氮素形態(tài)及配比對5個種源菘藍(lán)的生物堿類成分和多糖的影響

呂婷婷，唐曉清，施晟璐，楊 月，王 雨，王康才

(1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥研究所， 南京 210095; 2 上海上藥華宇藥業(yè)有限公司，上海 200002)

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氮素形態(tài)及配比對5個種源菘藍(lán)的生物堿類成分和多糖的影響

呂婷婷1,2，唐曉清1*，施晟璐1，楊 月1，王 雨1，王康才1

(1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥研究所， 南京 210095; 2 上海上藥華宇藥業(yè)有限公司，上海 200002)

以5份不同種源的菘藍(lán)為材料，采用田間小區(qū)試驗，設(shè)置不施氮(CK)、硝態(tài)氮(NO3--N)、銨態(tài)氮(NH4+-N)、NH4+-N/NO3--N=75/25、NH4+-N/NO3--N=50/50、NH4+-N/NO3--N=25/75和酰胺態(tài)氮等7個處理，分析比較了不同種源植株的靛藍(lán)、靛玉紅和總生物堿含量、(R,S)-告依春及多糖含量等指標(biāo)的差異，為菘藍(lán)栽培生產(chǎn)中氮素的高效利用提供理論參考。結(jié)果表明：氮素處理有利于提高山西運城菘藍(lán)和陜西商洛菘藍(lán)葉內(nèi)靛藍(lán)含量，以及安徽亳州菘藍(lán)和陜西商洛菘藍(lán)葉內(nèi)的總生物堿含量；NH4+-N/NO3--N=50/50處理對山西運城菘藍(lán)，以及酰胺態(tài)氮處理對山西運城菘藍(lán)和陜西商洛菘藍(lán)葉內(nèi)生物堿類成分的積累均有促進(jìn)作用；與對照相比，氮素處理亦能有效地提高甘肅張掖菘藍(lán)和陜西商洛菘藍(lán)根內(nèi)的(R,S)-告依春及安徽亳州菘藍(lán)根內(nèi)的多糖含量；安徽阜陽菘藍(lán)(R,S)-告依春含量在任一氮處理下均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他種質(zhì)菘藍(lán)。研究表明,不同種源菘藍(lán)對氮素處理的響應(yīng)存在較大的差異，建議生產(chǎn)中綜合考慮菘藍(lán)的來源和需肥規(guī)律，采用經(jīng)濟(jì)有效的施氮組合，以提高其活性成分含量。

菘藍(lán)；氮素形態(tài)和配比；生物堿；多糖

菘藍(lán)(IsatisindigoticaFort.)為十字花科植物，其根、葉入藥分別稱為板藍(lán)根和大青葉。大青葉主要含靛藍(lán)、靛玉紅[1]等吲哚生物堿類成分，具有抗菌抗炎[2-3]、抗病毒[4]和增強機(jī)體免疫力等功能。板藍(lán)根多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用[5-6]，也是評價板藍(lán)根質(zhì)量的指標(biāo)之一。隨著菘藍(lán)研究的不斷深入和用藥量的增加，各地廣泛引種栽培，提高板藍(lán)根和大青葉的品質(zhì)直接關(guān)系到臨床用藥的質(zhì)量，也成為在栽培實踐中人們廣泛關(guān)注的焦點。氮素是作物產(chǎn)量和品質(zhì)形成的重要影響因子[7]，自然界中可被植物直接同化利用的主要氮素形態(tài)為無機(jī)氮源銨態(tài)氮(NH4+-N)和硝態(tài)氮(NO3--N)，酰胺態(tài)氮和氨基酸態(tài)氮等有機(jī)氮少量被利用[8]。目前，關(guān)于不同氮素形態(tài)對作物生長發(fā)育、品質(zhì)和產(chǎn)量的影響已有大量報道。如在總氮水平為15 mmol·L-1時，適量增加硝態(tài)氮比例，有利于促進(jìn)夏枯草苗期生長、提高干物質(zhì)積累和凈光合速率[9]；銨、硝態(tài)氮復(fù)合施用對半夏植株氮代謝指標(biāo)、產(chǎn)量和主要化學(xué)成分影響顯著[10]；川芎中總生物堿含量隨硝態(tài)氮比例的升高而增加[11]；施用1.0%～1.5%的純脲有利于菘藍(lán)營養(yǎng)前期生物量的積累[12]。尤其是肖云華等的研究表明不同氮素形態(tài)和濃度對大青葉生物量與生物堿類成分含量的影響存在較大差異，酰胺態(tài)氮對大青葉生物量的影響最大，銨態(tài)氮對靛玉紅影響更大等[13]。由此可見，綜合考慮氮素營養(yǎng)對菘藍(lán)生長量和活性成分積累動態(tài)的影響有重要意義。前期筆者已就氮素不同形態(tài)及配比對不同居群菘藍(lán)生物學(xué)特性的影響進(jìn)行了比較分析[14]，本研究采用田間小區(qū)試驗，考察了不同種源菘藍(lán)葉內(nèi)的靛藍(lán)、靛玉紅和總生物堿含量以及根內(nèi)的(R,S)-告依春和多糖含量對氮素營養(yǎng)的響應(yīng)特征，以探究適合不同種源菘藍(lán)活性成分積累的最佳氮素形態(tài)，以提高氮肥利用率，為選擇合適引種材料和合理施氮提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗材料為來自于安徽亳州(S1)、甘肅張掖(S2)、安徽阜陽(S3)、山西運城(S4)和陜西商洛(S5)4個種源的5份菘藍(lán)，經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥研究所王康才教授鑒定為十字花科菘藍(lán)(IsatisindigoticaFort.)的角果(生產(chǎn)中稱種子)。試驗地設(shè)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦園藝試驗站。試驗田為壤土，肥力中等(0～30 cm土層有機(jī)質(zhì)0.907 g·kg-1、全氮0.15%、堿解氮136 mg·kg-1、有效磷19.5 mg·kg-1、速效鉀0.16 mg·kg-1、pH 6.35)。小區(qū)間距40 cm，溝深30 cm，四周設(shè)1 m保護(hù)行，每個小區(qū)面積為3.75 m2(1.5 m×2.5 m)，于2013年5月21日進(jìn)行條播，行株距25 cm×7 cm，共設(shè)105個小區(qū)。

