明其能夠有效地治療嘔吐、水腫、目赤以及小便不利等病癥。葡萄葉含有豐富的具有高生理活性的黃酮類、有機酸、鞣質類、低聚芪類等化合物。在土耳其、希臘及中東一帶，葡萄葉被普遍作為烹飪材料，以葡萄葉包米和絞肉的菜肴[3-6]。因而，葡萄葉資源有待進一步得到開發(fā)利用。

類黃酮(flavonoids)作為一種天然色素，廣泛存在于自然界中的水果、蔬菜和谷物等，其常與維生素C伴存，是植物自身代謝產(chǎn)生的次級代謝物，因多呈黃色而稱類黃酮。近年來隨著研究方法和技術的不斷改善和提高，發(fā)現(xiàn)了許多新的類黃酮種類和生理作用，推動著生物類黃酮的研究開發(fā)進入了全新的階段，掀起了生物類黃酮的研究和開發(fā)熱潮，其在醫(yī)藥、食品領域具有廣泛的應用前景[7-11]。本研究以乙醇為提取劑，提取葡萄葉總黃酮，單因素試驗優(yōu)化提取條件，并測定提取物的體外抗菌活性，為提取葡萄葉黃酮類化合物及其進一步開發(fā)和利用奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設備 UV2600PC紫外可見光光度計由上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠生產(chǎn)；SHA-B多功能恒溫振蕩器為江蘇金壇市正基儀器有限公司產(chǎn)品；HZQ-X100A恒溫振蕩培養(yǎng)箱為上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；BSP-250生化培養(yǎng)箱為上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠生產(chǎn)；SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵為上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)；FW80高速萬能粉碎機為北京市光明醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)。

1.1.2 原料和試劑 葡萄葉為2013年9月18日采自吐魯番市恰特喀勒鄉(xiāng)，自然晾干，于電熱恒溫鼓風干燥箱中40℃避光干燥、粉碎后，4℃冷藏備用；金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)、白假絲酵母(Canidiaalbicans)均購自北京萊耀生物科技有限公司；牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、土豆培養(yǎng)基等均購自杭州微生物試劑有限公司；蘆丁標準品(98%)購自國藥集團化學試劑有限公司(批號：100080-200707)；瓊脂粉、蛋白胨為天津市英博生化試劑有限公司產(chǎn)品；牛肉膏為北京奧博星生物技術有限責任公司產(chǎn)品；葡萄糖為天津市天新精細化工開發(fā)中心產(chǎn)品；無水乙醇(AR)為成都市科龍化工試劑廠產(chǎn)品。其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標準液的制備 準確稱取蘆丁標準品5mg置于50mL的容量瓶中，用600mL/L乙醇溶解定容，配成0.1mg/mL的蘆丁標準液，備用。

1.2.2 樣品溶液的制備 精密稱取葡萄葉粉末2g置于250mL的索氏提取器中，用750mL/L乙醇以1∶20(g/mL)的料液比在80℃下熱回流3.5h，提取液用750mL/L乙醇定容至100mL，備用。

1.2.3 最大吸收波長的確定 精密取0.1mg/mL的蘆丁標準液適量，加入到10mL容量瓶中，在波長350nm～650nm進行全波長掃描，結果顯示510nm處具有蘆丁最大吸收峰。因此，選擇510nm為測定波長。

1.2.4 標準曲線的繪制 分別精密吸取0.1mg/mL的蘆丁標準液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL，分別移至10mL容量瓶中(編號:0～5)，分別各加入0.3mL 50g/L亞硝酸鈉、靜置6min，再加入0.3mL 100g/L硝酸鋁、再靜置6min，最后加入4mL 40g/L氫氧化鈉，用600mL/L乙醇定容至刻度、放置15min。用UV2600PC紫外可見光光度計在波長510nm下測定系列標準溶液的吸光度。

1.2.5 樣品含量測定 精密取樣品提取液適量移至10mL容量瓶中，按1.2.4項下方法操作，在波長510nm下測定樣品提取液的吸光度。根據(jù)標準曲線，由下式計算樣品的含量和提取率：

式中：Y為黃酮類物質的濃度(mg/mL)；V為原提取液體積(mL)；W為樣品的質量(g)；a為稀釋倍數(shù)。

1.2.6 葡萄葉總黃酮的提取工藝優(yōu)化 以總黃酮含量及抑菌圈直徑為考察指標，分別考察乙醇濃度、提取時間、提取溫度及料液比對葡萄葉中總黃酮提取率及抑菌活性的影響[12-14]。

