可視化2型豬鏈球菌LAMP檢測方法的建立

熊　煒，魏曉鋒，王　艷，林穎崢，張　強(qiáng)，李春陽，黃忠榮，胡建華，李　?。? 上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上?！?035；. 上海實(shí)驗(yàn)動物研究中心，上?！?03）

可視化2型豬鏈球菌LAMP檢測方法的建立

熊煒1，魏曉鋒2，王艷1，林穎崢1，張強(qiáng)1，李春陽1，黃忠榮1，胡建華2，李健1
（1. 上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海200135；2. 上海實(shí)驗(yàn)動物研究中心，上海201203）

由2型豬鏈球菌（Streptococcus suis serotype 2）引起的豬鏈球菌?。⊿wine streptococosis）是一種重要的人獸共患疾病，具有高感染率、高死亡率的特點(diǎn)。為加強(qiáng)口岸動物源性產(chǎn)品中2型豬鏈球菌的現(xiàn)場查驗(yàn)力度，建立了2型豬鏈球菌LAMP檢測方法，并對方法的特異性、敏感性和穩(wěn)定性進(jìn)行了測試。通過在LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中加入顯色液，提高了對檢測結(jié)果肉眼判定的準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)了結(jié)果判定可視化的目標(biāo)，有助于在出入境口岸貨物查驗(yàn)現(xiàn)場及豬場等一線實(shí)驗(yàn)室使用。

2型豬鏈球菌；環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)；可視化

豬鏈球菌?。⊿wine streptococosis）是由溶血性鏈球菌引起的人獸共患疾病，豬感染后出現(xiàn)敗血性、局灶性淋巴結(jié)化膿、關(guān)節(jié)炎等主要特征。溶血性鏈球菌還可引起人腦膜炎、敗血癥等，導(dǎo)致嚴(yán)重疾患，甚至死亡[1-2]。該病分布廣泛，發(fā)病率較高，敗血癥型的病死率也較高，因此被我國農(nóng)業(yè)部列為二類動物疫病。該病呈世界性分布，自上世紀(jì)50年代以來，在荷蘭、英國、加拿大、澳大利亞、新西蘭、比利時、巴西、丹麥、西班牙、德國、日本等國家以及我國臺灣省先后有報道[3]。本病一年四季均可發(fā)生，夏秋季多發(fā)。病豬和帶菌豬是本病的主要傳染源，動物的排泄物、分泌物、血液、內(nèi)臟器官及關(guān)節(jié)內(nèi)均有病原體存在，對病死豬的處置不當(dāng)和運(yùn)輸工具的污染是造成本病傳播的重要因素[4-6]。環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型的核酸檢測方法，其特異性和敏感性可以與熒光PCR媲美，同時其檢測周期短，操作簡便，對檢測硬件設(shè)備的要求較低，適合于在野外現(xiàn)場使用。目前，該技術(shù)已成功應(yīng)用于口蹄疫、豬瘟等重大動物疫病的檢測。本研究通過分析2型豬鏈球菌的基因序列，設(shè)計了多套LAMP引物體系，從中篩選出理想的引物，建立了2型豬鏈球菌LAMP檢測方法，并對方法的特異性、敏感性進(jìn)行了測試，并實(shí)現(xiàn)了對檢測結(jié)果的可視化判讀。

1　材料與方法

1.1主要試劑

ThermoPol緩沖液、Bst DNA聚合酶，購自New England BioLabs公司；dNTP、隨機(jī)引物、DNA Marker（DL2000），購自Takara公司；甜菜堿（Betaine），購自Sigma公司；超純水，購自Invitrogen公司。

1.2毒株來源及樣品處理

2型豬鏈球菌、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV，SD1株）、偽狂犬病毒（PRV，SA215株）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV，H株）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）等組織和核酸樣本以及沙門氏菌和志賀氏菌的培養(yǎng)物為本實(shí)驗(yàn)室和上海實(shí)驗(yàn)動物研究中心保存。陽性組織樣品加等體積生理鹽水研磨勻漿，3 000 g離心15 min，收集上清液待檢。

