牛源性成分LAMP檢測(cè)方法的建立

徐淑菲，孔繁德，苗　麗，蔡振鴻，林振基，趙　冉（. 廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建廈門　606；. 河南出入境檢驗(yàn)檢疫局，河南鄭州　5000；. 廈門市思明區(qū)市政管理中心，福建廈門　600；. 廈門市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)測(cè)試中心，福建廈門　6009）

牛源性成分LAMP檢測(cè)方法的建立

徐淑菲1，孔繁德1，苗麗2，蔡振鴻3，林振基1，趙冉4
（1. 廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建廈門361026；2. 河南出入境檢驗(yàn)檢疫局，河南鄭州450003；3. 廈門市思明區(qū)市政管理中心，福建廈門361010；4. 廈門市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)測(cè)試中心，福建廈門361009）

根據(jù)牛cytB基因設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，運(yùn)用GenieⅡ等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)，以環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）熒光檢測(cè)方法為基礎(chǔ)，建立了牛源性成分LAMP檢測(cè)方法，并對(duì)該方法進(jìn)行了反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明：該方法操作簡(jiǎn)單、特異性好；靈敏度比普通PCR方法高100倍，達(dá)到5.408×10-2μg/μL；反應(yīng)時(shí)間短，最快的10分鐘內(nèi)即可完成反應(yīng)。

牛源性成分；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法；特異性引物；等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)

為有效防止動(dòng)物疫病通過進(jìn)入食物鏈發(fā)生傳播，2000年歐盟禁止生產(chǎn)和使用動(dòng)物源性飼料。我國(guó)也先后頒布了《關(guān)于禁止用反芻動(dòng)物源性飼料飼喂反芻動(dòng)物的通知》《關(guān)于加強(qiáng)肉骨粉等動(dòng)物性飼料產(chǎn)品管理的通知》和《動(dòng)物源性飼料產(chǎn)品安全衛(wèi)生管理辦法》[1-5]。市場(chǎng)上的牛肉制品，經(jīng)常出現(xiàn)摻雜豬肉等其他便宜的肉類。如何檢出牛源性成分關(guān)系著動(dòng)物、人類生命安全及社會(huì)的安定團(tuán)結(jié)，如何檢出及如何提高檢出率，將可能存在的風(fēng)險(xiǎn)降至最低，是對(duì)檢驗(yàn)人員提出的更高要求。分子生物學(xué)是常用的檢測(cè)方法，PCR、熒光定量PCR、LAMP方法更為常用。與普通PCR、熒光定量PCR想比，LAMP具有效率高、特異性高、肉眼可觀察結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)。

等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)已在疫病檢測(cè)中得到應(yīng)用[6-8]。侯東君等選定了一套可在牛羊肉中特異并靈敏地檢測(cè)出摻雜肉成分的引物對(duì)，以動(dòng)物細(xì)胞色素b基因組為模板，在恒溫63 ℃可特異性擴(kuò)增出豬等基因片段而無其他擴(kuò)增片段影響[9]。本文基于等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)，根據(jù)牛線粒體cytB基因，設(shè)計(jì)了3對(duì)引物，建立了檢測(cè)牛源性成分的LAMP方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品采集和處理。本試驗(yàn)所用的豬肉、牛肉、犬血液、雞肉、鴨肉全部是來自實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)項(xiàng)目的樣品；山羊肉、綿羊肉購(gòu)自廈門市市場(chǎng)；鼠肉來自實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物；狐貍?cè)庥珊幽铣鋈刖硻z驗(yàn)檢疫局提供；馬核酸、Takara羊核酸、兔核酸為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.1.2主要試劑和儀器。組織DNA提取試劑盒為L(zhǎng)abServ公司產(chǎn)品；IMM試劑為北京晟泰勃科技有限公司產(chǎn)品；2×Taq PCR MasterMix、100 bp DNA ladder為廈門泰京生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。PCR儀：ABI公司，型號(hào)Veriti 96孔型；等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)：OptiGene公司，型號(hào)Genie II系統(tǒng)；核酸蛋白測(cè)定儀：Eppendorf公司，型號(hào)Biophotometer plus。

1.1.3引物

1.1.3.1LAMP引物。對(duì)不同動(dòng)物的線粒體基因序列進(jìn)行比對(duì)，選擇牛cytB基因作為牛源性成分的檢測(cè)基因（表1）。引物濃度CowFIP和CowBIP均 為20 μmol/L；CowF3、CowB3、CowLoopB和CowloopF均為10 μmol/L。