研究乙醇濃度對葡萄葉總黃酮提取率及抑菌活性的影響。精確稱取葡萄葉粉若干份(每份2.000g)，置于250mL索氏提取器中，按1∶40的料液比分別加入450、600、750、900mL/L的乙醇溶液，在70℃下提取3.5h。從中吸取提取液適量，按1.2.1方法，在510nm處測定提取液的吸光度，并根據(jù)回歸方程計算出總黃酮的質量和總黃酮的提取率。將剩余的提取液用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮回收乙醇，得到干燥的提取物浸膏，再用5mL的無菌水溶解，用4種提取液分別作抑菌試驗。

研究不同料液比對葡萄葉總黃酮提取率及抑菌活性的影響。精確稱取葡萄葉粉若干份(每份2.000g)，分別按1∶20、1∶30、1∶40和1∶50料液比，加入750mL/L乙醇在70℃下提取3.5h。考察不同時間比對葡萄葉總黃酮提取率及抑菌活性的影響。精確稱取葡萄葉粉若干份(每份2.000g)，按1∶40的料液比，加入750mL/L乙醇在70℃下分別提取1.5、2.5、3.5h和4.5h；考察提取溫度比對葡萄葉總黃酮提取率及抑菌活性的影響精確稱取葡萄葉粉若干份(每份2.000g)，按1∶40的料液比，加入750mL/L乙醇，在溫度分別為60、70、80、90℃下提取3.5h；其余同上。

1.2.7 體外抑菌活性的測定

1.2.7.1 供試菌的活化 用750mL/L的酒精棉擦凈安瓿管，將安瓿管頂端用火焰加熱，在加熱的安瓿管頂端滴無菌水至致使頂端玻璃開裂，用鑷子敲去已開裂的安瓿管的頂端。用無菌移液器吸取0.3mL～0.4mL液體培養(yǎng)基，滴入安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，溶解凍干菌體呈懸浮狀，取約0.2mL菌體懸浮液，均勻涂抹于瓊脂斜面培養(yǎng)基上，剩余的菌液移入到指定的液體培養(yǎng)基中，然后將培養(yǎng)基置于適宜的溫度下培養(yǎng)。

1.2.7.2 菌懸液的制備 將活化好的菌種挑取單個菌落分別接種于盛有25mL液體培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，封口，35℃～37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)18h～24h，真菌在29℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)結束后，用移液槍吸取1mL菌體置于裝有9mL無菌生理鹽水的試管內(nèi)，搖勻，制成菌懸液(106CFU/mL～108CFU/mL)，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7.3 培養(yǎng)基的制備 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，瓊脂15g～20g，NaCl5g用蒸餾水定容至1000mL，pH調至7.0～7.2，在121℃滅菌30min，冷卻至約50℃適量倒入平板，供培養(yǎng)細菌。

馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g～20g，馬鈴薯去皮，切成塊煮沸30min，然后用紗布過濾，再加糖及瓊脂，溶化后補足水至1000mL，121℃滅菌30min，冷卻至約50℃適量倒入平板，供培養(yǎng)真菌。

1.2.7.4 無菌濾紙片的制備 將干凈的濾紙片打成直徑為0.9cm的小圓紙片，置于121℃的烘箱中30min，干熱滅菌、冷卻、備用。

1.2.7.5 抑菌方法 細菌的抑菌方法(濾紙片法):將培養(yǎng)好的細菌菌懸液吸取10μL，在無菌條件下，加入到裝有牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用無菌三角玻璃涂布棒涂抹均勻，按無菌操作將預先滅菌烘干并浸蘸葡萄葉乙醇提取液的6.0mm濾紙片平貼在含菌培養(yǎng)基上，在每只含菌平板上間隔一定的距離貼3片，呈三角狀排列，其中一片蘸無菌水濾紙片做空白對照，共重復3次，結果取平均值。放入培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24h后觀察并測量抑菌圈直徑。

真菌的抑菌方法(濾紙片法)：將培養(yǎng)好的真菌懸液吸取10μL，在無菌條件下，加入到裝有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用涂布棒涂抹均勻，在每個平板中用鑷子加入2個不同條件下葡萄葉乙醇提取液中浸泡過的濾紙片，1個浸有無菌水的濾紙片作為空白對照，3次重復，放入培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)24h后觀察并測量抑菌圈直徑。

2 結果

2.1 標準曲線的繪制結果

以蘆丁標準溶液濃度對應吸光度值進行線性回歸，其回歸方程為:y=0.3295x+0.0012(R2=0.995)。結果表明，蘆丁標準溶液的濃度在0.4mg/mL～2.0mg/mL的范圍內(nèi)線性關系良好(圖1)。

