通心絡(luò)對(duì)壓力超負(fù)荷大鼠心肌HO-1mRNA表達(dá)及心功能的影響

楊愛(ài)萍，胡傳國(guó)

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830001)

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通心絡(luò)對(duì)壓力超負(fù)荷大鼠心肌HO-1mRNA表達(dá)及心功能的影響

楊愛(ài)萍，胡傳國(guó)

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830001)

目的 觀察通心絡(luò)對(duì)壓力超負(fù)荷大鼠心肌組織中血紅素加氧酶-1(HO-1)mRNA基因表達(dá)的影響，并探討其對(duì)心功能的保護(hù)作用。方法 選擇40只SD大鼠，隨機(jī)抽取8只作為假手術(shù)組，其余32只大鼠采用腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)制備壓力超負(fù)荷模型，將術(shù)后存活的24只大鼠再隨機(jī)分成模型組、通心絡(luò)組及通心絡(luò)+HO-1抑制劑組各8只。通心絡(luò)組給予通心絡(luò)超微粉水溶液1 g/(kg·d)灌胃，假手術(shù)組、模型組均給予等容積的生理鹽水灌胃，通心絡(luò)+HO-1抑制劑組給予通心絡(luò)超微粉水溶液1 g/(kg·d)灌胃同時(shí)給予ZnPP注射劑1 mg/(kg·d)腹腔注射。各組每日9:00干預(yù)1次，連續(xù)干預(yù)4周后行心臟超聲檢測(cè)室間隔厚度(IVST)、左室后壁厚度(LVPWT)、左室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末內(nèi)徑(LVESD) 和左室質(zhì)量指數(shù) (LVMI)。8周后檢測(cè)心肌組織HO-1mRNA表達(dá)水平，并在同時(shí)間段做心肌組織病理學(xué)HE染色。結(jié)果 模型組、通心絡(luò)組及通心絡(luò)+HO-1抑制劑組IVST、LVPWT、LVEDD、LVESD及LVMI均顯著高于假手術(shù)組(P均<0.05)，通心絡(luò)組上述各指標(biāo)均明顯低于模型組和通心絡(luò)+HO-1抑制劑組(P均<0.05)。通心絡(luò)組HO-1mRNA表達(dá)水平明顯高于其他3組(P均<0.05)；HE染色顯示，通心絡(luò)組和通心絡(luò)+ HO-1抑制劑組心肌組織形態(tài)學(xué)均較模型組有不同程度的改善，其中通心絡(luò)組改善更為顯著。結(jié)論 通心絡(luò)可以抑制心肌纖維化，減緩心室重構(gòu)，保護(hù)心肌組織，此作用可能與通心絡(luò)誘導(dǎo)HO-1過(guò)表達(dá)有關(guān)。

通心絡(luò)；血紅素加氧酶-1；心室重構(gòu)；氧化應(yīng)激；心功能

通心絡(luò)為傳統(tǒng)中藥配伍的中成藥，具有改善血管內(nèi)皮功能、清除自由基、抗動(dòng)脈硬化、抗氧化、抑制膠原纖維產(chǎn)生、促進(jìn)纖維蛋白降解、減輕心肌缺血再灌注損傷、抑制血小板凝聚和血栓形成等多種作用[1-3]。血紅素加氧酶(HO)作為血紅素分解代謝的關(guān)鍵酶，HO-1作為其誘導(dǎo)型酶，具有明顯的保護(hù)器官和組織等作用[4]，通心絡(luò)是否可以通過(guò)誘導(dǎo)HO-1的過(guò)表達(dá)起到保護(hù)細(xì)胞的作用，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬通過(guò)建立大鼠壓力超負(fù)荷模型，探討通心絡(luò)和HO-1表達(dá)之間的關(guān)系及通心絡(luò)對(duì)壓力超負(fù)荷大鼠心功能的影響，以期為延緩心室重構(gòu)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 40只健康清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量220～220 g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物房溫度20～25 ℃，濕度40%～60%，光照時(shí)間為8：00—20：00，保持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)通風(fēng)良好。飼料、墊料高壓滅菌處理，常規(guī)給予飼料喂養(yǎng)，保持所有大鼠自由進(jìn)食、飲水。