表1　LAMP引物序列

1.1.3.2PCR引物。根據(jù)《飼料中牛羊源性成分的定性檢測(cè)定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法》（GB/ T 20190—2006）合成引物（表2）。

表2　PCR牛源成分引物序列

1.2方法

1.2.1DNA提取。按照LabServ公司生產(chǎn)的組織DNA提取試劑盒說明書，提取各樣品DNA。

1.2.2LAMP方法的建立及優(yōu)化

1.2.2.1LAMP方法的初建立。取2個(gè)Eppendorf管，反應(yīng)體系25 μL：IMM 15 μL、FIP 2 μL、BIP 2 μL、F3 1 μL、B3 1 μL，第1個(gè)反應(yīng)管加入牛源性成分核酸1 μL，第2個(gè)反應(yīng)管為對(duì)照，加入水1 μL，不足25 μL的用水補(bǔ)足。擴(kuò)增 65 ℃，30 min；退火從98 ℃到80 ℃，0.05 ℃/s。

1.2.2.2內(nèi)外引物工作濃度比的優(yōu)化。取7個(gè)反應(yīng)管，每管反應(yīng)體系25 μL。各管加入IMM 15 μL、F3 1 μL、B3 1 μL、1 μL牛源性成分核酸，然后加入FIP 和BIP。這兩種的量從第1個(gè)反應(yīng)管到第7個(gè)反應(yīng)管依次均為0.5、1、1.5、2、2.5、3和 3.5 μL，各管補(bǔ)充水至25 μL。擴(kuò)增 65 ℃，30 min；退火從98 ℃到80 ℃，0.05 ℃/s。

1.2.2.3引物工作濃度的優(yōu)化。取6個(gè)反應(yīng)管，每管反應(yīng)體系25μL。各管反應(yīng)內(nèi)外引物工作濃度比采用1.2.2.3中的最佳濃度比。各管加入IMM 15 μL、牛源性成分核酸1 μL。然后各管均加入FIP、BIP、F3、B3，第1至7個(gè)反應(yīng)管中依次加入 0.5、0.5、0.25、0.25 μL；1、1、0.5、0.5 μL；1.5、1.5、0.75、0.75 μL；2、2、1、1；2.5、2.5、1.25、1.25 μL和3、3、1.5、1.5 μL。反應(yīng)體系不足25 μL的用水補(bǔ)足。擴(kuò)增 65 ℃，30 min；退火從98 ℃到80 ℃，0.05 ℃/s。

1.2.2.4LoopF、LoopB的優(yōu)化結(jié)果。取4個(gè)反應(yīng)管，每管反應(yīng)體系25 μL。各管加入IMM 15 μL、牛源性成分核酸1 μL、FIP 1.5 μL、BIP 1.5 μL、F3 0.75 μL、B3 0.75 μL。然后加入LoopF和LoopB，第1～4管依次加入1.5、1.5 μL；1、1 μL；0.5、0.5 μL和0、0 μL；第5個(gè)反應(yīng)管以水代替牛源性成分核酸作為空白對(duì)照，反應(yīng)體系不足25μL的用水補(bǔ)足。擴(kuò)增 65 ℃，30 min；退火從98 ℃到80 ℃，0.05 ℃/s。

1.2.2.5反應(yīng)條件優(yōu)化。取8個(gè)反應(yīng)管，每管反應(yīng)體系25 μL。各管分別加入IMM 15 μL、牛源性成分核酸1 μL、FIP 1.5 μL、BIP 1.5 μL、F3 0.75 μL、B3 0.75 μL，補(bǔ)充水至25 μL。第1～8管擴(kuò)增溫度分別為59、60、61、62、63、64、65和66 ℃，時(shí)間30 min；退火從98 ℃到80 ℃，0.05 ℃/s。

1.2.2.6敏感性試驗(yàn)。將牛源性成分核酸10倍連續(xù)梯度稀釋，稀釋倍數(shù)依次為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5。取5個(gè)反應(yīng)管，每管反應(yīng)體系25 μL。各管加入IMM 15 μL、FIP 1.5 μL、BIP 1.5 μL、F3 0.75 μL、B3 0.75 μL，第1～5管依次加入10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍稀釋的牛源性成分核酸1 μL，牛源性成分核酸終濃度分別為5.408、5.408×10-1、5.408×10-2、5.408×10-3和5.408×10-4μg/μL，補(bǔ)充水至25 μL。擴(kuò)增 65 ℃，30 min；退火從98 ℃到80 ℃，0.05 ℃/s。