試驗采用3種不同氮素形態(tài)[銨態(tài)氮(NH4+-N)、硝態(tài)氮(NO3--N)和酰胺態(tài)氮]組成若干配比的單因素完全隨機(jī)處理，在磷、鉀肥用量相同的基礎(chǔ)上，施氮總量一致(氮肥用量為675 kg·hm-2[15])的條件下，設(shè)計7個不同水平的施氮處理(表1)，每處理設(shè)3次重復(fù)。其中，對照(CK)不施氮肥，只施P、K肥；其余處理正常施P、K肥，氮肥分2次追施，每次用量相同，隨機(jī)區(qū)組排列，常規(guī)田間管理。第1次和第2次追肥分別于7月下旬和9月下旬進(jìn)行，在行間挖淺溝澆入處理液，然后覆土。各處理磷、鉀肥用量相同，按KH2PO4150 kg·hm-2水平施用。處理液中，銨態(tài)氮由硫酸銨(NH4)2SO4提供，硝態(tài)氮由硝酸鉀KNO3提供，酰胺態(tài)氮由純脲CO(NH2)2提供。所有處理液中加入硝化抑制劑雙氰胺(DCD)，用量為處理液中純氮含量的0.4%，磷、鉀肥由磷酸二氫鉀(KH2PO4)提供，所用試劑均為分析純。

表1 各處理組合中3種氮素形態(tài)的施用量比例

1.2 測定項目及方法

菘藍(lán)生長5個月后采收，每個小區(qū)隨機(jī)采取10株，清洗干凈，分地上與地下部分置于干燥箱內(nèi)105 ℃殺青15 min，后調(diào)至60 ℃繼續(xù)烘干至恒重，10株混合粉碎，過60目篩備用，每個處理3次重復(fù)。

1.2.1 靛藍(lán)和靛玉紅含量 (1)對照品溶液制備： 準(zhǔn)確稱取靛藍(lán)和靛玉紅各1.0 mg于50 mL容量瓶中，分別用甲醇溶解并定容至刻度，配制成20 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品母液。微孔濾膜濾過，備用。臨用前，用甲醇溶液采用逐級稀釋法將標(biāo)準(zhǔn)品母液配制成一系列質(zhì)量濃度的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別吸取靛藍(lán)、靛玉紅對照品溶液5 μL進(jìn)樣，用UPLC進(jìn)行測定。以峰面積值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程：靛藍(lán)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.117 9x-0.037 3(r=0.999 7，n=3)，靛玉紅的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.184 4x-0.035 1 (r=0.999 9，n=3)，分離效果良好。(2)供試品溶液制備：方法參照《中國藥典》(2015版)高效液相色譜法測定菘藍(lán)葉片中靛藍(lán)、靛玉紅的含量[1]。(3)色譜條件：采用Acclaim RSLC120 C18 (3.0×100 mm, 2.2 μm)分析柱，流動相為甲醇-水(72∶28)，流速為400 mL·min-1，柱溫為30 ℃，紫外線檢測波長為289 nm，進(jìn)樣體積5 μL，外標(biāo)法計算。在該色譜條件下，靛藍(lán)、靛玉紅與菘藍(lán)葉樣品的UPLC色譜圖見圖1。

A.靛藍(lán)對照品；B.靛玉紅對照品；C.菘藍(lán)葉供試品；D.(R,S)-告依春對照品；E.菘藍(lán)根供試品圖1 靛藍(lán)、靛玉紅、(R,S)-告依春標(biāo)準(zhǔn)品和菘藍(lán)葉、根樣品的UPLC圖A.Reference substance of indigo；B.Reference substance of indirubin；C.Samples of I. indigotica leaves；D.Reference substance of (R,S)-epigoitrin；E.Samples of I. indigotica rootsFig.1 UPLC of indigo, indirubin, (R,S)-epigoitrin and samples of I. indigotica leaves and roots