1.3病原核酸的提取

取100 μL待檢上清液或20 μL細(xì)菌培養(yǎng)物，采 用Qiagen DNA Bloodmini Kit提 取PRV、PCV-2、2型豬鏈球菌、沙門氏菌和志賀氏菌的核酸；采用Trizol提取PRRSV、TGEV的核酸，再制備成cDNA備用。

1.4LAMP引物設(shè)計

查詢Genbank獲取2型豬鏈球菌的基因序列，通過軟件分析和比對，確定2型豬鏈球菌保守的特異性靶序列，使用Primer Explorer和LAMP Designer軟件，設(shè)計2型豬鏈球菌的LAMP特異引物（表1）。

表1　2型豬鏈球菌LAMP引物

1.5LAMP檢測體系

LAMP基本的反 應(yīng) 體 系 為25 μL：1×ThermoPol緩沖液，8 mmol/L MgSO4，1 mol/L甜菜堿，1.4 mmol/L dNTPs，0.2 μmol/L外引物（F3和B3），1.6 μmol/L內(nèi)引物（FIP和BIP），0.8 μmol/L環(huán)引物（LF和LB），2 μL模板DNA，8 U Bst聚合酶。將除模板外的其他試劑配備成混合液混勻后，每管分裝23 μL，加入10 μL密封液后再分別加入2 μL模板DNA或陰陽性對照模板，混勻離心，小心蓋緊管蓋。最后將混合物置于反應(yīng)孔中，于63 ℃恒溫反應(yīng)60 min。

2　結(jié)果

2.12型豬鏈球菌LAMP特異性引物組的篩選

針對2型豬鏈球菌不同的保守基因序列，共設(shè)計了8套LAMP引物。將這些引物放入相同的LAMP反應(yīng)體系中進(jìn)行測試，以評估不同LAMP引物體系擴(kuò)增的效果。結(jié)果顯示，8套引物中，引物組1和引物組6有擴(kuò)增，其他無擴(kuò)增，其中引物組6擴(kuò)增效果最好，其起峰早，擴(kuò)增效率高（圖1）。

圖1　2型豬鏈球菌不同LAMP引物組擴(kuò)增曲線

2.22型豬鏈球菌 LAMP檢測方法的靈敏度

將提取的2型豬鏈球菌基因組DNA分別稀釋到0.5×10-2、0.5×10-3、0.5×10-4、0.5×10-5ng/μL，以不含目的基因的水為空白對照，加入引物組6，按照上述反應(yīng)條件進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。結(jié)果顯示，DNA模板量的下限達(dá)0.5×10-4ng/μL時，熒光強(qiáng)度和電泳檢測仍可見目的條帶的顯著擴(kuò)增（圖2）。

2.32型豬鏈球菌LAMP檢測方法的特異性

配置含引物組6的LAMP體系反應(yīng)管，除加入2型豬鏈球菌核酸外，其余管分別加入PRRV、PRV、TGEV、PCV-2、沙門氏菌、志賀氏菌等病原的核酸，63 ℃運(yùn)行60 min，電泳判定結(jié)果。結(jié)果顯示，除含有2型豬鏈球菌核酸的反應(yīng)管外，其余病原均未出現(xiàn)LAMP特征性的陽性電泳條帶（圖3）。

圖2　2型豬鏈球菌LAMP檢測方法的靈敏度

圖3　2型豬鏈球菌LAMP檢測方法的特異性

2.4可視化2型豬鏈球菌LAMP檢測方法

將提取的2型豬鏈球菌基因組DNA分別稀釋到0.5×10-2、0.5×10-3、0.5×10-4ng/μL， 再 加 入LAMP檢測體系中。配完檢測體系后，在檢測管的管蓋上滴加2 μL顯色液，小心蓋好反應(yīng)管蓋，63℃運(yùn)行60 min。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)管顛倒混勻，肉眼判讀結(jié)果。結(jié)果顯示，DNA模板濃度等于或高于0.5×10-4ng/μL時，反應(yīng)液顯淺綠色，而空白對照反應(yīng)液均呈淺黃色（圖4），與前述的結(jié)果保持一致。

