克倫特羅在豬尿液中的消除規(guī)律研究

張　倩，顏顯輝，管恩平，唐正浩（. 黃島出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島　66444；. 榮成出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東榮成　6400；. 煙臺(tái)龍大食品有限公司，山東煙臺(tái)　64000）

克倫特羅在豬尿液中的消除規(guī)律研究

張倩1，顏顯輝2，管恩平1，唐正浩3
（1. 黃島出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島266444；2. 榮成出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東榮成264300；3. 煙臺(tái)龍大食品有限公司，山東煙臺(tái)264000）

[目的]研究克倫特羅在豬尿液中的消除規(guī)律。[方法]用含有克倫特羅1.5 mg/kg的飼料，飼喂一組體重約50 kg的90日齡育肥豬，正常飼喂35天后停藥，收集停藥后前32天的豬尿液，采用高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行克倫特羅含量分析。[結(jié)果]停藥后的前4天，豬尿液中的克倫特羅濃度迅速下降，第4天降至13.23 μg/kg，之后消除速度放慢，第32天為0.44 μg/kg，仍然高于最低檢測(cè)限0.05 μg/kg。[結(jié)論]克倫特羅在豬體內(nèi)消除緩慢，容易蓄積。

克倫特羅；豬；尿液；消除

克倫特羅（Clenbuterol），分子式為C12H18Cl2N2O，俗稱“瘦肉精”，是一種人工合成的β2-腎上腺受體激動(dòng)劑。動(dòng)物大劑量食用克倫特羅可以促進(jìn)其生長(zhǎng)并且提高瘦肉率，人類食用了含“瘦肉精”的豬肉極易中毒[1-3]。1997年，我國(guó)出臺(tái)了《關(guān)于嚴(yán)禁非法使用獸藥的通知》，禁止使用克倫特羅作為飼料添加劑[4]，但部分養(yǎng)殖戶受經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使，仍然在飼料中非法添加克倫特羅來(lái)提高瘦肉的出成率。

本試驗(yàn)參照國(guó)內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]，結(jié)合試驗(yàn)的實(shí)際需求，限定飼料中克倫特羅含量為1.5 mg/kg，建立了生豬體內(nèi)克倫特羅的消除模型，采集豬尿液作為監(jiān)控樣本，采用高效液相色譜法（HPLC）提取尿液中的克倫特羅，研究停藥后克倫特羅在豬尿液中的變化規(guī)律，為通過(guò)尿液監(jiān)控克倫特羅的非法使用情況提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1儀器

超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（Aglent1290+6490標(biāo)配），購(gòu)自美國(guó)安捷倫公司；超聲波清洗機(jī)，購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司；低速冷凍離心機(jī)，購(gòu)自長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；電子天平，購(gòu)自長(zhǎng)沙湘平科技發(fā)展有限公司（ZJ000832）；漩渦混和器，購(gòu)自上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.2材料

鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma）；鹽酸克倫特羅-D9內(nèi)標(biāo)（Dr.Ehrenstorfer GmbH）；β-葡萄糖醛酐霉/芳基硫酸酯酶；碳酸鉀（分析純，科密歐）；氯化鈉（分析純，科密歐）；乙酸乙酯（分析純，Merck）；異丙醇（分析純，科密歐）；甲醇（色譜純，Merck）；甲酸（色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；乙腈（色譜純，Merck）；無(wú)水硫酸鈉（分析純，科密歐）。

1.3工作儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

71.6 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取7.54 mg鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，經(jīng)計(jì)算濃度為71.6 mg/L。標(biāo)準(zhǔn)工作液：取上述儲(chǔ)備液用定溶液稀釋至適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液備用。