1.2.2 (R,S)-告依春含量 (1)對照品溶液制備：準(zhǔn)確稱取(R,S)-告依春1.0 mg于25 mL容量瓶中，分別用甲醇溶解并定容至刻度，配制成40 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品母液。微孔濾膜濾過，備用。臨用前，用甲醇溶液采用逐級稀釋法將標(biāo)準(zhǔn)品母液配制成濃度分別為1、2.5、5、10、20、40 μg·mL-1的(R,S)-告依春標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣5 μL，用UPLC進(jìn)行測定，根據(jù)測得的峰面積A對應(yīng)的進(jìn)樣量C進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程：y=0.453 4x-0.897 6(r=0.999 0，n=3)。(2)供試品溶液制備:方法參照《中國藥典》(2015版)高效液相色譜法測定樣品根中(R,S)-告依春的含量[16]。(3)色譜條件:采用Acclaim RSLC120 C18 (3.0×100 mm, 2.2 μm)分析柱，流動相為甲醇-0.02%磷酸溶液(7∶93)，流速為0.400 mL·min-1，柱溫為30 ℃，紫外線檢測波長為245 nm，進(jìn)樣體積為5 μL，外標(biāo)法計算。在該色譜條件下，(R,S)-告依春的UPLC及菘藍(lán)根的UPLC圖見圖1。

1.2.3 多糖含量 參照《植物生理生化實驗原理和技術(shù)》(第2版)苯酚-濃硫酸法測定多糖含量[17]。

1.2.4 總生物堿含量 (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱取靛玉紅2.0 mg，用氯仿溶解并定容至刻度，配制成20 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品母液，備用。臨用前，用氯仿溶液配制成濃度分別為0、0.8、1.6、3.2、4、6、8、16 μg·mL-1的靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液各10 mL于125 mL分液漏斗中(另取10 mL氯仿溶液作為空白對照液)，平行3次，依次加入pH為5.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖5 mL，0.1%溴百里酚藍(lán)溶液1 mL，振搖1 min，靜置1 h后，精密分取氯仿層1 mL于5 mL容量瓶中，氯仿定容，在289 nm波長處進(jìn)行吸光度測定。以吸光值為縱坐標(biāo)，靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)樣品的制備與測定：精密稱取干燥至恒重的菘藍(lán)葉細(xì)粉0.1 g，加入濃氨水0.5 mL，氯仿8 mL，冷浸3 h后，超聲提取1 h，過濾，殘渣用10 mL分3次洗滌，合并濾液，80 ℃下回收氯仿至干，殘留物用10 mL氯仿分次溶解，即得樣品供試液。后參照1.2.4中“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”中的方法測定樣品供試液的吸光度值，據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總生物堿含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2007和SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析，以Duncan’s新復(fù)級差法比較不同處理間的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施氮處理對菘藍(lán)葉中活性成分的影響

2.1.1 靛藍(lán)含量 由表2可以看出，同一種源內(nèi)相比較，施氮素處理均使安徽亳州(S1)、甘肅張掖(S2)和安徽阜陽(S3)菘藍(lán)葉內(nèi)靛藍(lán)含量比不施氮肥的對照(CK)不同程度降低，且S1的各個處理、S2的T4處理(NH4+-N/NO3--N=50/50)和T6處理(全酰胺態(tài)氮)、S3的T2處理(全NH4+-N)降幅均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。其中，S1和S2葉內(nèi)的靛藍(lán)含量在T6處理下均達(dá)到最小值，S3則在T2處理下達(dá)到最小值，此時S1～S3分別比相應(yīng)CK顯著降低43.1%、37.8%和45.6%。山西運城菘藍(lán)(S4)葉內(nèi)的靛藍(lán)含量在T2～T6施氮處理下均不同程度高于相應(yīng)CK，并在T6處理達(dá)到最大值，但各處理間及其與CK間均無顯著性差異(P>0.05)。陜西商洛菘藍(lán)(S5)葉內(nèi)靛藍(lán)含量在T3～T6處理下均不同程度高于相應(yīng)CK，但僅T6處理達(dá)到顯著水平，增幅為25.7%。在同一施氮處理內(nèi)相比較，T1、T3(NH4+-N/NO3--N=75/25)和T5(NH4+-N/NO3--N =25/75)處理下，不同種源菘藍(lán)葉內(nèi)的靛藍(lán)含量差異性均不顯著，說明此氮素處理水平與菘藍(lán)品種靛藍(lán)含量相關(guān)性不大；而在CK、T2、T4、T6處理下，各種質(zhì)葉內(nèi)的靛藍(lán)含量存在顯著差異；CK、T1處理下S1種質(zhì)具最大值，T2處理下S4種質(zhì)具最大值，T3～T6處理下均以S5葉內(nèi)靛藍(lán)含量最大。以上結(jié)果說明各種源菘藍(lán)葉內(nèi)靛藍(lán)含量對施氮處理的響應(yīng)不盡相同，各施氮處理的效應(yīng)也有差異，安徽亳州、甘肅張掖和安徽阜陽種源靛藍(lán)含量受到不同程度抑制，而山西運城和陜西商洛種源菘藍(lán)得到一定程度的促進(jìn)，且陜西商洛菘藍(lán)在全酰胺態(tài)氮處理下的增益效果最好。

表2 不同施氮處理下菘藍(lán)葉內(nèi)的靛藍(lán)、靛玉紅和總生物堿含量(χ±SE，n=3)

注：S1. 安徽毫州；S2. 甘肅張掖；S3. 安徽阜陽；S4. 山西運城；S5. 陜西商洛；同列數(shù)值后不同小寫字母表示產(chǎn)地間差異達(dá)到5%顯著水平；同行數(shù)值后不同大寫字母表示處理間差異達(dá)到5%顯著水平，下同

