Taqman熒光PCR法檢測(cè)肉制品中牛源性成分及定量研究

沙才華，汪文輝，黃海超，廖秀云，楊　素（珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東珠?！?19000）

Taqman熒光PCR法檢測(cè)肉制品中牛源性成分及定量研究

沙才華，汪文輝，黃海超，廖秀云，楊素
（珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東珠海519000）

本研究通過(guò)以牛線粒體保守基因序列設(shè)計(jì)的特異性引物和探針，建立了肉制品中牛源性成分Taqman熒光PCR檢測(cè)方法，并對(duì)方法的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià)；通過(guò)模擬濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，完成了對(duì)牛源性成分的相對(duì)定量檢測(cè)。結(jié)果顯示，本方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高（檢出限為0.001%）的特點(diǎn)，適用于肉制品中牛源性成分及含量的快速檢測(cè)。

牛源性成分；線粒體；Taqman熒光 PCR

近年來(lái)，“假牛肉事件”屢屢曝光，牛肉制品中造假摻雜幾乎成為公開(kāi)的秘密。這些不法行為不僅擾亂了正常的市場(chǎng)秩序，而且造成了食品安全隱患，其影響不容忽視。因此，建立一種對(duì)肉制品中牛源性成分進(jìn)行快速鑒定和定量分析的準(zhǔn)確檢測(cè)方法具有非常重要的意義。

Taqman熒光 PCR技術(shù)應(yīng)用于食品中肉類(lèi)種源鑒別，這在保證鑒別準(zhǔn)確性前提下，使定量檢測(cè)成為可能。由于Taqman熒光PCR擴(kuò)增的目的片段較短，所以尤其適用于加工食品的檢測(cè)。根據(jù)被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目與PCR產(chǎn)物數(shù)量的一對(duì)一關(guān)系，直接探測(cè)PCR過(guò)程中熒光信號(hào)的變化，以獲得定量結(jié)果，進(jìn)而利用該技術(shù)對(duì)模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量[1]。本研究選定高保守的牛線粒體基因作為靶基因，設(shè)計(jì)特異引物及探針，旨在建立快速、簡(jiǎn)便、靈敏、特異的牛源性成分熒光PCR檢測(cè)方法，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)肉制品中牛源性成分的鑒定和定量，為打擊牛肉制品造假摻雜行為提供技術(shù)支撐。

1　材料和方法

1.1樣品

黃牛肉、水牛肉、牦牛肉、羚羊肉、山羊肉、綿羊肉、馬肉、驢肉、雙峰駝肉、馴鹿肉、豬肉、貓肉、狗肉、雞肉、鴨肉為本實(shí)驗(yàn)室留存樣品。以上樣品均已使用本實(shí)驗(yàn)室脊椎動(dòng)物通用引物（經(jīng)過(guò)CNAS認(rèn)可）對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序，確定了其種屬。

1.2主要試劑

DNA提取試劑盒E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit，美國(guó)OMEGA公司產(chǎn)品；Premix Ex Taq qPCR Mastermix，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.3主要儀器

7500 FAST熒光定量PCR儀，美國(guó)Applied Biosystems公司產(chǎn)品；Sigma 3-18 K高速冰凍臺(tái)式離心機(jī)，德國(guó)Sartorius公司產(chǎn)品；NanoDrop ND-1000紫 外 分 光 光 度 計(jì)， 美 國(guó) NanoDrop Technologies 公司產(chǎn)品。

1.4方法

1.4.1PCR引物、探針的設(shè)計(jì)與合成。檢索GenBank中公布的大量不同種屬的牛（包括黃牛、水牛、牦牛）DNA序列，最終選用牛線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）上的特異性序列作為設(shè)計(jì)引物與探針的序列。利用生物學(xué)軟件DNAMAN將其比對(duì)后，在高度保守區(qū)域用Oligo7.0設(shè)計(jì)一組牛特異性PCR引物和探針，由大連寶生物科技有限公司合成。引物、探針序列見(jiàn)表1。

表1　牛引物、探針序列

1.4.2樣品的DNA提取。按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣品DNA，利用Nanodrop 1 000微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品DNA濃度和純度。按照所測(cè)濃度，將樣品DNA 含量稀釋至100 ng/μL左右，存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×Taq PCR Master mix 12.5 μL、10 μmol/L上下游引物各2 μL、10 μmol/L探針1 μL、DNA模版2.0 μL，補(bǔ)水至25 μL。反應(yīng)程序：95℃4 min；95℃15 s，50℃1 mins，40個(gè)循環(huán)。FAM熒光通道搜集信號(hào)，在每個(gè)循環(huán)的退火階段收集熒光信號(hào)。結(jié)果判定：Ct值小于35，且曲線有明顯的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，判為陽(yáng)性；Ct值大于35，判為陰性。