圖4　可視化2型豬鏈球菌LAMP檢測方法

3　討論

鏈球菌種類多，屬條件性致病菌，在自然界和豬群中分布廣泛，常存在于健康的哺乳動物和人體內(nèi)。2005年6月中旬至8月初，四川資陽、內(nèi)江等地發(fā)生一起較大規(guī)模的人-豬鏈球菌病疫情，疫情分布在l2個市37個縣（市、區(qū)） 的131個鄉(xiāng)鎮(zhèn)（街道）、195個村（居委會），造成大量的人員感染和死亡[7]。

豬、野豬、馬屬動物、牛、羊、狗、貓、鳥類、兔、水貂和魚等對豬鏈球菌均有易感性。豬則不分年齡、品種和性別，均易感，但主要在3～12周齡的仔豬中暴發(fā)流行，尤其在斷奶及混群時易出現(xiàn)發(fā)病高峰[8-9]。開發(fā)核酸檢測方法，在感染早期檢出豬鏈球菌，對控制其傳播、減少損失具有重要的意義[10]。

本研究在分析2型豬鏈球菌保守基因序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計和測試了多套不同LAMP引物檢測體系，從中篩選出了一組較理想的引物，建立了2型豬鏈球菌LAMP檢測方法，并對方法的特異性和敏感性進(jìn)行了測試，證實(shí)了建立的LAMP檢測方法具有良好的敏感性。同時該方法特異性好，不與PRRV、TGEV、PRV、PCV-2、沙門氏菌、志賀氏菌等病原發(fā)生交差反應(yīng)。

在建立了常規(guī)LAMP檢測方法的基礎(chǔ)上，本研究在密封反應(yīng)管前滴加顯色液于反應(yīng)管蓋上，在溫浴反應(yīng)結(jié)束后，再顛倒反應(yīng)管，讓顯色液與LAMP產(chǎn)物充分混合，提高了檢測結(jié)果的可視化，增強(qiáng)了肉眼判定的準(zhǔn)確性，同時在不打開反應(yīng)管的條件下進(jìn)行染色，避免了擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠污染檢測環(huán)境的可能性。

目前，PCR是檢測2型豬鏈球菌的主要方法。該方法具有敏感度高，操作簡便的特點(diǎn)，但需要在配有設(shè)備的專業(yè)化實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成[8-9]。本研究建立的可視化LAMP檢測方法，除普通離心機(jī)和水浴鍋外，幾乎不需要其它設(shè)備，其檢測的敏感性和可靠性不低于傳統(tǒng)PCR方法，非常適合應(yīng)用于豬場等條件簡陋的一線實(shí)驗(yàn)室早期感染的監(jiān)控。對于出入境口岸，該方法可應(yīng)用于貨物查驗(yàn)現(xiàn)場動物源性產(chǎn)品中2型豬鏈球菌的快速檢測，有助于提高陽性樣品的檢出率。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Establishment of a Visible LAMP Method for the Detection of Streptococcus suis Serotype 2

Xiong Wei1，Wei Xiaofeng2，Wang Yan1，Lin Yingzheng1，Zhang Qiang1，Li Chunyang1， Huang Zhongrong1，Hu Jianhua2，Li Jian1
（1. Shanghai Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai200135；2. Shanghai Laboratory Animal Research Center，Shanghai201203）

Swine streptococosis is caused by Streptococcus suis serotype 2，which is one of the important zoonosis diseases with characteristics of high infection and high mortality rate. In order to strengthen the spot inspection of the Streptococcus suis serotype 2 carried by animal-derived products at each entry-exit port，a loop-mediated isothermal amplification（LAMP） method was established. Then its specificity，sensitivity and stability were tested. With the entry of SYBR Green into LAMP reaction products，the accuracy of the testing results judged by naked eyes has been enhanced，and the objective of visibility of result judging was realized. The LAMP method would offer help to the front-line laboratories，such as in the goods inspection spots belonging to the entry-exit ports and the pig farms.

Streptococcus suis serotype 2；loop-mediated isothermal amplification（LAMP）；visibility

S851.3

A

1005-944X（2016）12-0075-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.12.021

上海市科委科研項目（14140900700）

王 艷