1.4動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及樣本的采集

選16頭3月齡健康三元豬，每頭體重約50 kg，飼喂含鹽酸克倫特羅1.5 mg/kg的飼料，自由采食和飲水。35天后換喂不含鹽酸克倫特羅的常規(guī)飼料，飼喂32天后結(jié)束試驗(yàn)。試驗(yàn)分別在用藥后第35天和停藥后第32天采集試驗(yàn)豬尿樣，檢測(cè)克倫特羅含量。在停藥后第32天，將試驗(yàn)豬全部宰殺，采集豬肉（包括前腿肌、背最長(zhǎng)肌、后腿肌、肋條五花肉）和皮下脂肪，制作成樣本，檢測(cè)克倫特羅含量[7]。

1.5樣品制備

取1 mL尿液于50 mL離心管中，加入8 mL乙酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH 5.2）充分混勻，再加50 μL β-葡萄糖醛酐霉/芳基硫酸酯酶混勻，37 ℃水浴水解12 h。添加內(nèi)標(biāo)工作液，加蓋渦旋混合15 min，離心10 min（5 000 r/min），取4 mL上清液加入0.1 mol/L高氯酸溶液5 mL混勻，用高氯酸調(diào)節(jié)pH值到（1±0.3），5 000 r/min離心10 min后移取清液至另一離心管中，用10 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值到11，各加入10 mL飽和氯化鈉溶液和異丙醇-乙酸乙酯（6+4）混合溶液，充分提取，5 000 r/min離心10 min。轉(zhuǎn)移全部有機(jī)相，40 ℃減壓濃縮干。加入5 mL乙酸鈉緩沖液，混勻、溶解后備用。將上述殘?jiān)芤哼^(guò)預(yù)先用3 mL甲醇、3 mL水活化的上柱，然后依次用2 mL水、2 mL 2%甲酸水溶液和2 mL甲醇洗滌柱子并徹底抽干，最后用2 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫柱子上的待測(cè)成分。流速控制在0.5 mL/min。用40 ℃ 氮?dú)獯蹈上疵撘海尤攵ㄈ菀赫袷幦芙鈿堅(jiān)?，離心后清液過(guò)濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定。

1.6色譜質(zhì)譜條件

色譜條件：ACQUITYUPLC HSS T3色譜柱（2.1×100 mm×1.8 μm）；流速為0.4 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相A為甲醇，B為0.1% 甲酸（含5 mmol/L乙酸銨），梯度洗脫（表1）。質(zhì)譜條件：干燥氣溫度為220 ℃；干燥氣流速為15 L/min；霧化氣壓力為20 psi；鞘氣溫度為350 ℃；鞘氣流速為12 L/min；毛細(xì)管電壓為2 200 V；掃描模式為MRM，母離子、監(jiān)測(cè)離子、碰撞能量和錐孔電壓等MRM參數(shù)見(jiàn)表2。

表1　梯度洗脫程序

表2　克倫特羅及克倫特羅內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)

1.7數(shù)據(jù)處理與計(jì)算

1.7.1定性測(cè)定。如果檢測(cè)的色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰的保留時(shí)間一致，且離子峰度比滿足要求，視為檢出。

1.7.2定量測(cè)定。樣品濃度如超出線性范圍，則采取減小稱樣量的方法，使其檢測(cè)濃度在線性范圍內(nèi)。

1.7.3檢測(cè)限度。克倫特羅0.05 μg/kg。

1.7.4計(jì)算公式。采用內(nèi)標(biāo)法定量，按下列公式計(jì)算克倫特羅殘留量：。公式中：X—試樣中待測(cè)組分殘留量（μg/kg）；C—標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度（ng/mL）；Csi—標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物濃度（ng/mL）；Ci—樣液中內(nèi)標(biāo)物濃度（ng/mL）；As—標(biāo)準(zhǔn)工作溶液峰面積；A—樣液中待測(cè)目標(biāo)物峰面積；Asi—標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物峰面積；Ai—樣液中內(nèi)標(biāo)物峰面積；V—樣品定容體積（mL）；W—樣品稱樣量（g）。