1.4.4熒光PCR方法特異性試驗(yàn)。以黃牛肉、水牛肉、牦牛肉等3份牛源性樣品和羚羊肉、山羊肉、綿羊肉、馬肉、驢肉、雙峰駝肉、馴鹿肉、豬肉、貓肉、狗肉、雞肉、鴨肉等12份非牛源動(dòng)物樣品提取的DNA為模板，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證所建立的熒光PCR方法的特異性。

1.4.5熒光PCR方法靈敏度和穩(wěn)定性試驗(yàn)。以新鮮牛肉去脂肪后切片，經(jīng)烘箱60 ℃ 72小時(shí)烘干，然后研磨成牛肉粉，稱(chēng)取30 mg牛肉粉按照1.4.2所述方法提取牛DNA模板，用滅菌雙蒸水10倍比稀釋至10-9，每個(gè)梯度的樣品取5個(gè)平行進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，計(jì)算各稀釋度樣品Ct平均值（）和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）評(píng)價(jià)該方法靈敏度及穩(wěn)定性。

1.4.6模擬混合樣熒光PCR方法靈敏度和穩(wěn)定性試驗(yàn)。使用1.4.5制備的純牛肉粉和純魚(yú)粉按10倍比稀釋混合至10-9，稱(chēng)取30 mg混合粉提取DNA模板，每個(gè)梯度的樣品取5個(gè)平行進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，計(jì)算各稀釋度樣品Ct平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）評(píng)價(jià)該方法靈敏度及穩(wěn)定性。

1.4.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及模擬混合樣品中牛源性成分定量檢測(cè)。使用1.4.5制備的純牛肉粉和純魚(yú)粉按不同比例混合，制成牛源性成分含量分別為100%、50%、25%、10%、5%及1%（m/m）的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)樣本，標(biāo)準(zhǔn)樣品取5個(gè)平行。同時(shí)模擬加工混合肉樣的檢測(cè)，對(duì)牛肉粉含量分別為2%、4%、8%、20%、40%和80%的混合樣品進(jìn)行定量體系檢測(cè)，每個(gè)樣品取2個(gè)平行。每份樣品稱(chēng)取30 mg混合粉提取DNA模板，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，通過(guò)ABI熒光PCR儀軟件設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，反應(yīng)結(jié)束后，直接點(diǎn)擊“analysis”進(jìn)行分析，軟件自動(dòng)給出標(biāo)準(zhǔn)曲線（包括線性關(guān)系、斜率、擴(kuò)增效率等）及各樣品計(jì)算濃度。也可以每個(gè)濃度的值為橫坐標(biāo)，log2（濃度）的絕對(duì)值為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，推導(dǎo)公式并計(jì)算各模擬加工混合肉樣含量。

1.4.8市售商品的檢測(cè)。應(yīng)用本方法和國(guó)標(biāo)

GB/T 20190—2006（普通PCR）中的方法，同時(shí)對(duì)收集的10份標(biāo)稱(chēng)為牛肉制品的商品開(kāi)展牛源性成分檢測(cè)。

2　結(jié)果與分析

2.1牛源性成分熒光PCR方法特異性試驗(yàn)

上述16種不同物種的檢測(cè)結(jié)果顯示：僅黃牛肉、水牛肉和牦牛肉有典型的“S”型擴(kuò)增曲線且Ct值小于35，而其他樣品及空白對(duì)照均未有擴(kuò)增曲線或Ct值大于35，具體結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　牛源性成分熒光PCR方法特異性試驗(yàn)

2.2牛源性成分熒光PCR靈敏度試驗(yàn)和穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)稀釋度為100～10-9樣品進(jìn)行熒光PCR試驗(yàn)，結(jié)果顯示：樣品在稀釋度在100～10-6稀釋度時(shí)，Ct值均小于35，且曲線有明顯的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，擴(kuò)增結(jié)果具有良好的重復(fù)性，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜3.5%，當(dāng)樣品在稀釋度10-7仍有擴(kuò)增曲線，但樣品Ct值大于35，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＞3.5%。因此本方法建立的熒光PCR方法靈敏度高達(dá)10-6（即0.000 1%，對(duì)應(yīng)的為33.94），也與理論推導(dǎo)出來(lái)Ct值吻合。最低檢測(cè)到的牛肉DNA含量為0.2 pg。本方法的靈敏度和穩(wěn)定性試驗(yàn)見(jiàn)圖2，相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。以稀釋度對(duì)值作圖，其線性關(guān)系如圖3所示。線性相關(guān)系數(shù)R2 = 0.999 6，線性范圍為10-6～100（即0.000 1%～100%）。