Note:S1. Anhui Bozhou; S2. Gansu Zhangye; S3. Anhui Fuyang; S4. Shanxi Yuncheng; S5. Shaanxi Shangluo; The different normal letters within rows mean significant differences among germplasm at 0.05 level. The different capital letters within lines mean significant differences among treatments at 0.05 level. The same as follows

2.1.2 靛玉紅含量 與氮素處理對菘藍(lán)葉內(nèi)靛藍(lán)含量影響的情況類似，菘藍(lán)葉內(nèi)靛玉紅的含量均未見明顯的增加效應(yīng)(表2)。其中，S2在任一氮素處理下的靛玉紅含量均降低，最小值與對照值相比下降67.86%；S3僅在T3處理下，葉內(nèi)的靛玉紅含量有提高，且增長率為8.16%；T3、T4和T6處理均提高了S1葉內(nèi)的靛玉紅含量，且T3處理對其促進(jìn)作用最大，提高了63.33%，顯著高于CK(P<0.05)；另外，S3～S5均在T2處理下有最小值，下降率分別為57.14%、54.55%和38.10%，均與CK存在顯著性差異(P<0.05)。不同種源菘藍(lán)葉內(nèi)的靛玉紅含量對同一氮素處理的響應(yīng)存在差異：T6處理對S1、S4和S5葉內(nèi)的靛玉紅含量的提高有明顯的促進(jìn)作用，且對S5影響最大；T1和T2處理下，S2和S4均存在最大值和最小值，但都低于對照。由此說明氮素處理對提高菘藍(lán)葉內(nèi)靛玉紅含量的促進(jìn)作用不明顯，僅安徽亳州菘藍(lán)和安徽阜陽菘藍(lán)在NH4+-N/NO3--N=75/25處理下以及安徽亳州、山西運城和陜西商洛菘藍(lán)在全酰胺態(tài)氮處理下有提高。

2.1.3 總生物堿含量 菘藍(lán)葉內(nèi)的總生物堿含量分析顯示：氮素處理能促進(jìn)S1、S3和S5葉內(nèi)的總生物堿含量的積累，且S1和S5在各處理間表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律，升降趨勢一致(表2)。S2和S4均在T2和T6處理下，其葉內(nèi)總生物堿含量的提高受到抑制，其中，T2處理的S2和S4以及T6處理的S4葉內(nèi)的總生物堿含量均顯著低于相應(yīng)的對照(P<0.05)。T4處理下，S5葉內(nèi)的總生物堿含量達(dá)到最大，增長率為19.82%，且顯著高于對照。此外，不同種源菘藍(lán)相比較，S2在CK、T3和T4處理下有最大值，分別為1.330%、1.405%和1.151%，且與其余4個種源的菘藍(lán)植株間存在顯著性差異(P<0.05)。與此類似，S1葉內(nèi)的總生物堿含量在T1和T2處理下均略高于其它種質(zhì)的菘藍(lán)；S3在T6處理下，其葉內(nèi)的總生物堿含量高于其余種質(zhì)菘藍(lán)?？赏茰y為氮素處理有利于安徽亳州、安徽阜陽和陜西商洛菘藍(lán)葉內(nèi)總生物堿含量的提高，且全硝態(tài)氮處理對安徽亳州、全酰胺態(tài)氮處理對安徽阜陽和NH4+-N/NO3--N=50/50處理對陜西商洛菘藍(lán)葉內(nèi)總生物堿含量積累的促進(jìn)作用較好。

2.2 不同施氮處理對菘藍(lán)根中活性成分的影響

2.2.1 (R,S)-告依春含量 表3顯示，S1～S3和S5菘藍(lán)根中(R,S)-告依春含量均在T4處理下有最大值，而S4菘藍(lán)則在T5處理下有最大值并顯著高于其余處理。S5根內(nèi)的(R,S)-告依春含量(0.412 0～0.544 4 mg·g-1)在各氮素處理下均顯著高于對照，增幅為43.65%～89.82%(P<0.05)；S2菘藍(lán)根中(R,S)-告依春含量在除T5的施氮處理下均得到提高(2.10%～132.40%)，且在T3、T4處理下達(dá)到顯著水平；S3根內(nèi)的(R,S)-告依春含量除T4處理外，均不同程度低于對照，降幅為19.11%～76.61%，且均達(dá)到顯著水平(P<0.05)；S4根內(nèi)的(R,S)-告依春含量在T3～T5處理下均得到不同程度提高(3.87%～69.33%)，且在T3、T5處理下顯著高于對照；S1根內(nèi)的(R,S)-告依春含量僅在T4處理下比對照有提高，增長率為35.69%(P<0.05)。說明氮素處理有利于甘肅張掖菘藍(lán)(S2)和陜西商洛菘藍(lán)(S5)根內(nèi)(R,S)-告依春含量的積累，且在NH4+-N/NO3--N=50/50處理(T4)下效果明顯，而對安徽亳州(S1)菘藍(lán)根內(nèi)的(R,S)-告依春含量的提高的促進(jìn)作用很有限。同時，比較不同種質(zhì)間分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各種源菘藍(lán)根內(nèi)的(R,S)-告依春含量在不施氮肥(CK)和各施氮處理下均表現(xiàn)出顯著差異；S3菘藍(lán)根內(nèi)的(R,S)-告依春含量除在T3處理下顯著低于S2外，在其余氮素處理水平下均遠(yuǎn)高于其他種質(zhì)菘藍(lán)，并在T4處理下達(dá)最高值(2.226 mg·g-1)；S2菘藍(lán)根內(nèi)的(R,S)-告依春含量在T3處理下顯著高于其余種質(zhì)；S1根內(nèi)的(R,S)-告依春含量在T1～T6處理下均低于相同氮素處理下的其余種質(zhì)，并在T3、T5和T6處理中與其他種源存有顯著性差異(P<0.05)。以上結(jié)果說明，安徽阜陽菘藍(lán)(R,S)-告依春含量在任一氮處理下均明顯高于其他種質(zhì)菘藍(lán)，而安徽亳州菘藍(lán)卻在各處理下均具有最低的含量。