2　結(jié)果

克倫特羅投喂至第35天，豬尿液樣本中的克倫特羅濃度為239.23 μg/kg。由圖1可以看出，停藥期前4天豬體內(nèi)克倫特羅消除速度最快，停藥后第1天（即停藥后24小時(shí)）尿液中克倫特羅濃度由239.23 μg/kg降到103.45 μg/kg，第4天濃度已降至13.56 μg/kg。之后克倫特羅在豬體內(nèi)的消除速度放慢。停藥后第32天濃度為0.44 μg/kg，仍然高于克倫特羅最低檢出限0.05 μg/kg。停藥后第32天，豬肉和脂肪中克倫特羅含量已低于0.05 μg/kg。

圖1　停藥期豬尿液中克倫特羅消除規(guī)律

3　討論

豬攝入的克倫特羅排出體外的主要途徑是通過(guò)尿液。Smith[8]通過(guò)14C-克倫特羅對(duì)克倫特羅在豬尿液、糞便、屠體和內(nèi)臟中的分布進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)閹豬和母豬中14C-克倫特羅的總回收率分別是95.1%和99.3%。尿液中14C-克倫特羅排泄比率最大，可以達(dá)到55%～75.4%，糞次之。豬停藥24小時(shí)后，尿液中克倫特羅濃度由239.23 μg/kg降到103.45 μg/kg，停藥后第4天濃度已降至13.56 μg/kg，證明了豬體內(nèi)的克倫特羅主要通過(guò)尿液排出體外。

試驗(yàn)中豬停藥32天后仍可以在尿液中檢出克倫特羅殘留，并且檢測(cè)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于克倫特羅的最低檢出限0.05 μg/kg，說(shuō)明克倫特羅被動(dòng)物攝入體內(nèi)后至完全消除是一個(gè)十分緩慢的過(guò)程。此時(shí)，豬肉和脂肪中的克倫特羅含量已經(jīng)低于檢測(cè)限，說(shuō)明克倫特羅在豬肉和脂肪中的消除速度比在尿液中快，因此以豬尿液作為克倫特羅的監(jiān)控樣本具有較高的靈敏性。至于尿液中克倫特羅消除速度緩慢的原因，是否是機(jī)體內(nèi)有其他組織在緩慢蓄積克倫特羅并釋放進(jìn)入尿液，還有待進(jìn)一步研究。

克倫特羅作為一種β2-受體激動(dòng)劑，可以與呼吸道細(xì)胞膜上廣泛分布的β2-受體結(jié)合，也能夠使得機(jī)體其它部位的β2-受體興奮，如血管平滑肌、骨骼肌和子宮等[9]。給豬食用克倫特羅，能提高豬肉的瘦肉率，但是提高豬肉的瘦肉率不是克倫特羅本身具有的藥理作用，其使用劑量必須為治療劑量的數(shù)十倍時(shí)才會(huì)表現(xiàn)“提高瘦肉率”的效果。肖日進(jìn)等[10]研究表明，不同添加水平的克倫特羅能夠不同程度地提高豬胴體瘦肉率，其中以添加15 mg/kg克倫特羅的效果最為顯著。楊志凌等[11]與李慧等[12]在克倫特羅的研究中，將仔豬飼料中克倫特羅的添加含量設(shè)定為5 mg/kg和10 mg/kg，本試驗(yàn)中克倫特羅的給藥含量為1.5 mg/kg，遠(yuǎn)低于以上添加數(shù)值和實(shí)際中的非法添加劑量，其蓄積期殘留含量也相對(duì)要低一些，而在停藥32天后卻仍然可以從豬尿液中檢出克倫特羅，并且檢測(cè)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于最低檢測(cè)限。

從本試驗(yàn)可以看出，克倫特羅在豬尿液中的消除速度十分緩慢，殘留時(shí)間可達(dá)30天以上，而克倫特羅通常被非法用于育肥豬后期生長(zhǎng)階段，即出欄前一個(gè)月左右，因此以豬尿液作為樣本監(jiān)控克倫特羅的非法使用情況是一種非常有效的監(jiān)管手段。

[1] Sauern M J，Pickett R J H，Limer S，et al. Distribution and elimination of clenbuterol in tissues and fluids of calves following prolonged oral administration at a growpromoting dose[J].J Vet Pharmacol Therap，1995（18）：81-86.