2.3模擬混合樣熒光PCR方法靈敏度和穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)稀釋度為100～10-9樣品進(jìn)行熒光PCR試驗(yàn)，結(jié)果顯示：樣品在稀釋度在100～10-5稀釋度時(shí)，Ct值均小于35，且曲線有明顯的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，擴(kuò)增結(jié)果具有良好的重現(xiàn)性，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜3.5%。當(dāng)樣品在稀釋度10-6時(shí)，樣品Ct值大于35，因此本方法建立的熒光PCR方法靈敏度高達(dá)10-5（即0.001%，對(duì)應(yīng)的為32.39）。本方法的靈敏度和穩(wěn)定性試驗(yàn)見(jiàn)圖4，相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。以稀釋度對(duì)值作圖，其線性關(guān)系如圖5所示。線性相關(guān)系數(shù)R2 = 0.991 4，線性范圍為10-5～100（即0.001%～100%）。

表2　牛源性成分熒光PCR 反應(yīng)的靈敏度和穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)

圖2　牛源性成分熒光PCR方法靈敏度和穩(wěn)定性試驗(yàn)

圖3　牛源性成分熒光PCR方法線性關(guān)系

圖4　模擬混合樣牛源性成分熒光PCR方法靈敏度和穩(wěn)定性試驗(yàn)

表3　模擬混合樣牛源性成分熒光PCR 反應(yīng)的靈敏度和穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)

圖5　模擬混合樣牛源性成分熒光PCR方法線性關(guān)系

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及模擬混合樣品中牛源性成分定量檢測(cè)

應(yīng)用PCR儀自帶軟件分析顯示：線性相關(guān)系數(shù)R2= 0.986，線性范圍為1%～100%。對(duì)牛肉粉含量分別為2%、4%、8%、20%、40%和80%的混合樣品進(jìn)行定量體系檢測(cè)所得牛肉粉含量平均值分別為2.8%、4.2%、9.1%、21.1%、46.0%和79.7%（圖6）。以值為橫坐標(biāo)，以log2（濃度）的絕對(duì)值為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，并推導(dǎo)出牛源性成分的含量。公式中的y為牛源性成分含量，x為檢測(cè)的Ct值。應(yīng)用公式計(jì)算出牛肉粉含量分別為2.9%、4.2%、9.2%、21.0%、45.4%和78.1%，線性相關(guān)系數(shù)R2= 0.989，線性范圍為1%～100%，其線性關(guān)系如圖7所示。兩種方法的定量結(jié)果均與實(shí)際結(jié)果相近，相關(guān)數(shù)據(jù)及定量結(jié)果見(jiàn)表4。

圖6　標(biāo)準(zhǔn)曲線及模擬混合樣品中牛源性成分定量檢測(cè)

表4　牛源性成分熒光PCR定量結(jié)果

2.5市售商品的檢測(cè)

對(duì)10份標(biāo)稱(chēng)為牛肉的制品同時(shí)應(yīng)用本方法和國(guó)標(biāo)GB/T 20190—2006（普通PCR）進(jìn)行牛源性成分檢測(cè)。兩種方法的定性檢測(cè)結(jié)果完全吻合，其中6份樣品檢出牛源性成分，另4份樣品未檢出牛源性成分。應(yīng)用本方法進(jìn)行定量分析，6份檢出牛源性成分的樣品，其中有5份樣品牛肉含量約100%，另1份樣品含量約為40%。而普通PCR方法凝膠電泳條帶亮度和清晰度基本一致，無(wú)法區(qū)分樣品牛源性成分含量。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖8，普通PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖7　牛源性成分熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系

圖8　市售商品熒光定量PCR檢測(cè)

圖9　市商樣品普通PCR檢測(cè)