1.2.2.7特異性試驗(yàn)。取15個(gè)反應(yīng)管，每管反應(yīng)體系25 μL。各管加入IMM 15 μL、FIP 1.5 μL、BIP 1.5 μL、F3 0.75 μL、B3 0.75 μL，第1～15管依次加入牛源性成分核酸1 μL、豬源性成分核酸1 μL、山羊核酸1 μL、綿羊核酸0.5 μL、鼠核酸1 μL、馬核酸1 μL、狐貍核酸1 μL、H2O 1 μL、牛源性成分核酸1 μL、驢核酸1 μL、狗核酸1 μL、鴨核酸1 μL、雞核酸1 μL、兔核酸1 μL、H2O 1 μL。各管補(bǔ)充水至25 μL。擴(kuò)增 65 ℃，30 min；退火從98 ℃到80 ℃，0.05 ℃/s。

1.2.3PCR方法的敏感性試驗(yàn)。取5個(gè)反應(yīng)管，每管反應(yīng)體系25 μL。各管加入2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL、牛PF 1 μL、牛PR 1 μL，第1～5管依次加入10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍稀釋的牛源性成分核酸1 μL，補(bǔ)充水至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 sec、55 ℃ 30 sec、72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。

2　結(jié)果與分析

2.1LAMP方法的初建立

試驗(yàn)對(duì)照沒有出現(xiàn)擴(kuò)增曲線（圖1），牛源性成分核酸被成功擴(kuò)增并被儀器檢測(cè)到熒光信號(hào)-S型擴(kuò)增曲線，檢測(cè)牛源性成分的LAMP方法初步建立。

圖1　LAMP方法的初建立擴(kuò)增曲線

2.2LAMP方法的優(yōu)化

2.2.1內(nèi)外引物工作濃度比的優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果如圖2、表3所示。第1～7個(gè)反應(yīng)均出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線，對(duì)應(yīng)的Ct值（mm:ss）分別為24:30、17:30、15:15、14:45、14:30、15:00、15:00，對(duì)應(yīng)的Tm值分別為84.2、85.2、84.6、84.6、84.4、84.4和84.3 ℃。依據(jù)擴(kuò)增曲線結(jié)合Ct值，判定本試驗(yàn)最佳反應(yīng)為第4、第5管，最佳內(nèi)外引物（FIP、BIP為內(nèi)引物，F(xiàn)3、B3為外引物）工作濃度比為4:1或5:1，考慮到經(jīng)濟(jì)因素，在后續(xù)反應(yīng)中均采用4:1的比例。產(chǎn)物溶解曲線分析（Tm值）最大值與最小值差1℃，認(rèn)為是同一種成分，進(jìn)一步確認(rèn)和鑒定了本試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

圖2　內(nèi)外引物工作濃度比的優(yōu)化

表3　內(nèi)外引物工作濃度比的優(yōu)化

2.2.2引物工作濃度的優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果如圖3、表4所示，均能出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，第1～6個(gè)反應(yīng)的Ct值（mm:ss）分別為24:00、15:45、14:30、15:00、15:00、15:00，對(duì)應(yīng)的Tm值分別為84.2、84.3、84.5、85.4、84.4和84.3 ℃。隨著各引物工作濃度的增加，出現(xiàn)擴(kuò)增曲線的時(shí)間逐漸縮短，第3個(gè)反應(yīng)達(dá)到最短，繼續(xù)增加引物工作濃度，反應(yīng)時(shí)間已無明顯變化，達(dá)到平臺(tái)期。依據(jù)擴(kuò)增曲線結(jié)合Ct值，判定第3～6個(gè)反應(yīng)較好，第3個(gè)反應(yīng)引物用量最少、最經(jīng)濟(jì)，因此FIP、BIP、F3和B3的最佳工作濃度分別為1.6、1.6、0.4和0.4 μmol/L。產(chǎn)物溶解曲線分析（Tm值）最大與最小值差0.3 ℃，認(rèn)為是同一種成分。