圖1 蘆丁標準曲線
Fig.1Standardcurveforrutin

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 乙醇濃度對總黃酮提取率及抑菌效果的影響結果 不同濃度乙醇對葡萄葉總黃酮的提取率不同，如表1所示。用450mL/L乙醇所得其提取率最低，提高乙醇濃度至750mL/L時，提取率最高為11.17%；當乙醇濃度高于600mL/L所得的葡萄葉總黃酮提取率并無差異顯著性。不同濃度乙醇提取所得黃酮類物質的抑菌效果不同(表1)。乙醇濃度為450mL/L時，抑菌圈最??；750mL/L乙醇的抑菌圈最大，但與600mL/L乙醇的抑菌效果無差異顯著性；但900mL/L乙醇提取的黃酮類物質抑菌效果顯著降低。

表1 乙醇濃度對黃酮提取率及其金黃色葡萄球菌抑菌圈大小的影響結果Table1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate offlavonoids and inhibition zone diameter to Staphylococcus aureus

2.2.2 料液比對黃酮提取率及抑菌效果的影響結果 不同料液比對葡萄葉總黃酮的提取率不同，如表2所示，用料液比為1∶20提取率最低，提高料液比至1∶40，提取率最高為6.67%；當料液比高于1∶40所得的葡萄葉總黃酮提取率并無顯著性差異。不同料液比所得黃酮類物質的抑菌效果不同(表2)。料液比為1∶20，抑菌圈最??；1∶40的抑菌圈最大，但與1∶50的抑菌效果無顯著性差異。

表2 料液比對總黃酮提取率及其金黃色葡萄球菌抑菌圈大小的影響Table 2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of totalflavonoids and inhibition zone size to Staphylococcus aureus

2.2.3 提取時間對黃酮提取率及抑菌效果的影響 不同提取時間對葡萄葉總黃酮的提取率不同，如表3所示，提取時間為4.5h提取率最低，縮短提取時間至3.5h，提取率最高為7.27%；當提取時間在1.5h～3.5h間所得的葡萄葉總黃酮提取率并無差異顯著性。不同提取時間所得黃酮類物質的抑菌效果不同(表3)。提取時間為4.5h，抑菌圈最小；3.5h時的抑菌圈最大，且與1.5h和2.5h所得抑菌效果差異顯著。

2.2.4 提取溫度對黃酮提取率及抑菌效果的影響結果 不同提取溫度對葡萄葉總黃酮的提取率不同，如表4所示，提取溫度為80℃，提取率最低，提高溫度至90℃，提取率最高為8.33%，且二者間差異顯著。不同提取溫度所得黃酮類物質的抑菌效果不同，70℃所得總黃酮類物質抑菌效果最好，為8.89mm；80℃抑菌效果最差為4.97mm，且二者差異顯著。以抑菌效果為依據(jù)判斷提取溫度為70℃時效果最佳。

表3 提取時間對總黃酮提取率及其金黃色葡萄球菌抑菌圈大小的影響Table 3 Effect of extraction time on the extraction rate of totalflavonoids and inhibition zone to Staphylococcus aureus

表4 溫度對黃酮提取率的影響及其金黃色葡萄球菌抑菌圈大小的影響Table 4 Effect of extraction temperature on extraction rate offlavonoids and inhibition zone to Staphylococcus aureus

2.3 最佳提取條件下提取黃酮的抑菌試驗

葡萄葉的最佳提取條件(乙醇濃度900mL/L，提取溫度70℃，料液比為1∶40，提取時間為3.5h)，并在此條件下獲得葡萄葉乙醇提取物，在最佳的提取工藝條件下測得葡萄葉中總黃酮的平均含量為71.6mg/g。

以大腸埃希菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、白假絲酵母菌(Candida albicans)為供試菌，采用濾紙片法，嚴格按照無菌操作進行抑菌試驗，通過3次重復試驗，測得4種菌的抑菌圈直徑結果見圖2。

在最佳提取條件下，葡萄葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌具有較顯著地抑菌作用，而對枯草芽胞桿菌的抑菌作用不顯著。

3 討論

本文在預試驗中分別采用乙醚、乙酸乙酯、石油醚、丙酮、正丁醇、乙醇等對葡萄葉總黃酮進行提出并各提取物進行了抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)采用乙醇提取時，總黃酮的提取率及抑菌效果很好，因此本試驗選用乙醇作為提取溶劑。隨著乙醇濃度的提高，脂溶性物質溶出增加，而脂溶性物質對吸光度的測定有干擾，使測量結果偏高，并且不利于黃酮類物質的進一步提純。當提取時間小于3.5h時黃酮的提取率較低，抑菌效果不明顯，可能是由于加熱時間短，葡萄葉內(nèi)的抑菌活性物質未充分浸提所致。