[2] 王立斌，張永慧，等. 鹽酸克倫特羅引起特大食物中毒的調(diào)查與思考[J].華南預(yù)防醫(yī)學(xué)，2002，28（1）：54-56.

[3] Salleras L，Domiguez A，Mata E，et al. Epidemiologic study of an uoutbreak of clenbuterol poisoning in Catalonia[J]. Spain Public Health Rep，1995，110（4）：338-341.

[4] 農(nóng)業(yè)部.關(guān)于嚴(yán)禁非法使用獸藥的通知：農(nóng)牧發(fā)3號(hào)[EB/OL].（1991-03-25）[2016-11-09].http://www.moa.gov.cn/ zwllm/zcfg/qtbmgz/200601/t20060120_539531.htm.

[5] 王開(kāi)雄，何天武，劉琴. 鹽酸克倫特羅在動(dòng)物體內(nèi)代謝與殘留規(guī)律[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2007（4）：52.

[6] Jelka P，Ana V. Clenbuterol residues in pig muscle after repeat administration in a growth-promoting dose[J]. Meat Science，2010（1）：733-737.

[7] 王鳳美，張鴻偉，龐士平，等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源性食品和尿液中4種β-受體激動(dòng)劑殘留[J].分析化學(xué)，2008，36（12）：1629-1635.

[8] Smith D T，萬(wàn)美梅，譚滇湘.14C-鹽酸克倫特羅混飼在豬體內(nèi)的殘留消除研究[J].中國(guó)動(dòng)物保健，2003（23）：9-12.

[9] 楊詩(shī)興．應(yīng)用鹽酸克倫特羅作為飼料添加劑飼喂家禽對(duì)消費(fèi)者的安全問(wèn)題[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2001，13（3）：14-18．

[10] 肖日進(jìn)，許梓榮. Clenbuterol對(duì)肥育豬作用效果的研究[J].浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，21（3）：227-231.

[11] 楊志凌，陳杖榴，方炳虎，等.高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)法測(cè)定豬組織中的克倫特羅[J].色譜，2003，21（3）：245-247.

[12] 李慧，劉士杰，蘇曉歐. 鹽酸克倫特羅在豬尿液中消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)研究[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2005，32（9）：35-36.

（責(zé)任編輯：杜憲）

Study on Elimination Rule of Clenbuterol in Swine Urine

Zhang Qian1，Yan Xianhui2，Guan Enping1，Tang Zhenghao3
（1. Huangdao Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao，Shandong266444；2. Rongcheng Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Rongcheng，Shandong264300；3. Yantai Longda Foodstuffs Co.，Ltd.，Yantai，Shandong264000）

[Objective] In order to study the elimination rule of Clenbuterol in swine urine. [Methods] A group of 50 kg，90-day-old fattening pigs were fed on feed containing Clenbuterol of 1.5 mg/kg，the experiment of feeding drugs was conducted for 35 days totally. After drug withdrawal，the prior 32-day swine urine samples were collected and the content of Clenbuterol was analyzed by high performance liquid chromatography（HPLC）. [Results] The concentration of Clenbuterol in the urine dropped down quickly in 1～4 days after drug withdrawal，and in the fourth day，it was down to 13.23 μg/kg，then the elimination rate slowed down and in the thirty-second day，it was 0.44 μg/kg，which was still higher than the minimum detection limit of 0.05 μg/kg. [Conclusion] The results showed that Clenbuterol eliminated slowly and accumulated easily in pigs.

Clenbuterol；swine；urine；elimination

S851.43

B

1005-944X（2016）12-0031-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.12.009

國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科學(xué)研究和技術(shù)開(kāi)發(fā)項(xiàng)目（2011IK189）