表3 不同施氮處理下菘藍(lán)根中的(R，S)-告依春和多糖含量(χ±SE，n=3)

2.2.2 多糖含量 從表3還可知，S1菘藍(lán)根內(nèi)的多糖含量在除T4外處理下均不同程度地高于對照(0.04%～51.06%)，且除T5處理外促進(jìn)作用均達(dá)到顯著水平(P<0.05)；S2根內(nèi)的多糖含量僅在T5和T6處理下比對照有所增加，且T5處理顯著高于對照23.037%；S3和S4處理的表現(xiàn)與S2相似，部分處理多糖含量高于對照，另一部分則低于對照；S5菘藍(lán)根內(nèi)的多糖含量各氮素處理水平下均顯著低于對照(P<0.05)，降幅8.54%～33.79%?？傮w上，各種源菘藍(lán)根內(nèi)的多糖含量在T3、T4處理下大多受到抑制，而在T6處理下大多得到促進(jìn)。不同種源間比較而言，S1根內(nèi)的多糖含量T1、T2和T6處理具有最大值，且T1、T6顯著高于其他種源(P<0.05)；S2和S4根內(nèi)多糖含量則分別在T5和T4處理下具有最大值，S5根內(nèi)的多糖含量在CK和T3處理下亦有最大值，它們與相同處理下的其他種源均差異顯著。這說明氮素處理不利于陜西商洛菘藍(lán)多糖含量的提高，而利于安徽亳州菘藍(lán)多糖含量的提高；施用全酰胺態(tài)氮均有利于除陜西商洛外其他種源菘藍(lán)多糖含量的提高。

3 討 論

3.1 氮營養(yǎng)對菘藍(lán)葉內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的影響

氮素營養(yǎng)是影響植物生長和次生代謝過程的重要環(huán)境因子之一[18]。自然界中植物吸收氮素營養(yǎng)的主要形式為銨態(tài)氮(NH4+-N)和硝態(tài)氮(NO3--N)，且主要參與植物體內(nèi)陰陽離子吸收平衡、根際pH值及能量代謝等過程。Kainulainen[19]認(rèn)為氮素水平能影響氮素向次生代謝產(chǎn)物的分配，主要取決于植物的發(fā)育狀態(tài)及產(chǎn)物的生物合成途徑、合成成本和產(chǎn)物的貯藏等，即可驗證氮素對碳在生長與防御以及不同次生代謝物合成途徑之間的分配有無影響。菘藍(lán)體內(nèi)主要活性成分為靛藍(lán)和靛玉紅等生物堿類物質(zhì)，均屬于雜環(huán)類吲哚衍生物[20]，且在生物體內(nèi)通過苯丙烷代謝途徑合成[21]，該類物質(zhì)的合成與積累與氮素形態(tài)是密切相關(guān)的[22]。大量研究結(jié)果表明，NH4+-N和NO3--N聯(lián)合施用更有利于植物生長[23-25]。本研究發(fā)現(xiàn)氮素營養(yǎng)對植物次生代謝產(chǎn)物的影響具有不同種源的差異性，主要表現(xiàn)在氮素處理僅對山西運城菘藍(lán)和陜西商洛菘藍(lán)葉內(nèi)的靛藍(lán)含量具有增加效應(yīng)；安徽亳州、安徽阜陽和陜西商洛菘藍(lán)葉內(nèi)的總生物堿含量在氮處理下提高較多；但5份種源菘藍(lán)葉內(nèi)的靛玉紅含量與各氮素處理間無明顯相關(guān)性，這可能與受環(huán)境影響較大有關(guān)。除此之外，山西運城菘藍(lán)在NH4+-N/NO3--N=50/50處理下以及山西運城菘藍(lán)和陜西商洛菘藍(lán)在全酰胺態(tài)氮處理下，其葉內(nèi)的靛藍(lán)、靛玉紅含量均有提高；NH4+-N/NO3--N=50/50處理的山西運城菘藍(lán)與全酰胺態(tài)氮處理的陜西商洛菘藍(lán)，其葉內(nèi)的靛藍(lán)、靛玉紅和總生物堿含量也均有提高。因此，應(yīng)綜合考慮菘藍(lán)自身的生物學(xué)特性如生育期、營養(yǎng)特性、有效成分累積動態(tài)規(guī)律、需水需肥規(guī)律等，采取合理的栽培技術(shù)和適宜的肥水措施，以利于獲得優(yōu)質(zhì)藥材。