1.1.2 試劑與藥品 TRIzol購(gòu)自美國(guó)Promega公司；cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；PCR引物由南京金斯瑞科技有限公司合成；SYBR熒光染料試劑購(gòu)自日本 TOYOBO公司；Agarose購(gòu)自西班牙Biowest公司；氯仿、異丙醇、10%水合氯醛均購(gòu)自南京化學(xué)試劑有限公司；通心絡(luò)超微粉(批號(hào)：20050530)購(gòu)自河北以嶺藥業(yè)股份有限公司；鋅原卟啉IX(ZnPPIX)購(gòu)自美國(guó) Sigma公司；彩色多普勒超聲儀及探頭為GE公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 壓力超負(fù)荷大鼠模型制備 大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法給SD大鼠編號(hào)，隨機(jī)選取8只作為假手術(shù)組，其余32只作為手術(shù)組。手術(shù)組大鼠術(shù)前禁食12 h，先將大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)行腹腔注射麻醉，后采用腹主動(dòng)脈縮窄法制備壓力超負(fù)荷模型，術(shù)后6 h恢復(fù)飲食。術(shù)后3 d內(nèi)給予青霉素4 000 IU/kg腹腔注射預(yù)防感染。假手術(shù)組除不結(jié)扎腹主動(dòng)脈外，余處理同手術(shù)組。術(shù)后3 d，檢測(cè)尾動(dòng)脈血壓，血壓較前升高20%為造模成功，連續(xù)觀察4周。

1.2.2 分組及給藥 造模4周后，手術(shù)組大鼠共死亡8只，主要死因?yàn)榧毙孕牧λソ?，假手術(shù)組8只全部存活。將手術(shù)組術(shù)后存活的24只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、通心絡(luò)組及通心絡(luò)+HO-1抑制劑組各8只。通心絡(luò)組給予通心絡(luò)超微粉水溶液1 g/(kg·d)灌胃，假手術(shù)組、模型組均給予等容積的生理鹽水灌胃，通心絡(luò)+HO-1抑制劑組給予通心絡(luò)超微粉水溶液1 g/(kg·d)灌胃同時(shí)給予ZnPP注射劑1 mg/(kg·d)腹腔注射。各組每日9:00干預(yù)1次，連續(xù)干預(yù)4周。觀察大鼠的飲食、活動(dòng)、精神、毛色及水腫等情況，每周稱取體質(zhì)量1～2次。

1.2.3 心臟超聲檢測(cè) 連續(xù)干預(yù)4周后，大鼠禁食8 h，予10%水合氯醛溶液1 mL/kg 腹腔注射麻醉，胸部備皮、消毒，仰臥位固定， 四肢連心電監(jiān)護(hù)電極。采用彩色多普勒超聲儀(9 MHz線陣式探頭)檢測(cè)室間隔厚度(IVST)、左室后壁厚度(LVPWT)、左室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末內(nèi)徑(LVESD) 和左室質(zhì)量指數(shù) (LVMI)。

1.2.4 HO-1mRNA的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 干預(yù)8周后處死各組大鼠，取心肌組織40 mg加入1 mL TRIzol液，按Trizol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行抽提總RNA，測(cè)定RNA濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，以Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)心肌組織中HO-1mRNA的表達(dá)水平，總的反應(yīng)體系20 μL：2X Real time PCR Master Mix(SYBR Green)10 μL、模板(cDNA稀釋10倍)1 μL、引物MIX(F/R各為10 μmol/L)2 μL、0.1% DEPC水7 μL。在PCR反應(yīng)體系中，一個(gè)樣本基因做3個(gè)復(fù)孔。目的基因大鼠HO-1正義引物為5’-GTAAAGCGTCTCCACGAGGT-3’，反義引物為5’-ACCCAGGTAGCGGGTATATG-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為75 bp。GAPDH正義引物為5’-GGCCTTCCGTGTTCCTACC-3’，反義引物為5’-CGCCTGCTTCACCACCTTC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為103 bp。細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)水平以相應(yīng)標(biāo)本內(nèi)GAPDHmRNA為基準(zhǔn)，采用2-ΔΔCT方法計(jì)算，并將對(duì)照組標(biāo)本內(nèi)目的基因表達(dá)水平設(shè)為1，對(duì)其他組標(biāo)本內(nèi)目的基因表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.5 心臟病理組織學(xué)檢測(cè) 將左室心肌標(biāo)本于10%福爾馬林溶液中固定24 h后，常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋，沿左室長(zhǎng)軸線每隔1 mm橫斷面切取數(shù)張厚約4 μm的組織切片，行HE染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察各組心肌細(xì)胞形態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1 各組心臟超聲檢測(cè)結(jié)果比較 模型組、通心絡(luò)組及通心絡(luò)+HO-1抑制劑組IVST、LVPWT、LVEDD、LVESD及LVMI均顯著高于假手術(shù)組(P均<0.05)，通心絡(luò)組上述各指標(biāo)均明顯低于模型組和通心絡(luò)+HO-1抑制劑組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 各組心肌組織中HO-1mRNA表達(dá)情況比較 假手術(shù)組心肌組織中HO-1mRNA表達(dá)量為1.01±0.03，模型組為5.97±0.39，通心絡(luò)組為8.34±0.33，通心絡(luò)+HO-1抑制劑組為2.49±0.06。通心絡(luò)組的HO-1mRNA表達(dá)量明顯高于其他3組(P均<0.05)。