A.大腸埃希菌；B.金黃色葡萄球菌；C.枯草芽胞桿菌；D.白假絲酵母菌
A.Escherichia coli；B.Staphylococcus aureus；C.Bacillus subtilis；D.Candida albicans

圖2 最佳條件下提取的黃酮抑菌效果對比
Fig.2Comparisonofantibacterialeffectoftotalflavonoidsextractedunderoptimumconditions

提取時間在3.5h總黃酮提取率能夠達到最佳的提取的效果，隨著提取時間的繼續(xù)增加，總黃酮的提取含量反而降低，其可能是因為提取時間太長，提取液中部分乙醇揮發(fā)而導致沸點逐漸增大，往往會破壞某些黃酮類化合物，因而從提取工藝角度出發(fā)，我們選擇3.5h為最佳提取時間。

溫度對總黃酮的提取率及其抑菌效果作用不同。隨提取溫度的升高，總黃酮提取率波動較大，其可能是由于黃酮在乙醇中的溶解度隨著溫度的升高而增大，同時隨著溫度升高，提取液黏度減少，擴散系數(shù)增加，促使提取速度加快。但溫度過高，一方面提取液活性成分易被破壞，雜質的溶出量增加，給后續(xù)操作帶來不便；另一方面造成提取溶劑的大量損失，成本費用增大。綜合各方面因素，浸提溫度以70℃為宜。在提取溫度為70℃時，抑菌效果最明顯，平均抑菌圈直徑為8.89mm。在60℃～70℃之間，隨著浸提溫度的升高葡萄葉乙醇提取液的抑菌活性逐漸增大，這可能是因為隨著溫度的升高，葡萄葉中抑菌活性物質的提取除了具有溶解效應以外，還有熱效應，在一定溫度下有利于其溶解，使提取效率得到提高，從而具有更好的抑菌效果。當浸提溫度高于70℃后，其抑菌活性又逐漸減小，可能是當溫度超過70℃時，會造成葡萄葉中抑菌物質在過高溫度下，活性下降或失去活性。

葡萄葉總黃酮的最佳提取工藝為：乙醇濃度750mL/L，料液比1∶40，提取溫度70℃，提取時間3.5h，在此提取條件下測得葡萄葉中總黃酮的平均提取率為7.16%；葡萄葉中總黃酮對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌具有較強的抑菌作用，其中對金黃色葡萄球菌抑菌活性最大，而對枯草芽胞桿菌的抑菌作用不太明顯。葡萄葉中總黃酮對4種菌種抑菌活性順序為金黃色葡萄球菌>大腸埃希菌>白假絲酵母菌>枯草芽胞桿菌。

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Extraction and Antibacterial Activities of Total Flavonoids Extracted from Grape Leaves

Korbanjhon BRAD1,ZHOU Zhao-xiang2

(1.KeyLaboratoryatUniversitiesofEducationDepartmentofXinjiangUygurAutonomousRegion，YiliNormalUniversity，Yining，Xinjiang，835000，China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity，Yangling，Shaanxi，712100，China)

In order to optimize extraction process of total flavonoids from grape leaves and study their antibacterial activities,total flavonoids were prepared by Soxhlet extraction.The total flavonoids of grape leaves was determined by aluminum nitrate chromogenic spectrophotometry.The antibacterial activity was determined by K-B and agar diffusion method.The antibacterial activity was tested toEscherichiacoli,Staphylococcusaureus,Candidaalbicans,Bacillussubtilis.Staphylococcusaureuswas used to indicate the antibacterial effect of extracted flavonoids by different methods.The extraction rate of total flavonoids and the diameter of inhibition zone were optimized based on the single-factor test.The optimum extraction conditions were extracted with 750mL/L ethanol at the ratio of material to liquid 1∶40at 70℃ for 3.5h.The average extraction rate of total flavonoids in grape leaves at the optimum extraction conditions was 7.16%.Total flavonoids of grape leaves had a significant antibacterial effect onStaphylococcusaureusandEscherichiacoli,but not onBacillussubtilis.

total flavonoids of grape leaf;extracting technology;antibacterial activity

2015-06-12

新疆維吾爾自治區(qū)教育廳普通高等學校重點實驗室開放項目(2013YSHXYB06)

庫爾班江·巴拉提(1962-)，男(維吾爾族)，新疆伊寧人，教授，主要從事天然產(chǎn)物與抗菌藥物研究。

S853.75

A

1007-5038(2016)01-0058-05