3.2 氮營養(yǎng)對菘藍(lán)根內(nèi)代謝產(chǎn)物的影響

植物正常生長發(fā)育過程一般由初生代謝和次生代謝兩部分構(gòu)成，但兩者往往沒有絕對的界限，初生代謝為次生代謝提供了很多小分子物質(zhì)作為合成次生代謝產(chǎn)物的原料[26]，如氨基酸[27]、脂肪酸、糖類以及核酸類等，而次生代謝反過來也能為初生代謝提供一些反應(yīng)進(jìn)行所必需的酶類等物質(zhì)，相輔相成。但大量研究表明，在藥用植物生長過程中，其生長量與有效成分含量的積累動態(tài)多數(shù)不一致，且兩者之間存在一定的矛盾[28]。而中藥發(fā)揮臨床療效的物質(zhì)基礎(chǔ)通常為植物的次生代謝產(chǎn)物，即保證其藥材質(zhì)量及有效性的基礎(chǔ)是次生代謝產(chǎn)物[29]，(R,S)-告依春則為菘藍(lán)根內(nèi)產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)，其含量的高低直接影響板藍(lán)根藥材的質(zhì)量，因此在實際栽培生產(chǎn)中，以其含量作為質(zhì)量控制指標(biāo)，研究氮營養(yǎng)對菘藍(lán)根的影響。本研究中陜西商洛菘藍(lán)根內(nèi)的多糖含量在各氮素處理下均低于對照，而其(R,S)-告依春含量卻均高于對照；除NH4+-N/NO3--N=25/75處理外，甘肅張掖菘藍(lán)根內(nèi)的多糖含量亦均低于對照，而其(R,S)-告依春含量均高于對照；除NH4+-N/NO3--N=50/50處理外，安徽亳州菘藍(lán)根內(nèi)的多糖含量均高于對照，而其(R,S)-告依春含量均低于對照等。說明有利于初生代謝的環(huán)境條件并不一定利于次生代謝，不利于初生代謝的條件反而能增強次生代謝。因此，對于如何協(xié)調(diào)菘藍(lán)生長過程中初生代謝與次生代謝的關(guān)系尚需要進(jìn)一步深入研究。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典·一部[S]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社，2015: 21-22.

[2] 謝曉亮，尹曉琳，溫春秀，等. 小葉板藍(lán)根抗病毒及抑菌效果比較研究[J].中國現(xiàn)代中藥，2010，12(9): 38-40

XIE X L，YIN X L，WEN C X，etal. A comparative study on effects of antivirus and bacteriostasis of different germplasms ofIsatidisradix[J].ModernChineseMedicine，2010，12(9): 38-40.

[3] 馬毅敏，李 娜，劉承偉，等. 板藍(lán)根不同提取部位抗炎鎮(zhèn)痛活性比較研究[J].中草藥，2014，45(17): 2 517-2 521.

MA Y M，LI N，LIU C W，etal. Comparative studies on anti-inflammatory and analgesic activities of different fractions fromIsatidisradix[J].ChineseTraditionalandHerbalDrugs，2014，45(17): 2 517-2 521.

[4] 蔣華英，張兆蘭，陳紅儒，等. 復(fù)方蓼大青口服液治療兒童急性上呼吸道感染62例[J].中藥實驗方劑學(xué)雜志，2013，19(23): 291-294.

JIANG H Y，ZHANG Z L，CHEN H R，etal. Compound indigoplant leaf oral liquid in treatment of acute upper respiratory tract infection of children 62 cases[J].ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae，2013，19(23): 291-294.

[5] 何立巍，李 祥，王洪蘭，等. 板藍(lán)根多糖的結(jié)構(gòu)特征及活性研究[J].中國中藥雜志，2011，36(16)：2 179-2 182.

HE L W，LI X，WANG H L，etal. Structures and bioactivity of polysaccharides fromIsatidisradix[J].ChinaJournalofChineseMateriasMedica，2011，36(16)：2 179-2 182.

[6] 景曉平，裴 明，何 麗. 基于抗體芯片技術(shù)的黃芪多糖及板藍(lán)根多糖免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2013，28(11): 3 420-3 423.

JING X P，PEI M，HE L，etal. Research immunomodulatory mechanism of astragalus polysaccharide and isatis root polysaccharide based on antibody chip technology[J].ChinaJournalofTradtionalChineseMedicineandPharmacy，2013，28(11): 3 420-3 423.

[7] 景立權(quán)，趙福成，劉 萍，等. 施氮對超高產(chǎn)夏玉米干物質(zhì)及光合特性的影響[J].核農(nóng)學(xué)報，2014，28(2): 317-326.

JING L Q，ZHAO F C，LIU P，etal. Effects of nitrogen treatments on dry matter production and photosynthetic characteristics of summer maize (ZeamaysL.)under super-high yield conditions[J].JournalofNuclearAgriculturalSciences，2014，28(2): 317-326.

[8] 刑 瑤，馬興華. 氮素形態(tài)對植物生長影響的研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2015，17(2): 109-117.

XING Y，MA X H. Research progress on effect of nitrogen form on plant growth[J].JournalofAgriculturalScienceandTechnology，2015，17(2): 109-117.