表1 各組心臟超聲檢測(cè)結(jié)果比較

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與通心絡(luò)組比較，P<0.05。

2.3 各組大鼠心臟組織結(jié)構(gòu)比較 光鏡下發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠心肌纖維排列整齊，橫紋明顯，胞核結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)壞死灶，心肌間質(zhì)及微血管正常；模型組心肌纖維明顯增粗且排列紊亂，部分胞核固縮，并有局灶性、片狀壞死灶和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管周圍及間質(zhì)有膠原纖維沉積；通心絡(luò)組和通心絡(luò)+HO-1抑制劑組心肌組織形態(tài)學(xué)均有不同程度的改善，而通心絡(luò)組改善更為明顯。見(jiàn)圖1～4。

圖1 假手術(shù)組大鼠心肌組織HE染色表現(xiàn)(×200)

圖2 模型組大鼠心肌組織HE染色表現(xiàn)(×200)

圖3 通心絡(luò)組大鼠心肌組織HE染色表現(xiàn)(×200)

3 討 論

心室重構(gòu)是指心肌對(duì)容量或壓力超負(fù)荷引起的代償性、適應(yīng)性改變，包括心肌細(xì)胞肥大、間質(zhì)纖維化和細(xì)胞凋亡等，逐步進(jìn)展為心力衰竭[5]。心室重構(gòu)的發(fā)生不僅表現(xiàn)為幾何形態(tài)學(xué)改變，也體現(xiàn)在細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞外基質(zhì)及基因表達(dá)改變上，是許多嚴(yán)重心血管疾病末期的共同通路[6]。而氧化應(yīng)激在心室重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其中活性氧(ROS)可以通過(guò)多種途徑促進(jìn)心肌肥厚、間質(zhì)纖維化和心肌細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致心室重構(gòu)[7]。

圖4 通心絡(luò)+HO-1抑制劑組大鼠心肌組織HE染色表現(xiàn)(×200)

HO系統(tǒng)是血紅蛋白降解的起始酶和最重要的限速酶，與心血管疾病有著密切的聯(lián)系[8]。它主要有3種同工酶，即HO-1、HO-2和HO-3，其中以誘導(dǎo)型酶HO-1作用最為顯著。HO-1位于人染色體22q12，相對(duì)分子量為32 000，可以通過(guò)轉(zhuǎn)化血紅素產(chǎn)生一氧化碳(CO)、鐵離子和膽綠素[9]，主要分布于單核細(xì)胞胞質(zhì)微粒體，在網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞含量豐富的組織如肝、脾等也有少量分布[10]。生理?xiàng)l件下HO-1表達(dá)水平很低，但可被多種有害刺激所誘導(dǎo)，包括氧化應(yīng)激、炎癥、熱休克、重金屬、高溫以及內(nèi)毒素等[11]。Zeng等[12]研究發(fā)現(xiàn)HO-1在間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)過(guò)表達(dá)影響血管生成和改善心肌梗死后心肌功能，與對(duì)照組相比，HO-1-MSCs組凋亡細(xì)胞明顯減少，左室擴(kuò)張度和纖維化程度均顯著降低，左室前壁厚度更??；超聲心動(dòng)圖進(jìn)一步證實(shí)HO-1可通過(guò)修飾MSCs顯著改善左室重構(gòu)。Allwood等[13]研究證實(shí)，在急性壓力情況下HO-1的表達(dá)升高對(duì)細(xì)胞有明確的保護(hù)作用，HO-1酶活性減弱氧化應(yīng)激和炎癥，促進(jìn)新血管形成，并與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展呈負(fù)相關(guān)。Tiwari等[14]研究表明HO-1缺乏與氧化應(yīng)激增加和相關(guān)病理結(jié)果聯(lián)系密切；HO-1基因敲除小鼠隨著慢性缺氧，右心室嚴(yán)重?cái)U(kuò)大；另外，HO-1缺失的胚胎成纖維細(xì)胞更易受氧化刺激增加損傷和死亡，從而證明了HO-1在氧化應(yīng)激中的有益作用。通心絡(luò)由水蛭、土鱉蟲(chóng)、蟬蛻、冰片、人參、全蝎、蜈蚣和赤芍藥等中藥配伍而成，具有通絡(luò)止痛、益氣活血功效，可使脈絡(luò)暢通、氣旺血行，可調(diào)節(jié)血脂，改善心功能，穩(wěn)定斑塊，預(yù)防心血管事件的發(fā)生[15]。