3　討論

動(dòng)物產(chǎn)品的質(zhì)量安全涉及畜牧業(yè)健康發(fā)展、公共衛(wèi)生、宗教信仰、進(jìn)出口貿(mào)易等諸多領(lǐng)域。傳統(tǒng)的感官檢驗(yàn)和免疫學(xué)方法僅能鑒別生鮮肉的種屬。肉制品經(jīng)加工后，因其感官性狀、蛋白質(zhì)成分和其他免疫原性物質(zhì)被破壞而難以鑒別。DNA比蛋白質(zhì)的耐熱性強(qiáng)，高溫處理過(guò)的食品中仍能提取出DNA。有資料表明，肉制品經(jīng)過(guò)加工后，即使溫度達(dá)到141℃，也有足夠的DNA可通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)到，所以對(duì)于經(jīng)過(guò)加工的食物仍具有較強(qiáng)的鑒別能力[2-3]。本次建立的熒光PCR方法擴(kuò)增曲線具有典型的“S”型，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性較好，混合肉粉中牛源性成分的熒光PCR方法最低檢出限為10-5（即0.001%），高于國(guó)標(biāo)法最低檢出限（0.1%）100倍。這與相關(guān)報(bào)道一致，說(shuō)明所設(shè)計(jì)的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件較好[4-6]。

本研究主要針對(duì)國(guó)內(nèi)消費(fèi)量較高且價(jià)格昂貴的牛肉作為研究對(duì)象，通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物和探針，建立定性及相對(duì)定量檢測(cè)體系，將構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的Ct值分別代入公式，得出樣品中牛肉含量，以達(dá)到甄別惡意造假和摻假的目的[7]。構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線和日常檢測(cè)樣品的所用方法和實(shí)驗(yàn)條件必須完全相同。標(biāo)準(zhǔn)曲線建立后可供多次使用，更改DNA提取方法、更換熒光PCR反應(yīng)試劑，更新熒光PCR儀或儀器關(guān)鍵配件，必須重新制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。也可通過(guò)PCR儀自帶軟件設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)分析各樣品計(jì)算濃度。在線性范圍1%～100%內(nèi)對(duì)6個(gè)不同濃度的模擬樣品進(jìn)行定量檢測(cè)，兩種分析方法的定量結(jié)果均與實(shí)際結(jié)果相近，證實(shí)該定量體系可以用來(lái)檢測(cè)牛肉粉的含量。

應(yīng)用Taqman熒光PCR檢測(cè)方法對(duì)抽檢的10份標(biāo)稱(chēng)牛肉的制品進(jìn)行牛源性成分定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)5份有摻假造假現(xiàn)象。經(jīng)使用本實(shí)驗(yàn)室脊椎動(dòng)物通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序，確定其種屬，其中4份含有豬源性成分，1份含有鴨源性成分，說(shuō)明市場(chǎng)上確實(shí)存在以低價(jià)肉類(lèi)加工而成的假牛肉。

本研究建立的牛源性成分Taqman熒光 PCR檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)畜肉食品中含有的牛源性成分及其含量，能夠?yàn)橘|(zhì)檢部門(mén)打擊不法商販、維護(hù)消費(fèi)者合法利益提供有力的科學(xué)依據(jù)。

[1] 王穎，史艷宇，劉金華，等. 熒光定量PCR方法檢測(cè)畜肉食品中豬源性成分[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2013，4（5）：1529-1534.

[2] 馮秀燕，董紅霞，魏秀蓮，等. 動(dòng)物源性飼料中牛源和羊源性成分的檢測(cè)方法[J]. 飼料研究，2006（11）：52-54.

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[4] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.飼料中牛羊源性成分的定性檢測(cè)定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法：GB/T 20190—2006[S] . 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006.

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[7] 于雷，姜艷彬，王海，等. 熒光定量PCR法的優(yōu)化及其在牛羊源性成分檢測(cè)中的應(yīng)用研究[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)雜志，2009，45（24）：51-54.

（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Detection of Bovine-derived Materials in Meat Products by Real-time Fluorescent PCR with TaqMan Probe and Its Quantitative Research

Sha Caihua，Wang Wenhui，Huang Haichao，Liao Xiuyun，Yang Su
（Zhuhai Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhuhai，Guangdong519000）

According to the conserved sequence of the gene in bovine mitochondria，the specific primers and probes were designed，a real-time fluorescent PCR with TaqMan probe for detecting bovine-derived materials existing in meat products was developed. Then its specificity，sensitivity and stability were evaluated. Through the simulated concentration standard curve，the relative quantitative detection of bovine-derived materials was conducted. Results showed that this method had the characteristics of strong specificity and high sensitivity，by which the lowest detection limit was 0.001%. As a summary，the established method was suitable for rapid detection of bovine-derived materials and content in meat products.

bovine-derived materials；mitochondria；real-time fluorescent PCR with TaqMan probe

TS251.5

A

1005-944X（2016）12-0089-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.12.024

珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目（ZH2014-21）

汪文輝