[9] 于曼曼，劉 麗，郭巧生，等. 氮素不同形態(tài)配比對夏枯草苗期生長和光合特性的影響[J].中國中藥雜志，2011，36(5): 530-534.

YU M M，LIU L，GUO Q S，etal. Influence of nitrogen forms ratio on growth and photosynthetic characteristics inPrunellavulgaris[J].ChinaJournalofChineseMateriasMedica，2011，36(5): 530-534.

[10] 胡龍嬌，王康才，李燦雯，等. 氮素形態(tài)對半夏植株氮代謝及主要化學(xué)成分的影響[J].中國中藥雜志，2013，38(13): 2 073-2 077.

HU L J，WANG K C，LI C W. Effect of NH4+-N /NO3--N ratio in applied supplementary fertilizer on nitrogen metabolism and main chemical composition ofPinelliaternata[J].ChinaJournalofChineseMateriasMedica，2013，38(13): 2 073-2 077.

[11] 范巧佳，張 毅，楊世民，等. 氮素形態(tài)對川芎生長、產(chǎn)量與阿魏酸和總生物堿含量的影響[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2010，16(3): 720-724.

FAN Q J，ZHANG Y，YANG S M，etal. Effect of nitrogen forms on the growth, yield, content of ferulic acid and total alkaloids ofLigusticumchuanxiong[J].PlantNutritionandFertilizerScience，2010，16(3): 720-724.

[12] 唐曉清，呂婷婷，張 毅，等. 菘藍(lán)苗期生長與氣體交換參數(shù)對不同濃度酰胺態(tài)氮的動態(tài)響應(yīng)[J].生態(tài)學(xué)雜志，2015，34(1): 53-59.

TANG X Q，Lü T T，ZHANG Y，etal. Dynamic responses of growth and gas exchange parameters ofIsatisindigoticaseedlings to different concentration amide nitrogen[J].ChineseJournalofEcology，2015，34(1): 53-59.

[13] 肖云華，趙雪玲，王康才，等. 不同氮素形態(tài)和濃度對大青葉生物量與生物堿類成分的影響[J].中國中藥雜志，2013，38(17): 2 755-2 760.

XIAO Y H，ZHAO X L，WANG K C，etal. Effect of different nitrogen forms and concentrations on biomass and alkaloids ofIsatidisFolium[J].ChinaJournalofChineseMateriasMedica，2013，38(17): 2 755-2 760.

[14] 呂婷婷，施晟璐，唐曉清，等. 氮素營養(yǎng)對不同產(chǎn)地菘藍(lán)的干物質(zhì)積累、根外形品質(zhì)及光合作用的影響[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015, 38(3): 395-401.

Lü T T，SHI S L，TANG X Q，etal. Effect of nitrogen nutrient on dry matter accumulation，apparent quality and photosynthesis ofIsatisindigoticaFort. from different areas[J].JournalofNanjingAgriculturalUniversity，2015, 38(3): 395-401.

[15] 肖云華，呂婷婷，唐曉清，等. 追施氮肥量對板藍(lán)根的外形品質(zhì)、干物質(zhì)積累及活性成分含量的影響[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2014，20(2): 437-444.

XIAO Y H，Lü T T，TANG X Q，etal. Effects of topdressing nitrogen on apparent quality，dry matter accumulation and contents of active components in the root ofIsatisindigoticaFort.[J].PlantNutritionandFertilizerScience，2014，20(2): 437-444.

[16] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典·一部[S]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社，2015: 205-206.

[17] 王學(xué)奎. 植物生理生化實驗原理和技術(shù)(第2版)[M]. 北京: 高等教育出版社，2006:205-206.

[18] ALMEIDA-CORTEZ J A, SHIPLEY B, ARNASON J T. Effects of nutrient availability on the production of pentaynene, a secondary compound related to defense, inRudbeckiahirta[J].PlantSpeciesBiology, 2003, 18: 85-89.

[19] KAINULAINEN P, HOLOPAINEN J, PALOMAKI V,etal. Effects of nitrogen fertilization on secondary chemistry and ectomycorrhizal state of scots pine seedlings and on growth of grey pine aphid[J].J.Chem.Ecol., 1996, 22(4): 617-636.

[20] QU Y Y, ZHANG X W, MA Q,etal. Indigo biosynthesis byComamonassp. MQ[J].BiotechnologyLetters, 2012, 34: 353-357.

[21] 馬 橋，曲媛媛，張旭旺，等.靛藍(lán)的微生物合成研究新進(jìn)展[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2012，18(2): 344-350.

MA Q，QU Y Y，ZHANG X W，etal. Recent advances in microbial synthesis of Indigo[J].Chin.J.Appl.Environ.Biol.，2012，18(2): 344-350.

[22] RICHARDSONM D, CABRERA R J, MURPHY J A,etal. Nitrogen-form and endophyte-infection on growth, nitrogen uptake, and alkaloid content of chewings fescue turf grass[J].J.PlantNutrition, 1999, 22(1): 67-79.

[23] 陳 磊，朱月林，楊立飛.氮素形態(tài)配比對采用大豆籽粒膨大過程中氮碳同化的影響[J].西北植物學(xué)報，2010，30(2): 323-329.

CHEN L，ZHU Y L，YANG L F，etal. Effects of nitrogen forms and ratios on carbon-nitrogen assimilation in developing seeds of vegetable soybean[J].ActaBot.Boreal.-Occident.Sin.，2010，30(2): 323-329.