本研究結(jié)果表明，模型組、通心絡(luò)組及通心絡(luò)+HO-1抑制劑組IVST、LVPWT、LVEDD、LVESD及LVMI均顯著高于假手術(shù)組，通心絡(luò)組上述各指標(biāo)均明顯低于模型組和通心絡(luò)+HO-1抑制劑組。通心絡(luò)組HO-1mRNA表達(dá)水平明顯高于其他3組；HE染色顯示，通心絡(luò)組和通心絡(luò)+HO-1抑制劑組心肌組織形態(tài)學(xué)均較模型組有不同程度的改善，其中通心絡(luò)組改善更為顯著。提示通心絡(luò)可以抑制大鼠壓力超負(fù)荷引起的心肌纖維化，減緩心室重構(gòu)，保護(hù)心肌組織，此作用可能與通心絡(luò)誘導(dǎo)HO-1過(guò)表達(dá)有關(guān)。

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Effect of Tongxinluo on expression of myocardial HO-1 mRNA and heart function in the rats with pressure overload

YANG Aiping, HU Chuanguo

(The People’s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumchi 830001, Xinjiang, China)

Objective It is to observe the effect of Tongxinluo (TXL) on heme oxygenase-1 (HO-1) mRNA gene expression in myocardial tissue in the rats with pressure overload, and to investigate its protective effect on cardiac function. Methods 40 SD rats were selected, in which 8 ones were randomly selected as sham operation group, the other 32 rats were prepared abdominal aortic coarctation pressure overload models, the survival rats (n=24) after operation were randomly divided into three groups: model group, TXL group and TXL+HO-1 inhibitor group, each group had 8 rats. TXL group was given TXL superfine aqueous 1 g/(kg·d) orally, sham operation group, model group were given the same volume of normal saline, TXL+HO-1 inhibitor group was given Tongxinluo superfine aqueous 1 g/(kg·d) orally +ZnPP injection 1 mg/(kg·d) by intraperitoneal injection. Each set of daily 9:00 medication once daily for 4 consecutive weeks, interventricular septum thickness (IVST), left ventricular wall thickness (LVPWT), left ventricular end diastolic diameter (LVEDD), left ventricular end systolic inner diameter (LVESD) and left ventricular mass index (LVMI) were detected by cardiac ultrasound. In 8 weeks the expression of HO-1mRNA in myocardial tissue was determined, and at the same time histopathological HE staining was used to observe pathologic change in myocardial tissue. Results Compared with sham operation group, IVST, LVPWT, LVEDD, LVESD and LVMI were significantly increased in model group,TXL group and TXL+HO-1 inhibitor group, and these indexes in TXL group were significantly lower than that in model group and TXL +HO-1 inhibitor group. HO-1mRNA expression level in TXL group was significantly higher than that in the other three groups. HE staining showed that compared with model group, myocardial tissue morphology were improved more or less in TXL group and TXL+HO-1 inhibitor group, and the improvements in TXL group were the most significant. Conclusion TXL can inhibit myocardial fibrosis, slow ventricular remodeling, protect myocardial tissue, these effects may be related with HO-1 overexpression induced by TXL.

Tongxinluo capsule; Heme oxygenase-1; ventricular remodeling; oxidative stress; cardiac function

楊愛(ài)萍，女，副主任醫(yī)師，主要從事各種疾病的物理及康復(fù)治療。

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2012CB518600)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.34.002

R-332

A

1008-8849(2016)34-3765-04

2016-06-01