圖3　引物工作濃度的優(yōu)化

表4　引物工作濃度的優(yōu)化結(jié)果

2.2.3LoopF、LoopB的優(yōu)化結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果如圖4、表5所示，均能出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，第1～4個(gè)反應(yīng)的Ct值（mm:ss）分別為8:00、8:00、8:45、14:45，Tm值 分 別 為84.4、84.3、84.6和84.6 ℃。當(dāng)加入LoopF、LoopB后，大大加快了LAMP反應(yīng)速度，隨著LoopF、LoopB濃度的增加，LAMP反應(yīng)速度減弱。結(jié)合擴(kuò)增曲線和Ct值，判定最佳反應(yīng)為第2管，LoopF、LoopB最佳反應(yīng)濃度均為0.4 μmol/L。產(chǎn)物溶解曲線分析（Tm值）最大值與最小值差0.3 ℃，認(rèn)為是同一種成分。

圖4　LoopF、LoopB的優(yōu)化

表5　LoopF、LoopB的優(yōu)化

2.2.4反應(yīng)條件優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果如圖5、表6所示。各反應(yīng)均能出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，第1～8個(gè)反應(yīng)的Ct值（mm:ss）分別為16:45、16:15、16:15、14:30、13:30、12:30、12:30、12:30，Tm值分別為84.4、84.3、84.5、84.5、84.7、84.3、84.4和84.5 ℃。隨著等溫?cái)U(kuò)增溫度的升高，擴(kuò)增曲線出現(xiàn)的時(shí)間逐漸縮短，64 ℃達(dá)到平臺(tái)期。擴(kuò)增曲線結(jié)合Ct值，綜合判定第6～8管的反應(yīng)溫度均優(yōu)于其他反應(yīng)溫度，均可采用。LAMP常用的反應(yīng)溫度為65 ℃，因此選擇65 ℃為最佳反應(yīng)溫度。產(chǎn)物溶解曲線分析（Tm值）最大與最小值差0.4 ℃，認(rèn)為是同一種成分。

圖5　反應(yīng)條件優(yōu)化

表6　反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.IMM 15 μL、FIP 1.5 μL、BIP 1.5 μL、F3 0.75 μL、B3 0.75 μL，模板1 μL，水4.5 μL。擴(kuò)增 65 ℃，30 min；退火從98 ℃到80 ℃，0.05 ℃/s。反應(yīng)體系25 μL：IMM 15 μL、FIP 1.5 μL、BIP 1.5 μL、F3 0.75 μL、B3 0.75 μL、LoopF 1 μL、LoopB 1 μL，模板1 μL，水2.5 μL。擴(kuò)增 65 ℃，20 min；退火從98 ℃到80 ℃，0.05 ℃/s。反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)容易出現(xiàn)假陽性。

2.3靈敏度分析

試驗(yàn)結(jié)果如圖6、表7所示。LAMP反應(yīng)均能出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，第1～3管的反應(yīng)Ct值（mm:ss）分別為15:45、19:45、23:30，Tm值分別為84.3、84.2和84.4 ℃。第4、5管30 min內(nèi)無Ct值。LAMP方法檢測(cè)牛源性成分最低限量為5.408×10-2μg/μL。PCR反應(yīng)只有第1管反應(yīng)出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，檢測(cè)牛源性成分最低限量為5.408 μg/μL。LAMP反應(yīng)比PCR反應(yīng)靈敏度高100倍。

圖6　靈敏度試驗(yàn)

表7　靈敏度試驗(yàn)

2.4特異性分析

試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。只有牛源性成分核酸出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，空白對(duì)照、其余動(dòng)物成分核酸均無擴(kuò)增曲線，表明本試驗(yàn)具有特異性。

圖7　特異性分析

3　討論

等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)是一套開放式系統(tǒng)，以IAT（核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)）為基礎(chǔ)，結(jié)合熒光檢測(cè)技術(shù)，在恒溫條件下，通過添加雙鏈結(jié)合熒光染料，實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)U(kuò)增過程，快速完成核酸擴(kuò)增，通過實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線和產(chǎn)物溶解曲線判定陰陽性并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，無需開蓋或其他擴(kuò)增后處理。

隨著人口的增長(zhǎng)，食物緊缺等問題的出現(xiàn)，有科學(xué)家試圖在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)出牛肉或牛奶，代替用動(dòng)物生產(chǎn)，未來的食品可能更加人工化。2013年美國(guó)推出的試管漢堡就已經(jīng)將政府應(yīng)如何規(guī)范新興的細(xì)胞農(nóng)業(yè)領(lǐng)域這一問題放在了聚光燈下，這種試管漢堡使用生物技術(shù)替代了動(dòng)物生產(chǎn)的肉、牛奶和蛋清。