[24] 閆登明，李世清，李生秀.氮素形態(tài)和鐵營養(yǎng)對玉米苗期生長及體內(nèi)鐵分布的影響[J].西北植物學(xué)報，2008，28(3):547-553.

YAN D M，LI S Q，LI S X. Effect of nitrogen forms and iron supply on maize seedling growth and iron distribution[J].ActaBot.Boreal.-Occident.Sin.，2008，28(3):547-553.

[25] 鐘麗華，宋世威，劉厚誠，等.不同銨硝配比對芥藍(lán)產(chǎn)量和品質(zhì)的影響[J].中國蔬菜，2012，8(13):63-67.

ZHONG L H，SONG S W，LIU H C，etal. Effects of different ammonium and nitrate ratios on yield and quality of Chinese Kale[J].ChinaVegetables，2012，8(13):63-67.

[26] 李 琰，溫鵬飛，崔 蕾，等.微量元素對雷公藤不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響[J].林業(yè)科學(xué)，2014，50(2): 134-138.

LI Y，WEN P F，CUI L，etal. Effects of trace elements on adventitious root growth and secondary metabolites content ofTripterygiumwilfordii[J].ScientiaSilvaeSinicae，2014，50(2): 134-138.

[27] 王 瑩，史振生，王志斌，等. 植物對氨基酸的吸收利用及氨基酸在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用[J].中國土壤與肥料，2008，(1): 6-11.

WANG Y，SHI Z S，WANG Z B，etal. Absorption and utilization of amino acids by plant and application of amino acids on agriculture[J].ChineseSoilsandFertilizers，2008，(1): 6-11.

[28] 王 乾，王康才，鄭晨曦，等.不同形態(tài)氮對掌葉半夏生長及塊莖主要化學(xué)成分的影響[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2014，20(4): 1 038-1 043.

WANG Q，WANG K C，ZHENG C X，etal. Effect of different nitrogenous forms on growth and chemical component in tuber ofPinelliapedatisectaSchott[J].JournalofPlantNutritionandFertilizer，2014，20 (4): 1 038-1 043.

[29] 蘇文華，張光飛，李秀華，等. 植物藥材次生代謝產(chǎn)物的積累與環(huán)境的關(guān)系[J].中草藥，2005，36(9): 1 415-1 418.

SU W H，ZHANG G F，LI X H，etal. Relationship between accumulation of secondary metabolism in medicinal plant and environmental condition[J].ChineseTraditionalandHerbalDrugs，2005，36(9): 1 415-1 418.

(編輯:裴阿衛(wèi))

Effect of Nitrogen Forms and Proportion on Alkaloids and Polysaccharide of Isatis indigotica Fort. from Five Areas

Lü Tingting1,2, TANG Xiaoqing1*, SHI Shenglu1, YANG Yue1, WANG Yu1, WANG Kangcai1

(1 Institute of Chinese Medicinal Materials, Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China; 2 SPH Huayu Herb Co.Ltd, Shanghai, 200002, China)

To provide theoretical reference for the efficient use in cultivation ofIsatisindigotica, field experiment was carried to analyze the indigo, indirubin, total alkaloids, (R,S)-epigoitrin and polysaccharide ofI.indigoticafrom five different areas by using seven nitrogen treatments with three repeats, which were nitrogen control (CK), NO3--N, NH4+-N, NH4+-N/NO3--N=75/25, NH4+-N/NO3--N=50/50, NH4+-N/NO3--N=25/75 and CO(NH2)2, respectively. The results showed that nitrogen treatment was beneficial to improve its indigo ofI.indigoticaleaves from Yuncheng Shanxi and Shangluo Shaanxi. Meanwhile, the nitrogen treatment could also improve the total alkaloids of Bozhou Anhui and Shangluo Shaanxi. The content of indigo, indirubin and total alkaloids were all increased in the group of Yuncheng Shanxi with NH4+-N/NO3--N=50/50, as well as Yuncheng Shanxi and Shangluo Shaanxi with amide nitrogen. Compared with control, nitrogen treatment could effectively improve the (R,S)-epigoitrin content ofI.indigoticaroots from Zhangye Gansu and Shangluo Shaanxi, and the polysaccharide content ofI.indigoticaroots from Bozhou Anhui. The (R,S)-epigoitrin content ofI.indigoticaroots from Fuyang Anhui was much higher than that of others in any treatment. These results indicated that there are many differences among the responses of nitrogen treatment in different areas. Therefore, we could improve the contents of active components of theI.indigoticaby applying cost-effective nitrogen treatment according to the resource ofI.indigoticaand fertilizer-required rhythm.

IsatisindigoticaFort.; nitrogen forms and proportion; alkaloids; polysaccharide

1000-4025(2016)10-2070-08

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.10.2070

2016-03-30;修改稿收到日期:2016-09-18

國家自然科學(xué)基金(31171486)；國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃(201310307026)

呂婷婷(1990-)，女，碩士研究生，主要從事藥用植物栽培與中藥質(zhì)量控制研究。E-mail：lvtt1229@163.com

*通信作者:唐曉清，副教授，主要從事藥用植物栽培與中藥質(zhì)量控制研究。E-mail：xqtang@njau.edu.cn

Q945.79; Q946.8

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