到目前為止，雖然這些合成食品還未進(jìn)入市場(chǎng)，但在美國(guó)和其他地方的少數(shù)新興公司正在努力擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模。在加利福尼亞舊金山灣地區(qū)Memphis Meats的企業(yè)家希望在五年內(nèi)超市的貨架上能出現(xiàn)他們生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)肉丸、熱狗和香腸；Perfect Day公司則希望2017年底能把人造牛奶制品上市。這個(gè)領(lǐng)域存在的一個(gè)未知因素是仍然不清楚政府監(jiān)管機(jī)構(gòu)如何監(jiān)管、檢驗(yàn)檢測(cè)這類新食品，這對(duì)實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)檢測(cè)提出了新的挑戰(zhàn)。

LAMP方法已被廣泛應(yīng)用于腫瘤篩選、植物病毒檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)、動(dòng)物胚胎性別鑒定、水生陸生動(dòng)物的細(xì)菌性及病毒性疫病檢測(cè)等[10]。GenieⅡ是開放的檢測(cè)平臺(tái)，應(yīng)用“等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)”原理，結(jié)合熒光檢測(cè)技術(shù)，提高了檢測(cè)速度，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，為核酸檢測(cè)提供了完整的解決方案。

本文建立的基于等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)牛源性成分的LAMP方法，除了有普通LAMP方法的特點(diǎn)外，還有以下優(yōu)點(diǎn)：①反應(yīng)時(shí)間更短，無加速引物L(fēng)oopF、LoopB時(shí)，30 min內(nèi)即可完成反應(yīng)；加入加速引物L(fēng)oopF、LoopB時(shí)20 min內(nèi)即可完成反應(yīng)；②可進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)擴(kuò)增曲線及產(chǎn)物溶解曲線鑒定，無加速引物L(fēng)oopF、LoopB時(shí)，12～20 min內(nèi)即可進(jìn)行實(shí)時(shí)初判；加入加速引物L(fēng)oopF、LoopB時(shí)，10 min內(nèi)即可進(jìn)行實(shí)時(shí)初判；③可根據(jù)產(chǎn)物溶解曲線（Tm）分析進(jìn)一步確認(rèn)和鑒定實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，只要Tm不偏離太多（通常1 ℃以內(nèi)），可認(rèn)為方法準(zhǔn)確；④反應(yīng)完畢，不需二次打開反應(yīng)管，不需染色、電泳等后續(xù)處理，可大大減少污染的概率，提高準(zhǔn)確性；⑤靈敏度比PCR高100倍。

本文建立的LAMP方法，彌補(bǔ)了PCR等方法的不足，更適用于在基層應(yīng)用和推廣。本方法相對(duì)于傳統(tǒng)的LAMP方法，有了改進(jìn)，克服了感官判定的不確定因素，使得結(jié)果更加準(zhǔn)確可信。

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Establishment of the Loop-mediated Isothermal Amplification for the Detection of Bovine-derived Materials

Xu Shufei1，Kong Fande1，Miao Li2，Cai Zhenhong3，Lin Zhenji1，Zhao Ran4
（1. Xiamen Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Xiamen，F(xiàn)ujian361026；2. Henan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhengzhou，Henan450003；3. Siming District Municipal Administration Center，Xiamen，F(xiàn)ujian361010；4. Xiamen Agricultural Product Quality and Safety Test Center，Xiamen，F(xiàn)ujian361009）

In this article，three pairs of specific primers were designed according to the bovine-derived cytB gene. Then based on the loop-mediated isothermal amplification（LAMP）fluorescence detection，a LAMP assay for detecting bovine-derived materials was established by using GenieⅡ real-time fluorescence isothermal amplification detection system. Subsequently the optimizations of the reaction system and conditions were conducted. Results showed that the method was simple to operate and presented good specificity. Meanwhile，compared with the normal level of general PCR，its sensitivity was 100-fold higher，and its detection limit was found to reach 5.408×10-2μg/μL. The method also showed short reaction period，by which the fastest total reaction time could be less than 10 minutes.

bovine-derived materials；LAMP；specific primer；real-time fluorescence isothermal amplification detection system

1005-944X（2016）12-0094-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.12.025

國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014IK089）；福建省科技計(jì)劃引導(dǎo)項(xiàng)目（2015Y0031）；廈門市科技計(jì)劃項(xiàng)目（3502Z20154079）